この作品は、NSERC個々の検出プログラム、NSERC / CIHR共同保健研究プログラム（CHRP）と、NSERC CREATEカナダのアストロバイオロジー·トレーニング·プログラム（CATP）によって資金を供給された。

1。 QD可溶化これは、CdTeのために適切な方法です。類似した方法はそのような有するInP / ZnSを20のCdSe / ZnSを21としての量子ドットの他のタイプで使用することができます。 <ol><li> 15μMの（最初の励起子のピーク時には光学密度= 2.5）でトルエン中膜CdTe量子ドットの溶液を調製します。 </li><li>ガラスバイアルには、この株式の200μLを転送します。プラスチックを使用しないでください！ </li><li> 800μLトルエン、200 mMホウ酸緩衝液（pH 9）、11.5 Mメルカプトプロピオン酸（MPA）の2μLの1 mLを加える。 </li><li>バイアルをキャップ30〜60秒間激しく、それを振る。 </li><li>水溶液と有機溶媒相は、自発的に分離されます。水相は、量子ドットの色になります。トルエン層を避けるために、それを削除し、それを破棄します。その後きれいなバイアルに水相を転送します。 </li><li> 500μL、10000、分子量カットオフの遠心フィルターを用いて4回洗浄/フィルタリングすることにより可溶化された量子ドットを浄化する。フィルタがなければなりません13分3000 xgでスピンした。少なくとも最後の2回洗浄するため、所望の最終バッファーで洗浄する。 </li><li>最終洗浄後、4℃で、所望のpHと店舗で50 mMホウ酸緩衝液で洗浄した量子ドットを中断彼らは1〜2週間は安定になります。 </li><li>公開され、式22に基づいて濃度を推定するための吸光度および発光スペクトルを測定します。 </li></ol> 代表的な結果：図1は、UVランプの照明の下で膜CdTe量子ドットの画像を示しており、水可溶化前後の発光スペクトルは、キャップの交換からごくわずかの変化を示す。サイズの値は、電子顕微鏡で測定したコアの直径です。 2。抗生物質にQDコンジュゲートプロトコルのこの部分は、ほとんどの商用量子ドット、金属粒子、さらに19を含む任意の負に帯電した水可溶化ナノ粒子にも適用可能である。 <ol><li>すべての分子が動作するようEITHERの負に帯電した可溶化された量子ドットに自己組み立て、またはそのような第一級アミンとして、結合させることができる反応性基を持っています。この例では、正に荷電共役試薬を必要とせずに自己組み立てされたポリミキシンB（PMB）を使用しています。 60μMでH 2 OでPMBを溶かす。 （選択された抗生物質がH 2 Oに溶解しない場合は、0.1から1 mMの濃度でDMSOまたはエタノールに溶解）。これは、10x溶液（H 2 O）、または100倍溶液（溶媒中）になります。 </li><li>あなたは細菌の毒性実験のために必要になりますどのくらいのQDソリューションを計算します。 4重にウェルあたり0.3 mLを96ウェルプレートの場合は、200 nMの結合体の0.5mLが必要になります。 50mMのホウ酸緩衝液に1μM量子ドットの100μLを含む二つのチューブを準備します。 </li><li>第一級アミンに結合する場合は、1 -エチル-3 - [3 -ジメチルアミノプロピル] H 2 Oのカルボジイミド塩酸塩（EDC）の19 mg / mLの（100 mM）の溶液を調製溶液中でEDCは安定していません、すぐに使用し、残りを捨てる。 </li><li> 10倍の抗生物質溶液（H 2 O）または共役チューブに100倍溶液（溶媒中）の5μLの50μLを追加します。 PMBの場合：30:1のモル比でCdTeの接合、60μMのPMBの50μLを追加します。 H 2 OまたはQDのみ制御管に溶媒を追加します。 </li><li>必要に応じて、コンジュゲートチューブにEDCストック溶液の1μLを追加します。 </li><li>適切な緩衝液（; Trisなどのアミン含有しないバッファを、彼らはEDCを阻害するとして、ホウ酸緩衝液またはPBS）で0.5mLの共役ボリュームを起動します。 </li><li> 1時間nutatorやロッカーの上にアルミニウム箔と場所で光からシールドチューブ。凝集が発生した場合は、抗生物質の低濃度との結合を繰り返します。粒子が凝集しないまで濃度を上に滴定する。 </li><li>適切なフィルタを通過させることによって複合体を洗浄します。万の分子量カットオフは、ほとんどの抗生物質ではなく、タンパク質または抗体で動作します。 </li&gt; <li>吸光度または蛍光分光法、ゲル電気泳動、またはフーリエ変換赤外分光（FTIR）：分子に応じて、異なる方法がQD当たりの抗生物質の分子数を推定するために使用することができます。 </li></ol> 代表的な結果は、この例では、PMBの接合は、量子ドットの発光スペクトルの変化によって特徴付けられる。 図2は、PMB添加したCdTe量子ドットのスペクトルを示す。 3。 96ウェルスクリーンのために細菌の準備、抗生物質のIC 50の決定これは、適切な媒体18で成長し、ほとんどすべての菌株に適用可能である。録音を続行する必要がある時間の正確な長さは細菌の成長率に依存します。この例では、溶原性培養液（LB）培地中で培養した大腸菌を使用しています 。 <ol><li>適切なQD共役濃度を選択するためには、知っておくことが大切です抗生物質のIC 50単独で量子ドットは有毒である場合、結合させることとします。これは2日接合実験前に開始する必要があります。夕方に、新鮮なコロニーからシード細菌の増殖培地10mLを、適切な滅菌とバイオ技術を使用します。 </li><li>次の日、1〜2時間の実験の前に、増殖培地のほぼ最大量との明確な底96ウェルプレートのウェルの各々を記入してください。