Name: derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos
Uploaded: 2017-08-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
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Wir danken Jonatan Lucas für seine technische Unterstützung mit Feeder-Zellkultur, Servei Estabulari De La UAB für Tierpflege und Domènec Martín für die Videoaufnahme. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R und Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC ist ein PIF-UAB-Stipendium.

die Verwendung von Tieren, die in den folgenden Abschnitten beschriebenen genehmigt wurde, durch die Ethikkommission für Tier- und Human Research von der Universitat Autònoma de Barcelona und Handelsverträge d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ich Alimentació von der Generalitat de Catalunya (Protokoll #8741).
 1. Feeder Zelle Inaktivierung und Lagerung Hinweis: menschliche Vorhaut Fibroblasten (HFF-1) in 1 mL eiskalte Lösung bestehend aus 90 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 10 % Dimethyl Sulfoxid (vorher eingefroren wurden DMSO) und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gespeichert.
<ol><li>Auftauen eine kryogene Phiole der HFF-1 (1 mL) durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen.</li>
	<li>Vorgewärmt Dulbecco den aufgetauten Inhalt der kryogenen Durchstechflasche hinzufügen &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS zu einem 01:10 Verdünnung.</li>
	<li>Saatgut die verdünnten Zellen (10 mL) in einem T75 Kolben und Kultur sie bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Am nächsten Tag ändern das Medium, die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.</li>
	<li>Kultur der HFFs und das Medium alle 48 h verändern, bis die Kultur der konfluierende Stadium erreicht. Dies dauert etwa 7 bis 10 Tage.</li>
	<li>, Bereiten Sie die Inaktivierung Lösung verdünnen Mitomycin C in DMEM mit 10 % ergänzt FBS auf eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Inkubation der Zellen mit der Inaktivierung Lösung für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Die Inaktivierung Lösung entfernen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 2 mL von Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Mitomycin C Reste zu beseitigen.</li>
	<li>Um die inaktivierten Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Beobachten die Zellen unter einem inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass sie getrennt (10 X Objektiv mit 0,3 numerische Apertur oder NA). Wenn sie nicht sind, brüten sie für ein paar Minuten bei 37 ° C und 5 % CO 2. Überprüfen Sie die Zellen wieder unter die inversen Mikroskop.</li>
	<li>Die Lösung mit einer Pasteurpipette pipette, um die Zelle Klumpen zu distanzieren.</li>
	<li>Neutralisieren die enzymatische Lösung durch Zugabe von 4 mL DMEM mit 10 % FBS und Aufschwemmen ergänzt.</li>
	<li>Ein Aliquot der Zellsuspension und machen eine 1: 100 Verdünnung in HBSS. Um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, laden 10 µL der Verdünnung in einer Neubauer &#39; s-Kammer. Zählen der Zellen in einer der großen Plätze der Kammer unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit einem 0,45 NA).
	<ol><li>Wiederholung die Zählung in insgesamt vier große Quadrate. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen (N) n = durchschnittliche Anzahl von Zellen gezählt x Gesamtvolumen x Verdünnung X 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Zentrifugieren dem Rest der Probe für 5 min bei 200 X g. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen der Pellets mit dem Einfrieren Lösung mit einer Konzentration von 10 6 Zellen pro mL.</li>
	<li>Aliquot Suspension in kryogenen Fläschchen mit 10 6 Zellen (1 mL) jeder. Die kryogenen Fläschchen in einem eiskalten Behälter legen und Einfrieren bei-80 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag speichern die kryogenen Fläschchen in Flüssigstickstoff.</li>
</ol> 2. Feeder-Zellkultur <ol><li>bis zu vier Tage vor der Ableitung, Tauwetter eine kryogene Fläschchen mit 1 x 10 6 inaktiviert HFF-1-Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° c</li>
	<li>Stellen eine Verdünnung von 1:6 des aufgetauten HFF-1 in DMEM ergänzt mit 10 % FBS und halten die Temperatur bei 37 vorgewärmt ° c</li>
