Unterstützung für KKB wurde MJB, JLH und KLN vom California Institute for Regenerative Medicine, der Pew Charitable Trusts Biomedical Scholars Program, das Esther B. O&#39;Keeffe Family Foundation und der Shapiro Family Foundation zur Verfügung gestellt. KKB ist ein Donald E. und Delia B. Baxter Foundation Faculty Scholar.

Diese Methode wurde in der Forschung in Boland et al. Nature berichtet werden. 461, 91-96 (2009). 1 Ein. Herstellung von Lentivirus Dieses Protokoll arbeitet Doxycyclin-induzierbaren lentiviralen Shuttle-Vektoren, die für Oct4 codieren, Sox2, Klf4, und c-Myc unter Steuerung eines tetO Antwortelement. Transgene werden durch die umgekehrte Tetracyclin trans-aktivierendes Protein, rtTAM2.2 16, die Umprogrammierung Faktor-Expression in Gegenwart von Doxycyclin induziert aktiviert. Dieses System ermöglicht streng kontrollierten, hohe Expression von Umprogrammierung Faktoren. Die lentiviralen Vektoren werden dabei selbst inaktivierende und kann somit nicht replizieren folgenden genomische Integration. Allerdings ist Vorsicht geboten beim Umgang mit Lentiviren und sollten in Labors kompatibel mit BSL2 (USA) und S2 (Europe) Standards durchgeführt werden. <ol><li> HEK293T-Zellen aufgetaut und Passage mindestens einmal vor transfection. Zellen sollten subkonfluente HEK Dichte im Medium bei 37 ° C gehalten werden, 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. Routinemäßig Durchlaßzellen alle 2 Tage mit einem Split-Verhältnis von 1.06 bis 01.10 Uhr. </li><li> Saatgut ~ 8 x 10 6 HEK293T cells/T150 mit 25 ml HEK Medium. Verwenden Sie ein T150 für jeden Lentivirus Vorbereitung. </li><li> Die folgenden Tag transfizieren HEK293T-Zellen durch Calciumphosphat-Präzipitation. (Anmerkung: in unseren Händen Calciumphosphatpräzipitation routinemäßig 80-90% ergibt Transfektionseffizienz, doch, kationische Lipid Transfektionsreagenzien wie Lipofectamin 2000 ebenfalls verwendet werden können). Bereiten Sie zwei 15 ml konischen Röhrchen für jeden Virus vorbereitet werden. Beschriften Sie die Röhrchen &quot;A&quot; und &quot;B&quot;. Röhre A, 10 ug von jeder der: die lentivirale Shuttlevektor Codierung Reprogrammierungsfaktoren (oder rtTAM2.2), die virale Verpackungssignal Vektoren und Plasmid kodierend das Virushüllprotein, VSVG. Fügen Sie 186 ul 2 M CaCl 2 bis Rohr A, und bringe das Volumen auf 1,5 ml mit sterilem H 2 O. Tube B: 1,5 ml 2x HBS (auf Raumtemperatur vorgewärmt). </li><li> Pipettieren der Mischung im Rohr A, bis es eine homogene Lösung ist. Fügen Lösung A zu Lösung B tropfenweise und stehen lassen bei Raumtemperatur für 2-3 min. </li><li> Absaugen Wachstumsmedium HEK293T Zellen und ersetzen mit 22 ml vorgewärmten HEK-Medium ohne Penicillin und Streptomycin. </li><li> Pipette kombinierten Lösungen AB (Calciumphosphat-Niederschlag) direkt an HEK293T Zellen und gleichmäßig verteilen durch sanftes Schaukeln. </li><li> 24 Stunden nach Transfektion von HEK-293T-Zellen mit Lentivirus, entfernen Wachstumsmedium und ersetzen Sie es mit 25 ml frisch, vorgewärmten HEK Medium. Zurück transfizierten HEKS in den Inkubator. </li><li> 48 Stunden nach Transfektion von HEK-293T-Zellen mit Lentivirus, sammeln Nährmedien mit lentivirale Partikel aus den transfizierten HEKS. Entfernen Partikelteilchen aus der geernteten viralen Lösung durch Zentrifugieren bei 3000 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Konzentrieren Virus durch Ultrazentrifugation through eine 20% Saccharose-Kissen (2 ml sucrose/25 ml viralen Überstand) für 2 Stunden bei 112.000 × g bei 4 ° C. Suspend virale Pellet in 0,4 ml MEF Medium bei 4 ° C für 15-30 min unter leichtem Schütteln. Bewahren Viruspartikel im einzelnen Aliquots (dh 50 ul) bei -80 ° C. </li></ol> 2. Vorbereitung der embryonale Maus-Fibroblasten (MEF) für Reprogrammierung Hinweis: Das Protokoll hier skizzierten bezieht sich auf die Ableitung von iPS von E 13,5 embryonale Maus-Fibroblasten für den Einsatz in TEC-Assays. Während andere Gruppen all-iPSC Mäuse von erwachsenen Spenders Zellquellen generiert haben, haben wir nicht diese Methode auf andere Zelltypen nicht getestet und kann sicher sein, dass Spender Zelltyp nicht ein Faktor. <ol><li> Richten Sie mit der Maus timed Paarungen. An embryonalen Tag 13,5 (E13.5), einschläfern die schwangere Frau und sezieren die Embryonen aus den Uterushörner. Ort und Shop Embryonen in 1x PBS (vorgekühlt auf 4 ° C) auf Eis. </li><li> Entfernen Sie die extraembryonalen Gewebe (dhChorion, Amnion und Plazenta). Enthaupten den Embryo und entfernen Sie den Schwanz (optional - wenn für die Genotypisierung erforderlich) und Gliedmaßen. Scoop aus der inneren Organe, mit einer Pinzette oder einer Schaufel geformten Spachtel und zerkleinern die restlichen Karkasse mit der Klinge eines Skalpells oder einer scharfen Schere. </li><li> Waschen Sie das Hackfleisch Karkasse in 5 ml vorgekühlte 1x PBS. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. </li><li> Überstand. Suspend Pellet in 5 ml 0,25% Trypsin-EDTA und Inkubation bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln für 20-30 min. </li><li> 5 ml MEF Medium (vorgewärmt auf 37 ° C), mischen und Zentrifuge bei 200 xg für 5 min. </li><li> Überstand entfernen und Pellet in vorgewärmten MEF Medium. </li><li> Platte dissoziierten MEFs in 2-3 Wells einer 6-Well-Platte vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. Dies wird als ein Durchgang. </li><li> Passage MEFs bei einer Verdünnung von 1.04 Uhr bis 01.05 Uhr alle 48 Stunden. MEFs in Passage 3 sind bereit für lentivirale Transduktion. </li></ol> 3. Ableitung von iPSC Linien <ol><li> Am Tag vor lentivirale Transduktion; seed ~ 3 x 10 5 primäre MEFs in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. </li><li> Tag 1: Primäre MEFs sollte 80-90% konfluent für lentivirale Transduktion sein. Fügen lentivirale Partikel direkt an MEF Medien und inkubieren mit MEFs über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. </li><li> Am folgenden Tag (Tag 2) Saugen Sie das Medium und waschen zweimal mit 3 ml 1x PBS, um virale Partikel zu entfernen. </li><li> 0,5 ml vorgewärmtes 0,25% Trypsin-EDTA zu den Zellen und bei 37 ° C für 3-5 min mit gelegentlichen rocking. </li><li> Verreiben eine Einzelzell-Suspension zu erzielen. Beobachten Zellen lichtmikroskopisch um eine Einzelzellen-Suspension zu gewährleisten. </li><li> Übertragen MEFs in einem 15 ml konischen Röhrchen, das 5 ml MEF Medien. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand und sanft resuspendieren Zellen in MEF Medium. </li><li> Gleichmäßig aufgeteilt die Zellsuspension zwischen zwei Vertiefungen einer 6-Loch-pspäten vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. </li><li> Rocken die Platte hin und her, hin und her, und einmal in einer kreisförmigen Bewegung um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen im ganzen gut zu erreichen. Inkubieren über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2 in einer feuchten Umgebung. </li><li> Tag 3: Wiederholen Sie die Schritte 4-9, außer spalten die Zellen gleichmäßig von einem gut 3 Vertiefungen einer 6-Well-Platte vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine. Das ergibt 6 Vertiefungen von primären Fibroblasten transduziert. </li><li> Tag 4: Add Doxycyclin (Dox) bei einer Konzentration von 10 ug / ml bis 5/6 Brunnen. Ein gut sollte unbehandelt bleiben, um als Kontrolle dienen. </li><li> Hinzufügen VPA bei 1,9 mM bis 3 der 5 Vertiefungen mit dox behandelt. VPA reduziert die Proliferationsrate von MEFs. Dense Kulturen MEFs tolerieren längerer VPA während subkonfluenten Kulturen innerhalb von 2-5 Tagen senesce neigen. Daher sollte MEFs 100% konfluent wenn VPA hinzugefügt wird. Hinweis: Wir verwenden VPA in unserem Reprogrammierung Versuche, weil es eine bekannte epigenetische Modifikator, und wurde shEigene, die Effizienz der Erzeugung iPSC 17 obwohl die Wirkungen und Mechanismen von VPA Wirkung gegenüber Herstellung vollständig pluripotenten iPSC Linien sind nicht bekannt erhöhen. </li><li> Tag 5: Saugen Sie das Medium, waschen und trypsinieren die Zellen wie zuvor. Passage die Zellen mit dox / VPA zu einer 15 cm 2 Gewebekulturschale vorbeschichtet mit 0,1% Gelatine und jeder der anderen Bedingungen vor, beschichtete 10 cm 2 Gerichte in ES-Zell-Medium mit frischem dox und VPA ergänzt behandelt. </li><li> Tanken Zellen jeden Tag mit ESC Medium mit frischem dox und VPA ergänzt. ESC-ähnliche Kolonien beginnt nach ca. 7 Tagen in der dox / VPA-Behandlung und nach ~ 10 Tage in der dox eigenständige Behandlung erscheinen. Keine Kolonien in Abwesenheit von dox Behandlung erscheinen. </li><li> Sobald Kolonien ein helles refraktiven besitzen, gut definierte Grenze und enthalten 30-50 Zellen manuell isolieren die Kolonien mit einem Gelbeladung Pipettenspitze und Transfer zu einem U-Boden 96 Well-Platte mit 20 ul von 00,25% Trypsin-EDTA. Trypsinieren, um einzelne Zellen und Transfer zum Abzweigen in einem flachen Boden 96 Well-Platte in 150 ul ESC-Medium mit dox / VPA oder dox allein. </li><li> Weiter zu klonal expandieren die isolierten iPSC Linien auf Feeder ESC Medium. Entfernen dox und VPA am Tag 19 nach Zugabe (post-Transduktion Tag 23). Entsorgen iPSC Linien, die nicht pflegen Selbst-Erneuerung oder Proliferation ähnlich ESC Kontrollen. </li></ol> Es kann hilfreich sein, um Ihre iPSC Linien in Bezug auf ESCs charakterisieren bevor TEC durchzuführen. Wir haben unsere Linien durch 1) die Expression von endogenen Pluripotenz Marker (SSEA-1, Oct4, Sox2, Nanog) Immunzytochemie, 2) Karyotypanalyse durch Chromosomenzählung und 3) Embryoidkörper Bildung. Man kann auch durchführen lentiviralen-spezifische RT-qPCR, um zu bestätigen, dass die provirale Transgene nicht in den iPSCs ausgedrückt. Allerdings haben wir voll pluripotente iPS identifiziert mit nur Morphologie, Immunfärbung und karyotyping. In unseren Experimenten Auswahl iPSC Linien auf ESC-artige Morphologie und Wachstumseigenschaften Ergebnisse in der Mehrzahl der Linien exprimieren Pluripotenz Marker basiert, während wir typischerweise identifizieren mehrere Linien mit potentiell anormale Karyotypen. 4. Vorbereitung der iPS in Blastozysten injiziert Passage Nummer eines PSC Linie hat sich gezeigt, ihre Pluripotenz 18 beeinträchtigen, obwohl dies abhängig Linie 19 sein kann. Wir haben iPSCs von Passagen 8-14 zur Behandlung von erwachsenen all-iPSC Mäuse produzieren. <ol><li> Thaw iPSCs und Platte auf Feeder ESC Medium. Passage der Zellen mindestens einmal auf Zubringer vor dem Einsatz zur Injektion. </li><li> Einem Well einer 6-Well-Platte, enthaltend 70-80% konfluenten IPSCs wird mehr als eine ausreichende Anzahl von Zellen für die Injektion. Absaugen Wachstumsmedium und waschen Sie die Zellen mit ~ 3 ml 1x PBS (ohne Ca 2 + / Mg 2 +). </li><li> 0,5 ml vorgewärmten 0,05% Trypsin-EDTAdie Zellen und bei 37 ° C für 10 min mit gelegentlichen rocking. </li><li> Verreiben eine Einzelzell-Suspension zu erzielen. Beobachten Zellen lichtmikroskopisch um eine Einzelzellen-Suspension zu gewährleisten. Die iPSCs müssen in einzelne Zellsuspension so Kolonien / Zellaggregate die Injektionspipette verstopfen. </li><li> Sobald eine Einzelzellsuspension ben erreicht hat, 1,0 ml ESC Medien zum Brunnen und gibt die Platte an dem 37 ° C Inkubator. Inkubieren ~ 15 min oder bis die Mehrheit der Anleger haben damit begonnen, haften. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Medium mit den iPS dabei nicht die schwach haftende Anleger zu vertreiben. </li><li> Legen Sie die iPS in einem 15 ml konischen Röhrchen mit 5 ml ESC Medium. Zentrifuge bei 200 × g für 5 min. Überstand und entfernen Sie den Rest der ES-Zell-Medium mit einer Mikropipette. Tippen Sie auf das Rohr, um das Pellet und sanft resuspendieren Zellen in 0,2-0,5 ml vorgekühlte FHM Medium zu vertreiben. Shop-Zellen auf Eis, bis und während der Injektion in tetraploide blastocysts. </li></ol> 5. Generation tetraploide Blastozysten Verfahren in diesem Abschnitt ausgeführt haben an anderer Stelle ausführlich 5,6,20 beschrieben worden. Hier beschreiben wir unsere Technik für die BTX Electro Zellmanipulators ECM 2001 optimiert. <ol><li> Richten Sie Embryos Spender Mäusen durch Grundierung 23-28 Tage alte weibliche Mäuse (C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1) mit PMS und HCG. Verwalten 5 IU von PMS am 02.00 und 5 IU HCG 47 Stunden später. Nach HCG Injektion einzurichten weibliche Mäuse mit C57BL/6J-Tyr c-2J / BALB / cByJ F1 Deckrüden. Überprüfen Sie die folgenden Tage für vaginale Stecker. </li><li> Euthanize eingesteckt weiblichen Mäusen und sammeln Eileiter. Sammle 1-Zell-Embryonen, indem Eileiter in FHM mit Hyaluronidase und sanft reißen die ampulae. Lassen Sie die cumulus Massen in FHM / Hyaluronidase für 5-7 min sitzen. </li><li> Sammle 1-Zell-Embryonen mit dem Mund ansaugen und waschen durch Tropfen FHM Medien, bevor sie in KSOM-AA Kultur. Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 unter Mineralöl Nacht, und wählen Sie 2-Zell-Embryonen am Tag der Elektrofusion, verwirft alle anderen Embryonen. </li><li> Legen Sie eine BTX MicroSlide in einer 10 cm Petrischale. Gießen Sie genug Raumtemperatur Elektrofusion Medien tauchen die Folie in der Lösung, aber nicht so viel, dass die Pole der Elektrode vollständig untergetaucht. </li><li> Schalten Sie ECM 2001 und BTX Enhancer 400. Verbinden Sie den ECM-Kabel an den MicroSlide der Elektrode und fixieren Sie die Kabel an der Seite der Petrischale zu unbeabsichtigten Bewegung des Schlittens zu verhindern. </li><li> Führen Sie einen manuellen Impuls an eine Lesung auf dem BTX-Enhancer erhalten und beachten Sie die Spannung der AC / DC-Ströme angewandt werden. Wechselstrom wird die Geschwindigkeit, mit welcher die Embryonen zwischen den Elektroden ausgerichtet werden wird, wird die Gleichstrom verschmelzen Blastomeren und Pulszeit wird die Länge des DC-Impuls eingestellt. Ein guter Ausgangspunkt ist AC 3V, DC 100V und Zeit 0,05 ms. Die optimale DC variiert im Bereich von 90-150 Volt. </li&gt; <li> Mit einem Mund Pipette ca. 30-40 Zwei-Zell-Embryonen entnehmen KSOM-AA Kultur und waschen Sie sie durch mehrere Tropfen Elektrofusion Medium. Zeichnen frischen Elektrofusion Medien aus dem MicroSlide Teller in den Mund Pipette und nehmen Embryonen aus der Wäsche. Sie in den 1 mm Spalt zwischen den Elektroden auf dem MicroSlide. Vorsichtig sein, dass sie in der Mitte des Spaltes, und dass sie nicht in Kontakt miteinander ausgerichtet sind. </li><li> Mit Wechselstrom durch Drücken des manuellen Impuls-Taste. Die Embryonen werden in der Wechselstromfeld drehen, bis die Ebene der Blastomere Kontakt ist parallel zu den Elektroden. Wenn Embryonen nicht in ein paar Sekunden ausgerichtet sind, erhöhen AC Einstellung. </li><li> Nach Embryonen ausgerichtet haben, drücken Sie die Handrad-Taste erneut, um die DC Impuls anzulegen. </li><li> Mit Elektrofusion Medium in der Pipette, sammeln die Embryonen aus dem MicroSlide. Waschen Embryonen durch einige Tropfen KSOM-AA und legen Sie sie in KSOM-AA Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2. Die Blastomeren Fusion shoULD in weniger als 30 min in Kultur abgeschlossen sein. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 7-11 für die verbleibenden 2-Zell-Embryonen. Nach anschließender Fusion Gruppen, zu überwachen und wählen Embryonen mit geschmolzenem Blastomeren. Erfolgreich fusionierten Embryonen erscheint, um in 1-Zell-Stadium sein. Entsorgen lysiert und 2-Zell-Embryonen nach 30 min in der Kultur. Wenn Fusion liegt unter 80%, Erhöhung von Spannung und / oder die Zeit in Schritten von 5V und 0,01 msec. Wenn Lyse über 20%, verringern Gleichspannung und / oder der Zeit entsprechend. Die optimalen Einstellungen in unseren Experimenten wurden AC 4V DC 146v und 0,07 msec. Diese Einstellungen konsequent ergab 90% oder höher Fusionsraten mit wenig oder keiner Lyse. </li><li> Weiterhin Kultur kondensierten Embryonen in Mikrotropfen KSOM-AA unter Mineralöl bei 37 ° C, 5% CO 2. Sie sollten erwarten, 85-95% des fusionierten Embryonen tetraploiden (4n) Blastozysten nach 48 Std. Inkubation bilden. </li></ol> 6. Mikroinjektion von iPS in tetraploide Blastozysten Wir verwenden eine Nikon TE-2000Uinverse Mikroskop mit DIC Optik und Narishige Mikromanipulatoren in Blastozysten injiziert ausgestattet. Jeder tetraploide Blastozysten mit 10-12 iPSCs mit einem Standard-Protokoll für die ESC-Injektion in Maus-Blastozysten, die in einer früheren JoVE Veröffentlichung 5,20,21 nachgewiesen wurde injiziert <ol><li> Legen Sie eine 20 ul Tropfen FHM in der Mitte eines konkaven Objektträger und bedecken Sie es mit 150 ul Mineralöl. </li><li> Senken Sie die Haltepipette und Mikroinjektion Nadel in die FHM Tropfen. Lassen Sie 2-3 min für beide Nadeln teilweise mit FHM füllen. </li><li> Waschen 20-30 tetraploide Blastozysten durch Tropfen FHM und Transfer zum FHM Tropfen auf dem Objektträger. </li><li> Mouth Pipette iPSC Mischung in den Tropfen. Es kann notwendig sein, um die Zellmischung in einem Tropfen FHM vorher, wenn Zellen zu konzentrieren oder aggregiert verdünnen. </li><li> Pick-up 100-200 Zellen mit der Injektionsnadel. </li><li> Halten Sie die Blastozyste mit der inneren Zellmasse in der 9-Uhr postulierenIon. Inject Zellen in blastocoel durch Durchdringen der Zona pellucida und Trophoblasten in der 3-Uhr-Position. Inject 16-18 Zellen pro Blastozyste. </li><li> Zurück iPSC ergänzt Blastozysten zu KSOM-AA Kultur. </li></ol> 7. Transfer von Ergänzt tetraploide Blastozysten in die Gebärmutter Horns des Empfängers Mäuse Ergänzt tetraploide Blastozysten werden chirurgisch zu den Uterushörner der weiblichen Empfängermäuse nach den Richtlinien des Forschers Instituts übertragen, mit der Standard-Technik 20, die wir kurz zusammenfassen soll. Wählen weiblichen CD-1-Mäuse an der pro-Östrus Bühne und stellte sie zur Paarung mit vasektomierten Männchen. Überprüfen Sie für die vaginale Stecker am nächsten Morgen. Frauen sind bereit für uterine Embryotransfer zwei Tage nach dem Plug erkannt wurde (2,5 dpc). Einen Tag vor Empfänger Weibchen mit vasektomierten Männchen verpaart, Einrichten zusätzlicher CD-1 Weibchen mit nicht-vasektomierten Männchenals Ammen für die all-iPSC Mäusen durch Kaiserschnitt abgerufen werden. 8. Kaiserschnitt und Förderung der iPSC-derived Pups Der Transfer der Embryonen TC resultiert typischerweise in mehreren Resorptionen nach der Implantation, auch wenn der iPSC oder ESC-Linie hat eine hohe Entwicklungsfähigkeit. Als Ergebnis kann man erwarten, nicht mehr als 4 lebensfähige Jungtiere (in der Regel 1-2) pro Empfänger. Diese kleinen Würfe sind in der Regel von den Empfängern vernachlässigt. Um das Niveau der Neonatologie und die Überlebensrate zu erhöhen, führen wir C-Profile und die Förderung nach dem Standard-Protokolle 20. Um den Kaiserschnitt durchzuführen, einschläfern Empfängermäuse 16 Tage nach dem Embryotransfer bei 7-08.00 (Empfänger 18,5 dpc) und sezieren Welpen aus den Uterushörner. Foster lebensfähige Jungtiere zur CD-1 Müttern, dass die gelieferten Würfe am selben Tag.