細菌培養の1から50μL（濃度が特定の株の成長にどのくらいの速に依存するであろうとあなたのラボで校正する必要があります）で各ウェルにマルチチャンネルピペット、シードを使用します。 </li><li>プレートリーダーの上にプレートを入れて決定される波長（通常は600 nm）で2時間10分ごとに読み込みするように設定します。細菌があまりにも速く密度が高すぎる成長しないように板を監視します。 </li><li>細胞はすべてOD = 0.1から0.15に達すると、プレートリーダーからプレートを削除して、録音を停止します。 </li><li>一人で薬を追加して、一人で量子少なくとも連で異なる濃度。 &quot;暗い&quot;コントロールと点灯するの半分として、板の片面を使用しています。推奨レイアウトは、 図3に示されている。濃度は1非常に小さな細菌を抑制する濃度、およびそれらのすべてを殺すいずれかが含まれてするのに十分広い範囲に及ぶべきである。 </li><li>アルミ箔でプレートの &quot;暗い&quot;側面を保護する。所望の波長でランプに反対側を公開します。我々は、2.4 mWのLED（ 図4）と30〜60分間照射から作られたカスタム96ウェル、440 nmのランプを使用しています。明確な底を持つ黒のプレートは、迷光から未露光の細菌を保護に役立ちます。空の列も公開と非曝露の側面の間で使用される可能性があります。 </li><li>露光した後、プレートリーダー、記録OD 600が成長率に応じて5から12時間、10分ごとにプレートを置く。温度が&lt;32°C、可能であれば文化の乾燥を避けるために保管してください。 </li><li>成長曲線をプロットします。選択した時点で対ログ[濃度]とヒルの式を用いて抗生物質のIC 50を決定します 。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3969/3969eq1.jpg" /> Hはヒル係数である、Y maxは、成長（理想的には台地上の）最高点であり、y minは高原にも理想的には、ゼロ点である。それだけでは量子ドットは、使用濃度で細胞に非常に毒性を示すことはほとんどありませんので、値が決定されることはありません。 代表的な結果。記録期間の終了時に、明確な井戸が完了した細胞死を示しますと、細胞密度の勾配は、薬剤の濃度の増加に沿って表示されます。細菌はS字型成長曲線を（ 図5）を示すべきである。最大の高原の場所は緊張する株から大きく異なり、また、温度に依存します。与えられた時点では、することができます代表として選ば ​​れ、値がとログ[抗生物質] IC 50（ 図5 B）を与えるためにプロットされます。 QD毒性を評価するために、生存とログ[QD]もプロットし、それだけでは量子ドットとの有意な殺菌を達成する（ 図5 C）はまれである可能性があります。 4。抗生物質/量子ドットと96ウェルスクリーンのために細菌の調製<ol><li>正しい滅菌とバイオ技術を使用して、適切な富栄養培地に新鮮なコロニーから実験、文化の種10mLの、前日。それは非常に不安定でない限り、QD-抗生物質複合体は、この日に準備する必要があります。 </li><li>実験の前に1-2時間は、増殖培地のほぼ最大量との明確な底96ウェルプレートのウェルの各々を記入してください。細菌培養の1から50μLを各ウェルにマルチチャンネルピペット、シードを使用します。 </li><li>プレートリーダーの上にプレートを入れて、パート3と同じ波長で2時間10分ごとに読み込みするように設定します。</li><li>細胞はすべてOD = 0.1から0.15に達すると、プレートリーダーからプレートを削除して、録音を停止します。 </li><li>少なくとも四重の異なる濃度でQD結合体を追加します。 &quot;暗い&quot;コントロールと点灯するの半分として、板の片面を使用しています。推奨レイアウトは、 図6に示されている。細菌のみのコントロール·ストリップは、 常に文化の場合と同様の問題に含まれるべきである、温度などの成長条件に影響を与えます。単剤のストリップのみとのみQDのも、彼らが制御板は、以前に行わ一致していることを確認するために含まれるべきである。井戸の残りの部分は、適切な統計ができるようにするためにコンジュゲートに専念しています。 </li><li>アルミ箔でプレートの &quot;暗い&quot;側面を保護する。所望の波長でランプに反対側を公開します。 </li><li>露光した後、プレートリーダー、記録OD 600 5月12日時間は10分ごとにプレートを置く。 &lt;32°C、DRを避けるため、可能であれば温度を保つ文化のYingさん。 </li></ol> 代表的な結果 。量子ドットと抗生物質の組み合わせは、単独で抗生物質よりも毒性が低いかもしれません。同様に有毒な、またはより多くの毒性。これは、成長曲線とIC 50の測定値を用いて定量することができます。 図7は、その抗生物質と同等に有毒なだけで、より有毒である複合体の例コンジュゲートの例を示します。 5。平板計数<ol><li>段階希釈し、コロニーカウントに使用する治療を96ウェルプレートの1以上のウェルを選択してください。 </li><li> PBSまたは生理食塩水（0.9％NaCl）を選択した細菌の各サンプルの希釈を行う。菌液20μLを移し、180μlの生理食塩水で希釈、ピペットチップ、ミックスを変更し、180μLの食塩水に希釈した菌液の20μLを転送します。 6回繰り返します。 </li><li>適切な各希釈し、プレートから10μLを取る<html>固体培地プレート。それは物事を並べるが容易になりますように長方形の料理が好まれるものの1サンプルの全8濃度は、10センチメートルラウンドペトリ皿上に播種することができます。 </li><li>それは15分間のベンチに乾かします。その後16時間のために細菌のための適切な温度でインキュベートする。 </li><li>コロニーをカウントし、コロニー形成単位を計算する（CFU）によると（＃コロニーのx希釈倍率）/ボリュームメッキ= CFU / mLである。 </li></ol> 図8は、例CFUプレートを示しています。 6。代表的な結果<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig1.jpg" /> 図1 CdTeの量子ドット。 （）のCdTe量子ドットのエイトの製剤は、紫外線の杖（365 nm）と点灯。水可溶化前と後の5選択したサイズの（B）の吸光度と発光スペクトル。破線はトルエンのスペクトルで、実線は水である。 files/ftp_upload/3969/3969fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。QD-PMBコンジュゲートのスペクトルとゲル分析。オレンジ色の発光CdTeの量子ドットは、この例を使用しました。量子ドットの他の種類の影響は、各実験のために評価する必要があります。 （A）一般的な吸光度（灰色線）とPMBの結合とPMB 160モル当量を加えた後の排出量（破線）の前に量子ドットの発光スペクトル（黒線）。 PMBの比とQDの発光強度（四角）とピーク波長の位置（三角形）の間（B）の関係。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig3.jpg" /> 図3は 、制御成長板のプレートレイアウトを提案した。 PMBとQD濃度の広い範囲が表されます。プレートの半分（青強調表示）が照射されると、同一の半 ​​分は光から保護されています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig3large.jpg" target="_blank">ここをクリック</a>拡大図を表示します。 <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig4.jpg" /> 図4均一プレート照射用のカスタム96-LEDランプ、外観を披露します。典型的なハンドヘルドUVランプを使用してもよいが、均一にプレート全体をカバーしています。 <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig5.jpg" /> 図5。制御成長板の例の結果。 （A）別の薬物濃度の代表的な細菌の増殖曲線は、0から細胞死を完了します。オープンシンボルが与えられた濃度を持つ唯一のPMBであり、固体のシンボルは照射せずに膜CdTe-PMBであり、半充填のシンボルは、照射による膜CdTe-PMBがあります。照射は、PMB-サンプルのみに影響を及ぼさなかった、これらの曲線は、わかりやすくするために省略されていたので。 QD比：すべてPMB-CdTeのコンジュゲートは30:1 PMBがあります。 （B）200分とログ[PMB]で、成長曲線の値のプロットとは、式にフィットします。 （1）。 CONTに光の影響のためにROLは、曲線は、光照射の30分の抗生物質を使用して行われます。 （C）200分対QD濃度で細菌の生存率は、CdTe量子ドットを用いた。いくつかの毒性は、IC 50値を決定するための露光が、あまりにも少しで見られます。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig5large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig6.jpg" /> 図6は、。共役テストプレートのレイアウトを提案した。プレートの青色でハイライト表示された半分は光にさらされるべきであり、強調表示が解除されている半分は保護されています。 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3969/3969fig6large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 <img alt="図7" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig7.jpg" /> 図7の例共役試験板の結果。 200分での成長曲線の値はPLでしたottedと式に適合します。 （1）。 （A）膜CdTe-PMB複合体は、単独でPMB以上増加した毒性を示しています。 （B）金ナノ粒子のAu-PMB複合体は、単独でPMB上には増加した毒性を示さない。 <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/3969/3969fig8.jpg" /> 図8 CFUプレートの例。E. 96ウェルプレートに播種し、大腸菌を 30分間照射の有無にかかわらずQD-PMBで処理した。その後4時間32°Cでインキュベートした。各細菌サンプルの連続希釈液を食塩水で作られた、10μLの100 X 10 7 X希釈液を寒天プレート上に播種した。プレートを37℃でインキュベートしたCとコロニーが16時間後に計数した。プレートは、指定されたように行に沿って希釈を示しています。列は、次のとおりです。（）0.06μMPMB + 2 nMの膜CdTe、（B）0.12μMPMB + 4nmの膜CdTe（C）0.2μMPMB + 6.7 nMの膜CdTe、（D） 0.06μMPMB + 2 nMで照射し、（E）0.12μMPMB + 4 nMのCdTeの照射、（F）0.2μMPMB + 6.7 nMのCdTeのイルラのCdTeのdiated。