	<li>Jeder Brunnen ein 4-Well-Platte mit 500 µL vorgewärmten 0,2 % Gelatine aus Schweinehaut füllen und halten Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min.</li>
	<li>500 µL von Gelatine aus den Brunnen zu entfernen und fügen Sie 500 µL HFFs-Verdünnung. Schütteln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung des HFFs auf der Unterseite der Brunnen zu gewährleisten. Vermeiden Sie Kreisbewegungen, sonst werden die Zellen in der Mitte des Brunnens konzentrieren.</li>
	<li>Inkubieren die Platte mindestens 24 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 eine Monolage von inaktivierten HFFs in jede Vertiefung erhalten.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Zellen unter einem inversen Mikroskop (10 X-Objektiv mit 0,3 NA) beobachten und überprüfen, dass sie befestigt und homogen verteilt. Ändern Sie das Medium, um die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und fügen 500 µL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.</li>
</ol> 3. Embryo-Sammlung und Kultur <ol><li>vier Tage vor dem Embryo Sammlung verwalten 5 IU trächtige Stute &#39; s Serum Gonadotropin durch intraperitoneale Injektion, 6-12 Wochen alten weiblichen Mäusen. 
	Hinweis: Wir haben Weibchen aus dem 129S2 oder B6CFAF1 Stämme verwendet, obwohl Weibchen aus anderen Mausstämme verwendet werden können. Dennoch, wenn arbeiten mit Weibchen aus non-permissive Stämme (z. B. CBA), Medium sollte ergänzt werden mit 2i wie unter Schritt 4.2.</li>
	<li>Nach 48 h, 5 IE humanes Choriongonadotropin durch intraperitoneale Injektion verabreichen und paaren sich die Weibchen mit Männchen, mindestens 8 Wochen alt, im Verhältnis 1:1. Die Weibchen von den Männchen am nächsten Tag trennen.</li>
	<li>Am Vortag Embryo Sammlung, vorbereiten eine 35-mm-Zellkultur Petrischale mit mehreren 40 µL Tropfen des KSOMaag Mediums ergänzt mit 4 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen die Platte mit Mineralöl, die Tropfen in vollem Umfang abdecken. Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C und 5 % CO 2 auf das Medium equilibrate.</li>
	<li>Embryo Manipulation Pipetten, Vorbereitung erhitzen den dünneren Teil eines langen Spitzen Glases Pasteurpipette mit dem Bunsenbrenner. Sobald weich, die Flamme entziehen Sie und ziehen Sie die beiden Enden auseinander. Brechen sie auf die gewünschte Länge. Der innere Durchmesser an der Spitze sollte 100-150 µm.</li>
	<li>Einschläfern der weiblichen Mäusen durch zervikale Dislokation 45-48 h Post Coitum (p.c.).</li>
	<li>Sezieren die Mäuse um die Bauchhöhle verfügbar machen, indem die Haut mit einer gebogenen glatt scharfen Schere und das Bauchfell mit gerade scharfen Schere schneiden. Eine Gebärmutter mit Zange greifen, die Eileiter mit gerade scharfen Schere abgeschnitten und legen Sie sie in Hepes gepufferten CZB Medium (HCZB) 13 bei 37 ° c wiederholen Sie den Vorgang, der andere Eileiter entfernen.</li>
	<li>Flush die Eileiter mit einer 1 mL Spritze mit HCZB geladen gehalten von Uhrmacher-Pinzette, die 2 Zellen Embryonen zu sammeln. 
	Hinweis: Um der Spülung Nadel nehmen eine 30 G Injektionsnadel vorzubereiten, schneiden Sie das Ende und zu einer stumpfen Spitze auf einem Schleifstein geschliffen.</li>
	<li>Mit der Mund-Pipette-Apparat, die Embryonen abholen, waschen Sie sie in HCZB und Kultur sie in der Kulturschale vorbereitete Embryo bei 37 ° C und 5 % CO 2 bis zum Blastozystenstadium. Bis zu 50 Embryonen können in jedem Tropfen 40 µL kultiviert werden. Überwachen der Embryonalentwicklung alle 24 h unter einem Stereomikroskop. 
	Hinweis: Alternativ können Embryonen im Blastozystenstadium in Vitro Embryonenkultur verkürzen gesammelt werden. In diesem Fall einschläfern Sie den Weibchen am Tag 3,5-4,5 p.c., sezieren Sie die Gebärmutter zu. und spülen Sie es mit HCZB.</li>
</ol> 4. Stem Cell Ableitung <ol><li>Vorbereitung der Ableitung Platten <ol><li>am Tag der Embryo Aussaat, bereiten die Ableitung Medium durch Ergänzung DMEM Medium mit 100 µM 2-β-Mercaptoethanol, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren , 20 % der Serum-Ersatz und 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Auf Wunsch auch hinzufügen 1 µM von der MEK-Inhibitor PD0325901 und 3 µM GSK3-Inhibitor CHIR99021 2i Medium zu erhalten.</li>