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H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+adult+phenotyping+directly+from+mutant+embryonic+stem+cells.">Developmental and adult phenotyping directly from mutant embryonic stem cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104, 4455-4460 (2007).</li><li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Manipulating the mouse embryo: A laboratory manual. , (2003).</li><li>Kirak, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transnuclear+Mice+with+Pre-defined+T+Cell+Receptor+Specificities+Against+Toxoplasma+gondii+Obtained+Via+SCNT.">Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT.</a> J. Vis. Exp. (43), e2168 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Generieren Mäuse aus iPS-Linien mit TEC-Assays stellt eine strenge funktionale Test für die Pluripotenz einer iPSC Linie. Dieser Test kann nützlich sein, um die relative Wirksamkeit der verschiedenen Verfahren der Reprogrammierung beurteilen oder iPSC Linien, die am nützlichsten sein kann zum Erzeugen bestimmter Zelltypen in vitro zu identifizieren. Mäuse aus iPS erzeugt werden, können verwendet werden, um stringent testen die langfristige Stabilität und Tumorigenität von iPSC abgeleiteten Geweben werden. Dieses Protokoll wird nützlich sein, um Ermittler wollen voll pluripotente iPS Linien oder iPSC Mäuse zu generieren oder die relative Nutzen der verschiedenen Verfahren der Reprogrammierung zu vergleichen. Die Mechanismen, die Erzeugung und Identifizierung von vollständig pluripotente iPS Kontrolle bleiben schlecht verstanden und es ist möglich, dass einige iPSC Linien unter Verwendung dieser Methode wird nicht durch den TEC-Test. Viele Faktoren können zwischen Experimenten einschließlich der genetischen Hintergründe, lentiviralen Titer, Muster von lentiviralen i variierennsertion, Zell-Zyklus-Parameter des Spenders Bevölkerung, Inter-Labor-Unterschiede in den verschiedenen Stufen des TEC Verfahren und variable Neigungen iPSCs beherbergen genetischer oder epigenetischer Aberrationen. Die besten Voraussetzungen dafür Erfolg, wir kümmern uns um angemessenen Niveaus des lentiviralen Genexpression in iPSC Ableitung Experimenten testen viralen Verdünnungen zur Kontrolle MEFs um sicherzustellen, dass jeder Virus ausreichend konzentriert zu nachweisbaren Genexpression mindestens 80% und idealerweise 100% der Erzeugung zu etablieren MEFs. Dies ermöglicht es uns, um Linien mit mehreren Kopien verschiedener Lentiviren zu identifizieren, während limitierenden Toxizität der MEFs und produziert Kolonien ohne Überbelegung der Brunnen. Es sollte beachtet werden, dass mehrere andere Protokolle erwiesen haben IPSCs mit voller Entwicklungspotential erzeugen, unter Verwendung mehrerer Verfahren und Donorzelle Quellen nahe legt, dass mehrere Pfade zu allen Pluripotenz kann 1,8-13,15 existieren. Derzeit jedoch keine definitive Biomarker voll pluripotent iPSCidentifiziert wurde und daher die TEC Assay bleibt der Goldstandard Test, ob eine Linie iPSC können alle Zelllinien in einem Organismus zu erzeugen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (high glucose)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES cell qualified FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>104392-024</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-071</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamax</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&beta;-Mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma M7522</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1% Gelatin</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ES006-B</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11140</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium 199</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11150-059</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ESGRO (murine LIF)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Valproic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4543</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP231-100</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25200</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14040-133</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS Ca2+/Mg2+ free</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pregnant mare serum gonadotropin, for superovulation, freeze-dried, 2,000 IU</td>
			<td>Harbor-UCLA Research Institute</td>
			<td>n/a</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chorionic gonadotropin, human</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHM medium with Hyaluronidase</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-056-F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KSOM-1/2 AA medium</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-106-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FHM</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MR-024-D</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water, for embryo transfer, embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W1503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil, embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M5310</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7902</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2773</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Mannitol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M4125</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA), embryo tested</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A3311</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse embryonic fibroblasts, non-irradiated</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>PMEF-CFL</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>
			Media and buffers used in this protocol
			HEK293T growth medium. 90% DMEM, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Exclude penicillin and streptomycin from HEK media used on day of transfection. HEK medium can be stored at 4 &deg;C for up to 1 month.
			2x HBS. 42 mM Hepes, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4&middot;7H2O, 12 mM Dextrose. pH to 7.1 +/- 0.1. pH is critical! Sterile filter and store at 4 &deg;C.
			Mouse embryonic fibroblast (MEF) growth medium (also for use with feeders). 70% DMEM, 20% Medium 199, 10% FBS, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. Store at 4 &deg;C for up to 1 month.
			ESC growth medium. 85% DMEM,15% ES cell qualified FBS, 1x Glutamax, 0.1 mM non-essential amino acids, 0.1 mM &beta;-mercaptoethanol, 1,000 U/ml ESGRO, 100 U/ml penicillin and 10 mg/ml streptomycin. ESC media can be stored at 4 &deg;C for up to three weeks.
			Electrofusion medium. 0.3 M Mannitol, 0.1 mM MgSO4, 50 mM CaCl2, and 3% BSA in embryo tested water. Store at 4 &deg;C for up to 3 months.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of mice derived from induced pluripotent stem cells