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利害の衝突が宣言されません。

ナノ粒子は、新しい抗微生物剤の創出に有望なアプローチを表しています。成長曲線分析は、成長を阻害細胞から積極的に増殖する細胞を区別する細菌の細胞密度をモニターする方法です。プレートカウントと組み合わせる場合には、複合体の抗生物質の可能性を徹底的に分析が可能になります。 96ウェルフォーマットは、このような露光量として濃度の比較的高いスループットの変動やそ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> コメント（オプション） </td></tr><tr><td>緩衝成分＃1ホウ酸塩</td><td>フィッシャー</td><td>ホウ酸-74から1 </td><td></td></tr><tr><td>緩衝成分第2ホウ酸</td><td> Sigma-Aldrich社</td><td>四ホウ酸ナトリウムB9876 </td><td></td></tr><tr><td> MPA </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> M5801 </td><td></td></tr><tr><td> Vivaspin 500 </td><td> GEヘルスケア</td><td> 28から9322 </td><td>利用可能なさまざまなMWCO </td></tr><tr><td>ガラスバイアル</td><td>フィッシャー</td><td> 03-338C </td><td></td></tr><tr><td> EDC </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> E6383 </td><td></td></tr><tr><td>ポリミキシンB </td><td> Sigma-Aldrich社</td><td> P1004 </td><td></td></tr><tr><td>細菌のグラムowth培地（LB）コンポーネント第1位</td><td>フィッシャー</td><td> NaClのS271 </td><td></td></tr><tr><td>細菌の増殖培地（LB）コンポーネント第2位</td><td> BD </td><td>トリプトン211705 </td><td></td></tr><tr><td>細菌の増殖培地（LB）コンポーネント第3位</td><td> BD </td><td>酵母エキス211929 </td><td></td></tr><tr><td>露光用ランプ</td><td>カスタム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>透明底96ウェルプレート</td><td>フィッシャー</td><td> 07-200-567 07-200-730または</td><td></td></tr><tr><td>蛍光分光計</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>吸光度プレートリーダー</td><td>モレキュラーデバイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>固体メディアのBactoAgar </td><td> Bioshop </td><td> AGR001.1 </td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿のラウンド</td><td>フィッシャー</td><td> 08-75-12 </td><td></td></tr><tr><td>長方形のペトリ皿</td><td>フィッシャー</td><td> 08から757-11A </td><td></td></tr></tbody></table>