		<li>Nehmen die 4-Well-Platte mit der Monolage von inaktivierten HFFs (Schritt 2,6) von der Inkubator. Entfernen Sie das Medium und jedes gut fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium hinzu. Die Platte in den Inkubator zurück.</li>
	</ol></li> <li>Zona Pellucida Entfernung und Embryo Aussaat <ol><li>Vorbereitung eine 35 mm-Zellkultur Petrischale mit drei 30 µL Tropfen der sauren Tyrode &#39; s Lösung 14 und drei 30 µL Tropfen Ableitung Medium. Decken die Tropfen mit Mineralöl und halten Sie die Schüssel bei 37 ° c</li>
		<li>Nehmen die Embryo-Kulturschale aus dem Inkubator. Eins nach dem anderen, übertragen die Blastozysten von Kultur-Tropfen auf einen sauren Tyrode &#39; s Lösung Tropfen mit einem Embryo Manipulation Pipette. Wenn möglich, wählen Sie nur die erweiterte Blastozysten um die Ableitung zu starten.</li>
		<li>Überwachen die Zona Pellucida Verdauung unter dem Stereomikroskop. Sobald die Zona Pellucida verschwindet, übertragen die Blastozyste zu einer Ableitung Mittel um die sauren Tyrode auszuwaschen &#39; s Lösung.</li>
		<li>Nehmen die Ableitung 4-Well Platte aus Inkubator und Samen einer Zona-freie Blastozyste auf die Zuführung Zellen in jedem Bohrloch.</li>
		<li>Rückkehr die Ableitung 4-Well-Platte zum Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Monitoring Stammzellen Wachstum und Medium ändern <ol><li>Kulturen alle 24 h unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit 0,45 NA) zu überwachen. Es ist wichtig zu beachten, ob es Anzeichen von Stammzell-Differenzierung, z. B. geschwollenen refraktiven Zellen rund um den Auswuchs oder sogar schieben die Zuführung Zellen beiseite.</li>
		<li>Jeden zweiten Tag, das Medium der Kultur verändern. Nehmen Sie die 4-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie das Medium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium ergänzt mit LIF und 2i, hinzu, wenn verwendet. Pflegen die Kultur bis Auswüchse (6-8 Tage) eingehalten werden.</li>
	</ol></li></ol> 5. Stammzelle-Kultur und Wartung <ol><li>Prepare Kolle-ähnliche Griffe und Stammzellen Manipulation Pipetten. Folgen Sie Schritt 3.4 vorzubereitende Stammzell-Manipulation Pipetten mit einem Innendurchmesser an der Spitze von 250-300 µm. verwenden andererseits zog Pasteurpipette Kolle-ähnlichen Griff vorzubereiten. Erhitzen und gestalten Sie es bis zum Erreichen eines Hakens.</li>
	<li>Kultur 4-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und zu den Auswuchs unter einem Stereomikroskop suchen. Verwenden Sie den Griff um die differenzierte Zellen und die Anleger, die den Auswuchs umgeben wegzudrücken. 
	Hinweis: Zur Vermeidung von eventuellen Differenzierung der Auswuchs ist es wichtig, die differenzierte Zellen vom Rand der Auswuchs entfernen.</li>
	<li>Auswuchs mit einer Stammzelle Manipulation Pipette abzusaugen und legen Sie sie in ein neues Gericht in einem 50 µL Trypsin-EDTA Tropfen.</li>
	<li>Verwenden ein Skalpell zu den Auswuchs in mehrere Teile geschnitten, um es sowohl mechanisch als auch enzymatisch disaggregieren.</li>
	<li>Sofort, übertragen die Auswuchs Fragmente zu einem frischen Tropfen Ableitung Medium Trypsin Aktion neutralisieren.</li>
	<li>Übertragen die Auswuchs Fragmente auf einen neuen 4-Well-Platte mit einem monomolekularen Film Feeder. Übertragen Sie bis zu 10 Fragmente pro Bohrloch und Kultur sie mit Ableitung Medium bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Pflegen die Stammzell-ähnliche Kulturen für mindestens sechs Wochen vor der Prüfung der mESC-Linie gegründet. Das Medium verändern, jeden anderen Tag und Subkultur ihnen einmal pro Woche.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Obwohl mESC Linie Ableitung ein bekannter Verfahren routinemäßig in vielen Laboratorien eingesetzt wird, ist der Wirkungsgrad nicht immer so hoch wie erwartet aufgrund der multiplen Faktoren, die Aufrechterhaltung der Pluripotenz stören können. In diesem Artikel zeigen wir Schritt für Schritt, wie man mESC Linien mit hohen Wirkungsgraden über ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zu etablieren. Diese Effizienz sind ähnlich denen in der Literatur beschrieben.
Um maximale Effizienz z...