Die Herstellung von induzierten pluripotenten Stammzellen (IPSCs) aus somatischen Zellen liefert ein Mittel, um wertvolle Werkzeuge für Grundlagenforschung erstellen und kann zusätzlich auch eine Quelle von auf den Patienten abgestimmte Zellen für regenerative Therapien. iPSCs können unter Verwendung mehrerer Protokolle und abgeleitet aus mehreren Quellen gefahndet. Einmal erzeugt werden IPSCs getestet unter Verwendung einer Vielzahl von Assays, einschließlich Immunfärbung für Pluripotenz Markern Generation drei Keimblätter in embryoid bodies und Teratome, Vergleichen der Genexpression mit embryonalen Stammzellen (WSR) und Produktion von chimären Mäusen mit oder ohne Beteiligung Keimbahn 2 . Wichtig ist, dass iPSC Linien, die diese Tests bestehen noch variieren in ihrer Fähigkeit, produzieren verschiedene differenzierte Zelltypen 2. Dadurch wurde es schwierig, festzustellen, welche iPSC Ableitung Protokolle Donorzelle Quellen oder Auswahlmethoden am nützlichsten sind für verschiedene Anwendungen. Die strengste Testob eine Stammzell-Linie hat genügend Entwicklungspotenzial, alle Gewebe für das Überleben eines Organismus benötigt generieren (sog. volle Pluripotenz) ist tetraploide Embryos Ergänzung (TEC) 3-5. Technisch beinhaltet TEC Elektrofusion von Zwei-Zell-Embryonen tetraploiden (4n) ein-Zell-Embryonen, die in vitro in das Blastozystenstadium 6 kultiviert werden können erzeugen. Diploiden (2n) pluripotente Stammzellen (zB WSR bzw. iPSCs) werden dann in die blastocoel Hohlraum der tetraploide Blastozysten injiziert und an einen Empfänger Buchse für Schwangerschaft (siehe Abbildung 1). Die Komponente der tetraploiden Embryo ergänzt trägt fast ausschließlich den extraembryonale Gewebe (Plazenta, Dottersack), während die diploiden Zellen der Embryo ordnungsgemäße bilden, was zu einem Fötus vollständig aus dem injizierten Stammzelllinie abgeleitet. Kürzlich berichteten wir über die Ableitung von iPSC Linien, die reproduzierbar erzeugen erwachsenen Mäusenüber TEC 1. Diese iPS-Linien ergeben sich lebensfähige Jungtiere mit Wirkungsgraden von 5-13%, vergleichbar mit WSR 3,4,7 und höher als das für die meisten anderen iPSC Zeilen 8-12 gemeldet wird. Diese Berichte zeigen, dass die direkte Reprogrammierung voll pluripotente iPS, die WSR entsprechen in ihrem Entwicklungspotential und die Effizienz der Erzeugung von Welpen in TEC Tests produzieren. Derzeit ist nicht klar, was unterscheidet zwischen vollständig pluripotenten iPS und weniger potent Zeilen 13-15. Auch ist es nicht klar, welche durch Verfahren der Reprogrammierung wird diese Zeilen mit dem höchsten Wirkungsgrad zu produzieren. Hier beschreiben wir eine Methode, die vollständig pluripotente iPS und &quot;all-iPSC&quot; Mäuse, die hilfreich sein für die Ermittler wollen die Pluripotenz von iPS-Linien zu vergleichen oder zu etablieren, die Gleichwertigkeit der verschiedenen Verfahren der Reprogrammierung kann produziert.