solubilization and bio-conjugation of quantum dots and bacterial toxicity assays by growth curve and plate count

量子ドット（QD）は波長の幅広い選択肢によって励起することができる大きさに依存する発光スペクトルを有する蛍光半導体ナノ粒子である。量子ドットは、イメージング、診断、およびそれらの明るい、安定した蛍光1,2 3,4,5による治療のために多くの関心を集めている。量子ドットは、細菌および哺乳類細胞を6に結合するためのバイオ活性分子の様々に結合させることができる。 量子も広く細菌の標的殺害の細胞毒性薬として検討されています。乗算耐性菌株の出現は急速に、特にグラム陰性病原体7の場合には、公衆衛生の危機となっています。ので、特に特定のナノ材料は、Agの既知の抗菌効果で、細菌8にナノ粒子の毒性を調べる試験の何百ものがあります。細菌の研究はスペックだけでなく、半導体ナノ粒子の他のタイプと実行されているially TiO 2の 9,10-11なく、ZnOを12とCuOの13を含む他人。菌株のいくつかの比較は、通常、グラム陽性とグラム陰性菌株を比較すると、これらの研究で行われてきた。粒子や酸化毒性を引き起こす可能性があり、金属イオンの直接の放出によって活性酸素種のphotogeneration（ROS）次のいずれかのこれらの粒子のすべてに、毒性のメカニズムは酸化に起因しています。これらの材料であっても、別の試験の結果が大きく異なります。いくつかの研究ではグラム陽性菌株は伝えグラム陰性10を超えると小文字が区別されます。他のものでは、それは反対側の14です。これらの研究は十分に15件されています。 すべてのナノ粒子の研究では、粒子の組成、サイズ、表面化学、サンプルのエージング/内訳、波長、パワー、光曝露の期間はすべて劇的に結果に影響を与えることができます。加えて、synthesiの副産物と溶媒は、16 17を考慮する必要があります。ハイスループットスクリーニング技術は、効果的な新しいナノメディシンエージェントを開発することができるように必要とされている。 CdTeの量子ドットは、抗微生物効果を単独で18または抗生物質との併用を持っています。以前の研究では、CdTeのために抗生物質の結合はコンジュゲート19からの活性酸素種の減少、生産のために、細菌への毒性を増加させるが、哺乳動物細胞への毒性を減少させることができることを示した。それはカドミウム含有化合物は、ヒトでの使用が承認されることはほとんどありませんが、そのような製剤は、表面や水の殺菌の消毒に使用することができる。 このプロトコルでは、メルカプトプロピオン酸（MPA）とCdTeの量子ドットの可溶化への直接的なアプローチを提供します。量子ドットは1時間以内に使用する準備が整いました。その後、抗菌剤への結合を示しています。 プロトコルの第二部共役および非共役量子ドットを用いた96ウェル細菌の阻害アッセイを示しています。光学密度は、QDのほか、回復期間の直後と同様に評価されるように露光の効果を可能にして、多くの時間にわたって読み込まれます。我々はまた、細菌の生存率を定量化するためのコロニー数を示しています。

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Solubilization and Bio-conjugation of Quantum Dots and Bacterial Toxicity Assays by Growth Curve and Plate Count