Embryonale Stammzellen (ESC) sind pluripotente Zellen aus Präimplantations Embryonen, die behalten die Fähigkeit, selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen1zu unterscheiden. Basierend auf diesen Eigenschaften, ESC sind ein nützliches Werkzeug für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und Tissue engineering Studium2geworden.
ESC wurden zum ersten Mal von Präimplantationsdiagnostik Mäuseembryonen, mit ESC (mESC) Mauslinien mit geringen Erfolg3,4Ursprung abgeleitet. Jahrelang blieb der Herleitung Wirkungsgrad niedrig wegen der Schwierigkeit der Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Vitro. Außerdem das Vorhandensein von Feeder Zellen5, die Ableitung effizienter zu gestalten, Kolonie Anlage fördern und verbessern karyotypic Stabilität6, einige Modifikationen von den Protokoll führen zu einer Verbesserung der Pluripotenz Wartung. Die wichtigsten waren die Zugabe von Leukämie hemmenden Faktor (LIF), mESC Kulturmedium7,8, die Verwendung von Embryonen aus dem 129S2 permissive Hintergrund9 und die Kultur der mESC mit Medium ergänzt mit definierten Serum, frei von möglichen Differenzierung Faktoren10. Vor kurzem hat zwingende Beweise gezeigt, dass Zusatz von einem Cocktail aus zwei kleinen Molekül-Modulatoren der Signalwege, die mESC Kulturmedium (bekannt als 2i) am besten, Pluripotenz beizubehalten. Die 2i cocktail besteht aus einer Kombination von MEK-Inhibitor PD0325901, die die Differenzierung Signale reduziert durch die Hemmung des Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weges, und der GSK3β-Inhibitor CHIR99021, die Zelle Überleben bei geringer Dichte verbessert durch die Aktivierung der Wnt-Signalweg-11.
In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches Protokoll um effizient mESC Linien von Maus Blastozysten abzuleiten. Wir folgen Standardverfahren, Kultivierung der Embryonen von freizügigen Belastungen für Feeder-Zellen in Ableitung Medium mit LIF und ein Serum-Ersatz-12ergänzt. Nach diesem Protokoll mESC Linien kann mit Wirkungsgraden Äquivalent zu denen, die in 2i Medium abgeleitet werden. Trotzdem können 2i hinzugefügt werden, um mögliche Probleme mit Pluripotenz Wartung oder beim Arbeiten mit nicht-freizügigen Belastungen zu vermeiden.