In step 3, "Derivation of iPSCs from MEFs", one should observe morphological heterogeneity and immature iPSC colony formation starting 4-5 days after doxycycline/VPA addition and mature colonies between 7-10 days (Figure 2). The production of one-cell tetraploid embryos in step 5 is highly efficient (Figure 3). We routinely observe up to 95% of treated two-cell embryos successfully fuse to produce tetraploid one-cell embryos. The protocol followed to inject iPSCs into tetraploid blastocysts (Step 6, Figure 4) is similar to the protocol for injection of ESCs into diploid blastocysts to generate chimeric mice, and can be performed by an experienced microinjectionist. The number of live pups born depends on the cell line (Table 1).
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">MEF preprogramming efficiency 0.01-0.03%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="5">Efficiency of iPSC mouse production by TEC</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>Name</td>
			<td>Description</td>
			<td>Blastocysts injected</td>
			<td>Live Newborn</td>
			<td>Live Adult</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-21</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>867</td>
			<td>53 (6.1%)</td>
			<td>19 (2.2%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-9</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>195</td>
			<td>7 (3.6%)</td>
			<td>4 (2.1%)</td>
		</tr>
		<tr valign="top">
			<td>iMZ-11</td>
			<td>iPSC</td>
			<td>338</td>
			<td>1(0.3%)</td>
			<td>0 (0%)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. Representative Results.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig1.jpg" /> 
Figure 1. Schematic of experimental design. Top left: Production of tetraploid blastocysts. Fertilized two-cell embryos from albino mice are electrofused to generate tetraploid one-cell embryos, which are cultured in vitro to the blastocyst stage. Bottom left: Reprogramming. Mouse embryonic fibroblasts are transduced with lentiviral particles encoding Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc and the reverse tetracycline transactivating protein, rtTAM2.2. Addition of doxycycline results in transgene expression and the initiation of reprogramming to iPSCs. Right: Production of iPSC mice. iPSCs derived from pigmented mice are injected into the blastocoel of tetraploid blastocysts and then surgically implanted into pseudo-pregnant recipient mice. Newborn iPSC mice are delivered by Caesarian section and cross-fostered. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig1large.jpg" target="_blank"> Click here to view larger figure</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig2.jpg" /> 
Figure 2. Morphological changes associated with reprogramming. From left to right: Examples of the morphological progression from fibroblasts to iPSC colonies during the course of a reprogramming experiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4003/4003fig2large.jpg" target="_blank"> Click here to view larger figure</a>.
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig3.jpg" /> 
Figure 3. Production of tetraploid embryos. Diploid two-cell embryos are subjected to an electric pulse resulting in blastomere fusion and generation of one-cell tetraploid embryos.
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4003/4003fig4.jpg" /> 
Figure 4. Production of iPSC mice. Left: iPSCs are injected into the blastocoel of a tetraploid blastocyst. Middle: Newborn iPSC mice are distinguished by pigmented eyes. Right: iPSC mouse at three weeks post-delivery.