このような半導体量子ドット（QD）のようなナノ粒子は、抗微生物や抗がんアプリケーションのために光活性化剤を作成するために使用することができます。このテクニックは、テルル化カドミウム（CdTe）量子ドットを水可溶化抗生物質にそれらを共役、成長曲線とプレートカウントに基づいて、細菌の阻害アッセイを実行する方法を示します。

成長曲線とプレートカウントにより、量子ドットや細菌の毒性試験の可溶化とバイオ共役

Quantum dots (QDs) are fluorescent semiconductor nanoparticles with size-dependent emission spectra that can be excited by a broad choice of wavelengths. ...

solubilization-bio-conjugation-quantum-dots-bacterial-toxicity-assays

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.2K ビュー.  McGill University, Montreal, QC Canada. このような半導体量子ドット（QD）のようなナノ粒子は、抗微生物や抗がんアプリケーションのために光活性化剤を作成するために使用することができます。このテクニックは、テルル化カドミウム（CdTe）量子ドットを水可溶化抗生物質にそれらを共役、成長曲線とプレートカウントに基づいて、細菌の阻害アッセイを実行する方法を示します。

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Axon Stretch Growth: The Mechanotransduction of Neuronal Growth

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata are separated from their axon terminals due to skeletal growth of the enlarging organism (Weiss 1941; Gray, Hukkanen et al. 1992). This mechanotransduction induces a secondary mode of neuronal growth capable of accommodating continual elongation of the axon (Bray 1984; Heidemann and Buxbaum 1994; Heidemann, Lamoureux et al. 1995; Pfister, Iwata et al. 2004).
Axon Stretch Growth (ASG) is conceivably a central factor in the maturation of short embryonic processes into the long nerves and white matter tracts characteristic of the adult nervous system. To study ASG in vitro, we engineered bioreactors to apply tension to the short axonal processes of neuronal cultures (Loverde, Ozoka et al. 2011). Here, we detail the methods we use to prepare bioreactors and conduct ASG. First, within each stretching lane of the bioreactor, neurons are plated upon a micro-manipulated towing substrate. Next, neurons regenerate their axonal processes, via growth cone extension, onto a stationary substrate. Finally, stretch growth is performed by towing the plated cell bodies away from the axon terminals adhered to the stationary substrate; recapitulating skeletal growth after growth cone extension.
Previous work has shown that ASG of embryonic rat dorsal root ganglia neurons are capable of unprecedented growth rates up to 10mm/day, reaching lengths of up to 10cm; while concurrently resulting in increased axonal diameters (Smith, Wolf et al. 2001; Pfister, Iwata et al. 2004; Pfister, Bonislawski et al. 2006; Pfister, Iwata et al. 2006; Smith 2009). This is in dramatic contrast to regenerative growth cone extension (in absence of mechanical stimuli) where growth rates average 1mm/day with successful regeneration limited to lengths of less than 3cm (Fu and Gordon 1997; Pfister, Gordon et al. 2011). Accordingly, further study of ASG may help to reveal dysregulated growth mechanisms that limit regeneration in the absence of mechanical stimuli.

A unique tissue engineering method was developed to elongate numerous nerve fibers in culture by recapitulating axon stretch growth; a form of nervous system growth whereby nerves elongate in conjunction with growth of the enlarging body.

軸索のストレッチの成長：神経成長のメカノトランスダ

During pre-synaptic embryonic development, neuronal processes traverse short distances to reach their targets via growth cone. Over time, neuronal somata ...

生物工学

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

原子間力顕微鏡によるイメージングのための細菌の固定化

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Production and Targeting of Monovalent Quantum Dots

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in biology, where clustering and the spatial organization of biomolecules is often the object of study. We describe here a protocol to produce monovalent quantum dots (mQDs) that can be accomplished in most biological research laboratories via a simple mixing of CdSe/ZnS core/shell QDs with phosphorothioate DNA (ptDNA) of defined length. After a single ptDNA strand has wrapped the QD, additional strands are excluded from the surface. Production of mQDs in this manner can be accomplished at small and large scale, with commercial reagents, and in minimal steps. These mQDs can be specifically directed to biological targets by hybridization to a complementary single stranded targeting DNA. We demonstrate the use of these mQDs as imaging probes by labeling SNAP-tagged Notch receptors on live mammalian cells, targeted by mQDs bearing a benzylguanine moiety.