<table><tbody><tr><td>1 mL sryringe</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>2-&amp;beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>4-well plate</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>176740</td><td></td></tr><tr><td>Acidic Tyrode&#039;s solution&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&amp;ordm;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&amp;ordm;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A3311</td><td></td></tr><tr><td>Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-21200</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &amp;alpha;SMA and AFP mouse antibodies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CHIR990212</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1386</td><td>Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CryoTube</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>3754518</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>41640</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>BioWest</td><td>L0107</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>BioWest</td><td>S1810</td><td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&amp;ordm;C. Aliquot and store at -20&amp;ordm;C</td></tr><tr><td>Flushing needle</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>304000</td><td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td></tr><tr><td>Gelatin from porcine skin</td><td>Fluka</td><td>48724</td><td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td></tr><tr><td>Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td><td>Molecular Probes - Invitrogen</td><td>A-11037</td><td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>BioWest</td><td>L0611</td><td></td></tr><tr><td>Hepes-buffered CZB&amp;nbsp;</td><td>Home-made</td><td></td><td>See composition in Chatot et al, 1989</td></tr><tr><td>Human chorionic gonadotropin</td><td>Divasa-Farmavic</td><td>Veterin-Corion 3000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Human foreskin fibroblasts</td><td>ATCC</td><td>ATCCSCRC-1041</td><td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp;10828-028</td><td>Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&amp;ordm;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>KSOMaag Evolve</td><td>Zenith Biotech</td><td>ZEKS-050</td><td>Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&amp;ordm;C and 5% CO2 a day prior to use.</td></tr><tr><td>Leukemia Inhibitory Factor</td><td>Merk Millipore</td><td>ESG1106</td><td></td></tr><tr><td>Mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River/Harlan</td><td></td><td>It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mineral oil</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>Embryo tested. Photosensitive.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Serva</td><td>2980501</td><td>Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&amp;ordm;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mouse anti-tubulin &amp;beta; III (Tuj1)</td><td>Biolegend</td><td>MMS-435P</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-&amp;alpha;SMA</td><td>Sigma</td><td>A5228</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti-AFP</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>MAB1368</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Mouse monoclonal anti Oct3/4&amp;nbsp;</td><td>Santa cruz</td><td>Sc-5279</td><td>1:50 dilution</td></tr><tr><td>Non-Essential Amino Acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>PD0325901</td><td>Axon Medchem&amp;nbsp;</td><td>1408</td><td>Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&amp;ordm;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td></tr><tr><td>Petri dish (35mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>153066</td><td></td></tr><tr><td>Petri dish (60mm)</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Pregnant mare&#039;s serum gonadotropin</td><td>Foligon</td><td>Foligon-1000 UI</td><td>Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&amp;ordm;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Rabbit policlonal anti-Sox2</td><td>Merck Millipore</td><td>AB5603</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>T75 falcon</td><td>Thermo Scientific</td><td>130190</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 10x</td><td>BioWest</td><td>X0930</td><td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td></tr></tbody></table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