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Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet produzieren<sup&gt; 1</sup&gt;.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

generation-of-mice-derived-from-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Biology

21.2K Aufrufe.  The Scripps Research Institute. Erzeugung induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) Linien produziert Linien unterschiedlicher Entwicklungspotenzial, auch wenn sie Standard-Tests für Pluripotenz passieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll, um Mäuse vollständig aus iPS, die die iPSC Linien definiert als die über volle Pluripotenz abgeleitet produzieren 1.

Serie: Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Erzeugung von induzierten pluripotenten Stammzellen durch Reprogrammierung menschlichen Fibroblasten mit dem Stemgent Menschliche TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Forschung

Biologie

Transfecting and Nucleofecting Human Induced Pluripotent Stem Cells

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human embryonic stem cells (HESCs)1. While improvements in several gene delivery methods have been described2-9, transfection remains a capricious process for HESCs, and has not yet been reported in human induced pluripotent stem cells (iPSCs). In this video, we demonstrate how our lab routinely transfects and nucleofects human iPSCs using plasmid with an enhanced green fluorescence protein (eGFP) reporter. Human iPSCs are adapted and maintained as feeder-free cultures to eliminate the possibility of feeder cell transfection and to allow efficient selection of stable transgenic iPSC clones following transfection. For nucleofection, human iPSCs are pre-treated with ROCK inhibitor11, trypsinized into small clumps of cells, nucleofected and replated on feeders in feeder cell-conditioned medium to enhance cell recovery. Transgene-expressing human iPSCs can be obtained after 6 hours. Antibiotic selection is applied after 24 hours and stable transgenic lines appear within 1 week. Our protocol is robust and reproducible for human iPSC lines without altering pluripotency of these cells.

Despite recent advancements in genetic modification, transfection of human embryonic stem cells (HESCs) remains a capricious process. To our knowledge, systematic and efficient methods to transfect human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have not been reported. Here, we describe robust protocols to efficiently transfect and nucleofect human iPSCs.

Transfektion und Nucleofecting menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

Genetic modification is continuing to be an essential tool in studying stem cell biology and in setting forth potential clinical applications of human ...

Selecting and Isolating Colonies of Human Induced Pluripotent Stem Cells Reprogrammed from Adult Fibroblasts

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) in the presence of sodium butyrate 1-3. We used this method to reprogram late passage (&gt;p10) human adult fibroblasts derived from Friedreich's ataxia patient (GM03665, Coriell Repository). The reprogramming approach includes highly efficient transduction protocol using repetitive centrifugation of fibroblasts in the presence of virus-containing media. The reprogrammed hiPSC colonies were identified using live immunostaining for Tra-1-81, a surface marker of pluripotent cells, separated from non-reprogrammed fibroblasts and manually passaged 4,5. These hiPSC were then transferred to Matrigel plates and grown in feeder-free conditions, directly from the reprogramming plate. Starting from the first passage, hiPSC colonies demonstrate characteristic hES-like morphology. Using this protocol more than 70% of selected colonies can be successfully expanded and established into cell lines. The established hiPSC lines displayed characteristic pluripotency markers including surface markers TRA-1-60 and SSEA-4, as well as nuclear markers Oct3/4, Sox2 and Nanog. 
The protocol presented here has been established and tested using adult fibroblasts obtained from Friedreich's ataxia patients and control individuals 6, human newborn fibroblasts, as well as human keratinocytes.

We present a protocol for efficient reprogramming of human somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-myc (OSKM) and identification of correctly reprogrammed hiPSC by live staining with Tra-1-81 antibody.

Selektieren und Isolieren Colonies of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus adulten Fibroblasten Umprogrammierte

Herein we present a protocol of reprogramming human adult fibroblasts into human induced pluripotent stem cells (hiPSC) using retroviral vectors encoding ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

Reprogrammierung menschlichen Körperzellen in induzierte pluripotente Stammzellen (IPSCs) mit retroviralen Vektoren mit GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Generation of Human Induced Pluripotent Stem Cells from Peripheral Blood Using the STEMCCA Lentiviral Vector

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, generating so-called induced pluripotent stem cells (iPSCs)1-4. Patient-specific iPSCs lack the ethical concerns that surround embryonic stem cells (ESCs) and would bypass possible immune rejection. Thus, iPSCs have attracted considerable attention for disease modeling studies, the screening of pharmacological compounds, and regenerative therapies5.
We have shown the generation of transgene-free human iPSCs from patients with different lung diseases using a single excisable polycistronic lentiviral Stem Cell Cassette (STEMCCA) encoding the Yamanaka factors6. These iPSC lines were generated from skin fibroblasts, the most common cell type used for reprogramming. Normally, obtaining fibroblasts requires a skin punch biopsy followed by expansion of the cells in culture for a few passages. Importantly, a number of groups have reported the reprogramming of human peripheral blood cells into iPSCs7-9. In one study, a Tet inducible version of the STEMCCA vector was employed9, which required the blood cells to be simultaneously infected with a constitutively active lentivirus encoding the reverse tetracycline transactivator. In contrast to fibroblasts, peripheral blood cells can be collected via minimally invasive procedures, greatly reducing the discomfort and distress of the patient. A simple and effective protocol for reprogramming blood cells using a constitutive single excisable vector may accelerate the application of iPSC technology by making it accessible to a broader research community. Furthermore, reprogramming of peripheral blood cells allows for the generation of iPSCs from individuals in which skin biopsies should be avoided (i.e. aberrant scarring) or due to pre-existing disease conditions preventing access to punch biopsies.
Here we demonstrate a protocol for the generation of human iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) using a single floxed-excisable lentiviral vector constitutively expressing the 4 factors. Freshly collected or thawed PBMCs are expanded for 9 days as described10,11 in medium containing ascorbic acid, SCF, IGF-1, IL-3 and EPO before being transduced with the STEMCCA lentivirus. Cells are then plated onto MEFs and ESC-like colonies can be visualized two weeks after infection. Finally, selected clones are expanded and tested for the expression of the pluripotency markers SSEA-4, Tra-1-60 and Tra-1-81. This protocol is simple, robust and highly consistent, providing a reliable methodology for the generation of human iPSCs from readily accessible 4 ml of blood.