We provide detailed instructions for the preparation of monovalent targeted quantum dots (mQDs) from phosphorothioate DNA of defined length. DNA wrapping occurs in high yield, and therefore, products do not require purification. We demonstrate the use of the SNAP tag to target mQDs to cell-surface receptors for live-cell imaging applications.

生産と一価量子ドットの標的

The multivalent nature of commercial quantum dots (QDs) and the difficulties associated with producing monovalent dots have limited their applications in ...

Correlative Light- and Electron Microscopy Using Quantum Dot Nanoparticles

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy (TEM). To demonstrate the protocol we have immunolabeled ultrathin epoxy sections of human somatostatinoma tumor using a primary antibody to somatostatin, followed by a biotinylated secondary antibody and visualization with streptavidin conjugated 585 nm cadmium-selenium (CdSe) quantum dots (QDs). The sections are mounted on a TEM specimen grid then placed on a glass slide for observation by widefield fluorescence light microscopy. Light microscopy reveals 585 nm QD labeling as bright orange fluorescence forming a granular pattern within the tumor cell cytoplasm. At low to mid-range magnification by light microscopy the labeling pattern can be easily recognized and the level of non-specific or background labeling assessed. This is a critical step for subsequent interpretation of the immunolabeling pattern by TEM and evaluation of the morphological context. The same section is then blotted dry and viewed by TEM. QD probes are seen to be attached to amorphous material contained in individual secretory granules. Images are acquired from the same region of interest (ROI) seen by light microscopy for correlative analysis. Corresponding images from each modality may then be blended to overlay fluorescence data on TEM ultrastructure of the corresponding region.

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.

量子ドットナノ粒子を用いた相関光 - 及び電子顕微鏡

A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of human pathology tissue using ...

20 mJ, 1 ps Yb:YAG Thin-disk Regenerative Amplifier

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with turn-key performance and microjoule-level pulse energy is used to seed the regenerative chirped-pulse amplifier. The amplifier is placed in airtight housing. It operates at room temperature and exhibits stable operation at a 5 kHz repetition rate, with a pulse-to-pulse stability less than 1%. By employing a 1.5 mm-thick beta barium borate crystal, the frequency of the laser output is doubled to 515 nm, with an average power of 70 W, which corresponds to an optical-to-optical efficiency of 70%. This superior performance makes the system an attractive pump source for optical parametric chirped-pulse amplifiers in the near-infrared and mid-infrared spectral range. Combining the turn-key performance and the superior stability of the regenerative amplifier, the system facilitates the generation of a broadband, CEP-stable seed. Providing the seed and pump of the optical parametric chirped-pulse amplification (OPCPA) from one laser source eliminates the demand of active temporal synchronization between these pulses. This work presents a detailed guide to set up and operate a Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier, based on chirped-pulse amplification (CPA), as a pump source for an optical parametric chirped-pulse amplifier.

A protocol for the operation of a high-energy, high-power optical parametric chirped pulse amplifier pump source based on an Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier is presented here.

20mJ、1ps Yb：YAGシンディスク再生アンプ

This is a report on a 100 W, 20 mJ, 1 ps Yb:YAG thin-disk regenerative amplifier. A homemade Yb:YAG thin-disk, Kerr-lens mode-locked oscillator with ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