Maus embryonalen Stammzellen (mESC) Ableitung ist der Prozess, durch welche, den pluripotenten Zelllinien aus preimplantation Embryos ansässig sind. Diese Zeilen erhalten die Möglichkeit, entweder selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften mESC sind ein nützliches Werkzeug in der regenerativen Medizin, Krankheit Modellierung und Gewebe Ingenieurstudium. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Protokoll mESC Linien mit hoher Ableitung Wirkungsgraden (60-80 %) erhalten durch Kultivierung Blastozysten von freizügigen Mausstämme Feeder-Zellen in definierten Mediums mit Leukämie hemmenden Faktor ergänzt. Das Protokoll kann auch angewendet werden um effizient mESC Linien nicht freizügig Mausstämme, abgeleitet durch die einfache Zugabe von einem Cocktail aus zwei kleine Molekül-Inhibitoren auf die Ableitung Medium (2i Medium). Einzelheiten über die Vorbereitung und die Kultur der Feeder-Zellen, Sammlung und Maus-Embryonen und Ableitung und Kultur mESC Linien stehen zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Ausrüstung und kann in jedem Labor mit grundlegenden Säugerzelle Kultur Expertise durchgeführt werden.

Nach diesem Protokoll sollte mehr als 95 % der Auswuchs Bildung nach der ersten Woche der Kultur (Abbildung 1A) erreicht werden. MESC Linien nach sechs Passagen sind Variable unter experimentellen Wiederholungen mit eine durchschnittliche Erfolgsquote von 60-80 %. Die Zugabe von 2i deutlich verbessert nicht die Ergebnisse bei der Arbeit mit freizügigen Mausstämme, z. B. mit einem 129S2 Hintergrund, aber es ist notwendig, bei der Arbeit mit nicht-freizügige...

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Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Aufrufe.  Universitat Autònoma de Barcelona. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Serie: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Entwicklungsbiologie

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass. 


The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both medical applications and as a research 
tool for addressing fundamental questions in development and disease. Here, we provide a 
concise, step-by-step protocol for the derivation of human embryonic stem cells from embryos 
by immunosurgical isolation of the inner cell mass.

Gewinnung menschlicher embryonaler Stammzellen durch Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Application of Mouse Parthenogenetic Haploid Embryonic Stem Cells as a Substitute of Sperm

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an oocyte by a spermatozoon creates a totipotent zygote. Recently, several publications have reported that haploid embryonic stem cells (haESCs) can be a substitute for gametic genomes and contribute to embryos, which develop into mice. Here, we present a protocol to apply parthenogenetic haESCs as a substitute of sperm to construct embryos by intracytoplasmic injection into oocytes. This protocol consists of steps for preparing haESCs as sperm replacement, for injection of haESC chromosomes into oocytes, and for culture of semi-cloned embryos. The embryos can yield fertile semi-cloned mice after embryo transfer. Using haESCs as sperm replacement facilitates genome editing in the germline, studies of embryonic development, and investigation of genomic imprinting.

This article aims to demonstrate the use of parthenogenetic haploid embryonic stem cells as a substitute for sperm for the construction of semi-cloned embryos.

Anwendung von Maus parthenogenetischen Haploid embryonalen Stammzellen als Ersatz für Sperma

In organisms with sexual reproduction, germ cells are the source of totipotent cells that develop into new individuals. In mice, fertilization of an ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

Generation der Mäuse aus induzierten pluripotenten Stammzellen

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

Studying germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult due to low cell numbers and their location deep within developing embryos. The availability of a "closed" in vitro based system could prove invaluable for our understanding of gametogenesis. The formation of oocyte-like cells (OLCs) from somatic stem cells, isolated from newborn mouse skin, has been demonstrated and can be visualized in this video protocol. The resulting OLCs express various markers consistent with oocytes such as Oct4 , Vasa , Bmp15, and Scp3. However, they remain unable to undergo maturation or fertilization due to a failure to complete meiosis. This protocol will provide a system that is useful for studying the early stage formation and differentiation of germ cells into more mature gametes. During early differentiation the number of cells expressing Oct4 (potential germ-like cells) reaches ~5%, however currently the formation of OLCs remains relatively inefficient. The protocol is relatively straight forward though special care should be taken to ensure the starting cell population is healthy and at an early passage.

Differentiation of Newborn Mouse Skin Derived Stem Cells into Germ-like Cells In vitro

In recent years the formation of germ cells using in vitro culture methods has been demonstrated using several different types of somatic stem cells. This article will visually present the differentiation of newborn mouse derived stem cells to early oocyte-like cells.

Differenzierung von Newborn Mäusehaut Derived Stem Cells in Germ-like Cells<em&gt; In-vitro-</em

Studying  germ cell formation and differentiation has traditionally been very difficult  due to low cell numbers and their location deep within developing ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Zellmarkierung und Einspritzung in Entwicklungs embryonalen Maus-Herzen

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...