Here we show a simple and effective protocol for the generation of human iPSCs from 3-4 ml of peripheral blood using a single lentiviral reprogramming vector. Reprogramming of readily available blood cells promises to accelerate the utilization of iPSC technology by making it accessible to a broader research community.

Generation of Human induzierten pluripotenten Stammzellen aus dem peripheren Blut mit dem STEMCCA Lentivirusvektor

Through the ectopic expression of four transcription factors, Oct4, Klf4, Sox2 and cMyc, human somatic cells can be converted to a pluripotent state, ...

Rapid and Efficient Generation of Neurons from Human Pluripotent Stem Cells in a Multititre Plate Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are multistep procedures involving the isolation and expansion of neural precursor cells, prior to terminal differentiation. In comparison to these time-consuming approaches, we have recently found that combined inhibition of three signaling pathways, TGF&beta;/SMAD2, BMP/SMAD1, and FGF/ERK, promotes rapid induction of neuroectoderm from hPSCs, followed by immediate differentiation into functional neurons. Here, we have adapted our procedure to a novel multititre plate format, to further enhance its reproducibility and to make it compatible with mid-throughput applications. It comprises four days of neuroectoderm formation in floating spheres (embryoid bodies), followed by a further four days of differentiation into neurons under adherent conditions. Most cells obtained with this protocol appear to be bipolar sensory neurons. Moreover, the procedure is highly efficient, does not require particular expert skills, and is based on a simple chemically defined medium with cost-efficient small molecules. Due to these features, the procedure may serve as a useful platform for further functional investigation as well as for cell-based screening approaches requiring human sensory neurons or neurons of any type.

Protocols for neuronal differentiation of pluripotent human stem cells (hPSCs) are often time-consuming and require substantial cell culture skills. Here, we have adapted a small molecule-based differentiation procedure to a multititre plate format, allowing simple, rapid, and efficient generation of human neurons in a controlled manner.

Schnelle und effiziente Erzeugung von Neuronen aus menschlichen pluripotenten Stammzellen in einem Multititre Platte Format

Existing protocols for the generation of neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) are often tedious in that they are  multistep procedures ...

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is essential first to generate functional human cardiomyocytes (CMs). The use of these cells in drug discovery and toxicology studies would also be highly beneficial, allowing new pharmacological molecules for the treatment of cardiac disorders to be validated pre-clinically on cells of human origin. Of the possible sources of CMs, induced pluripotent stem (iPS) cells are among the most promising, as they can be derived directly from readily accessible patient tissue and possess an intrinsic capacity to give rise to all cell types of the body 1. Several methods have been proposed for differentiating iPS cells into CMs, ranging from the classical embryoid bodies (EBs) aggregation approach to chemically defined protocols 2,3. In this article we propose an EBs-based protocol and show how this method can be employed to efficiently generate functional CM-like cells from feeder-free iPS cells.

Pluripotent stem cells, either embryonic or induced pluripotent stem (iPS) cells, constitute a valuable source of human differentiated cells, including cardiomyocytes. Here, we will focus on cardiac induction of iPS cells, showing how to use them to obtain functional human cardiomyocytes through an embryoid bodies-based protocol.

Generation of Human Cardiomyocytes: Eine Differenzierung Protokoll von Feeder-freien menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Subtype-specific Optical Action Potential Recordings in Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Ventricular Cardiomyocytes

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a homogenous population of cells, the iPSC-CMs generated by current differentiation protocols represent a mixture of cells with ventricular-, atrial-, and nodal-like phenotypes, which complicates phenotypic analyses. Here, a method to optically record action potentials specifically from ventricular-like iPSC-CMs is presented. This is achieved by lentiviral transduction with a construct in which a genetically-encoded voltage indicator is under the control of a ventricular-specific promoter element. When iPSC-CMs are transduced with this construct, the voltage sensor is expressed exclusively in ventricular-like cells, enabling subtype-specific optical membrane potential recordings using time-lapse fluorescence microscopy.

Here we present a method to optically image action potentials, specifically in ventricular-like induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. The method is based on the promoter-driven expression of a voltage-sensitive fluorescent protein.

Subtyp-spezifische optische Aktionspotential Aufnahmen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet ventrikuläre Kardiomyozyten

Cardiomyocytes generated from human induced pluripotent stem cells (iPSC-CMs) are an emerging tool in cardiovascular research. Rather than being a ...

Generation and Maintenance of Primate Induced Pluripotent Stem Cells Derived from Urine

Cross-species approaches studying primate pluripotent stem cells and their derivatives are crucial to better understand the molecular and cellular mechanisms of disease, development, and evolution. To make primate induced pluripotent stem cells (iPSCs) more accessible, this paper presents a non-invasive method to generate human and non-human primate iPSCs from urine-derived cells, and their maintenance using a feeder-free culturing method.
The urine can be sampled from a non-sterile environment (e.g., the cage of the animal) and treated with a broad-spectrum antibiotic cocktail during primary cell culture to reduce contamination efficiently. After propagation of the urine-derived cells, iPSCs are generated by a modified transduction method of a commercially available Sendai virus vector system. First&#160;iPSC colonies may already be visible after 5 days, and can be picked after 10 days at the earliest. Routine clump passaging with enzyme-free dissociation buffer supports pluripotency of the generated iPSCs for more than 50 passages.

The present protocol describes a method to isolate, expand, and reprogram human and non-human primate urine-derived cells to induced pluripotent stem cells (iPSCs), as well as instructions for feeder-free maintenance of the newly generated iPSCs.