ナノ製剤中のエンドトキシン検出カブトガニ リムラス ライセート (ラル) 試金を使用して

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means of identifying radiosensitive sites in living organisms. This paper describes a series of on-chip immobilization methods developed for the targeted microbeam irradiation of live individuals of Caenorhabditis elegans. Notably, the treatment of the polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chips that we previously developed to immobilize C. elegans individuals without the need for anesthesia is explained in detail. This chip, referred to as a worm sheet, is resilient to allow the microfluidic channels to be expanded, and the elasticity allows animals to be enveloped gently. Also, owing to the self-adsorption capacity of the PDMS, animals can be sealed in the channels by covering the surface of the worm sheet with a thin cover film, in which animals are not pushed into the channels for enclosure. By turning the cover film over, we can easily collect the animals. Furthermore, the worm sheet shows water retention and allows C. elegans individuals to be subjected to microscopic observation for long periods under live conditions. In addition, the sheet is only 300 &#181;m thick, allowing heavy ions such as carbon ions to pass through the sheet enclosing the animals, thus allowing the ion particles to be detected and the applied radiation dose to be measured accurately. Because selection of the cover films used for enclosing the animals is very important for successful long-term immobilization, we conducted the selection of the suitable cover films and showed a recommended one among some films. As an application example of the chip, we introduced imaging observation of muscular activities of animals enclosing the microfluidic channel of the worm sheet, as well as the microbeam irradiation. These examples indicate that the worm sheets have greatly expanded the possibilities for biological experiments.

Immobilization of Live Caenorhabditis elegans Individuals Using an Ultra-thin Polydimethylsiloxane Microfluidic Chip with Water Retention

A series of immobilization methods has been established to allow the targeted irradiation of live Caenorhabditis elegans individuals using a recently developed ultra-thin polydimethylsiloxane microfluidic chip with water retention. This novel on-chip immobilization is also adequate for imaging observations. The detailed treatment and application examples of the chip are explained.

極薄ポリジメチルシロキサン マイクロ流体チップを用いた保水ライブ線虫個人の固定化

Radiation is widely used for biological applications and for ion-beam breeding, and among these methods, microbeam irradiation represents a powerful means ...

Growth and Characterization of Irradiated Organoids from Mammary Glands

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell monolayers. Although they cannot completely model in vivo complexity, they retain some functionality of the original organ. In cancer models, organoids are commonly used to study tumor cell invasion. This protocol aims to develop and characterize organoids from the normal and irradiated mouse mammary gland tissue to evaluate the radiation response in normal tissues. These organoids can be applied to future in vitro cancer studies to evaluate tumor cell interactions with irradiated organoids. Mammary glands were resected, irradiated to 20 Gy and digested in a collagenase VIII solution. Epithelial organoids were separated via centrifugal differentiation, and 3D organoids were developed in 96-well low-adhesion microplates. Organoids expressed the characteristic epithelial marker cytokeratin 14. Macrophage interaction with the organoids was observed in co-culture experiments. This model may be useful for studying tumor-stromal interactions, infiltration of immune cells, and macrophage polarization within an irradiated microenvironment.

Organoids developed from mouse mammary glands were irradiated and characterized to assess epithelial traits and interactions with immune cells. Irradiated organoids can be used to better evaluate cell-cell interactions that may lead to tumor cell recruitment in irradiated normal tissue.

乳腺からの照射オルガノイドの成長とキャラクタリゼーション

Organoids derived from the digested tissue are multicellular three-dimensional (3D) constructs that better recapitulate in vivo conditions than cell ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

バイオセンサーベースの高スループットバイオパンニングおよびバイオインフォマティクス分析戦略による、薬物-タンパク質相互作用のグローバル検証

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

サンゴの成長促進・モニタリングのための複合マイクロデバイスシステム

An Integrated Micro-Device System for Coral Growth and Monitoring

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of the coral culture environment is highly in demand for coral conservation and study. Here, we developed a semi-closed coral culture micro-device system as a multi-functional platform, which can provide accurate and programmable temperature control, a sterile initial environment, long-term stable water quality, an adjustable dissolved oxygen concentration, and a customized light spectrum for corals. Owing to the modular design, the coral culture system can be upgraded or modified by installing desirable new modules or removing existing ones. Currently, under appropriate conditions and with proper system maintenance, the sample corals can survive for at least 30 days in a healthy state. Furthermore, due to the controllable and sterile initial environment, this coral culture system can support research into the symbiotic relationship between corals and associated microorganisms. Therefore, this micro-device system can be applied to monitor and investigate sea corals in a relatively quantitative manner.

著者スポットライト:サンゴ文化の進歩 - 電流制限に対抗するための半定量的に制御された微小環境システムの作成 

This protocol describes the development of a modular controllable micro-device system that can be applied for the long-term culturing and monitoring of sea corals.

サンゴの成長とモニタリングのための統合マイクロデバイスシステム

Corals are fundamental organisms in marine and coastal ecosystems. With the advancement of coral protection research in recent years, precise control of ...