Wir danken Jonatan Lucas für seine technische Unterstützung mit Feeder-Zellkultur, Servei Estabulari De La UAB für Tierpflege und Domènec Martín für die Videoaufnahme. Diese Arbeit wurde unterstützt vom Ministerio de Economia y Competitividad AGL2014-52408-R und Generalitat de Catalunya 2014 SGR-524. MVC ist ein PIF-UAB-Stipendium.

die Verwendung von Tieren, die in den folgenden Abschnitten beschriebenen genehmigt wurde, durch die Ethikkommission für Tier- und Human Research von der Universitat Autònoma de Barcelona und Handelsverträge d &#39; Agricultura, Ramaderia, Pesca ich Alimentació von der Generalitat de Catalunya (Protokoll #8741).
 1. Feeder Zelle Inaktivierung und Lagerung Hinweis: menschliche Vorhaut Fibroblasten (HFF-1) in 1 mL eiskalte Lösung bestehend aus 90 % fetalen Bovine Serum (FBS) und 10 % Dimethyl Sulfoxid (vorher eingefroren wurden DMSO) und in flüssigem Stickstoff bis zum Gebrauch gespeichert.
<ol><li>Auftauen eine kryogene Phiole der HFF-1 (1 mL) durch das Fläschchen in einem 37 ° C Wasserbad eintauchen.</li>
	<li>Vorgewärmt Dulbecco den aufgetauten Inhalt der kryogenen Durchstechflasche hinzufügen &#39; s Modified Eagle &#39; s Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS zu einem 01:10 Verdünnung.</li>
	<li>Saatgut die verdünnten Zellen (10 mL) in einem T75 Kolben und Kultur sie bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Am nächsten Tag ändern das Medium, die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und 10 mL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.</li>
	<li>Kultur der HFFs und das Medium alle 48 h verändern, bis die Kultur der konfluierende Stadium erreicht. Dies dauert etwa 7 bis 10 Tage.</li>
	<li>, Bereiten Sie die Inaktivierung Lösung verdünnen Mitomycin C in DMEM mit 10 % ergänzt FBS auf eine Endkonzentration von 10 µg/mL. Inkubation der Zellen mit der Inaktivierung Lösung für 3 h bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Die Inaktivierung Lösung entfernen und spülen Sie die Zellen dreimal mit 2 mL von Hanks ausgewogen Salz Lösung (HBSS), Mitomycin C Reste zu beseitigen.</li>
	<li>Um die inaktivierten Zellen zu entfernen, fügen Sie 1 mL vorgewärmten Trypsin-EDTA-Lösung und inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Beobachten die Zellen unter einem inversen Mikroskop um sicherzustellen, dass sie getrennt (10 X Objektiv mit 0,3 numerische Apertur oder NA). Wenn sie nicht sind, brüten sie für ein paar Minuten bei 37 ° C und 5 % CO 2. Überprüfen Sie die Zellen wieder unter die inversen Mikroskop.</li>
	<li>Die Lösung mit einer Pasteurpipette pipette, um die Zelle Klumpen zu distanzieren.</li>
	<li>Neutralisieren die enzymatische Lösung durch Zugabe von 4 mL DMEM mit 10 % FBS und Aufschwemmen ergänzt.</li>
	<li>Ein Aliquot der Zellsuspension und machen eine 1: 100 Verdünnung in HBSS. Um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, laden 10 µL der Verdünnung in einer Neubauer &#39; s-Kammer. Zählen der Zellen in einer der großen Plätze der Kammer unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit einem 0,45 NA).
	<ol><li>Wiederholung die Zählung in insgesamt vier große Quadrate. Berechnen Sie die Gesamtzahl der Zellen (N) n = durchschnittliche Anzahl von Zellen gezählt x Gesamtvolumen x Verdünnung X 10 4.</li>
	</ol></li> <li>Zentrifugieren dem Rest der Probe für 5 min bei 200 X g. verwerfen den Überstand und Aufschwemmen der Pellets mit dem Einfrieren Lösung mit einer Konzentration von 10 6 Zellen pro mL.</li>
	<li>Aliquot Suspension in kryogenen Fläschchen mit 10 6 Zellen (1 mL) jeder. Die kryogenen Fläschchen in einem eiskalten Behälter legen und Einfrieren bei-80 ° c</li>
	<li>Am nächsten Tag speichern die kryogenen Fläschchen in Flüssigstickstoff.</li>
</ol> 2. Feeder-Zellkultur <ol><li>bis zu vier Tage vor der Ableitung, Tauwetter eine kryogene Fläschchen mit 1 x 10 6 inaktiviert HFF-1-Zellen in einem Wasserbad bei 37 ° c</li>
	<li>Stellen eine Verdünnung von 1:6 des aufgetauten HFF-1 in DMEM ergänzt mit 10 % FBS und halten die Temperatur bei 37 vorgewärmt ° c</li>
	<li>Jeder Brunnen ein 4-Well-Platte mit 500 µL vorgewärmten 0,2 % Gelatine aus Schweinehaut füllen und halten Sie die Platte bei 37 ° C für 10 min.</li>
	<li>500 µL von Gelatine aus den Brunnen zu entfernen und fügen Sie 500 µL HFFs-Verdünnung. Schütteln Sie die Platte, um eine gleichmäßige Verteilung des HFFs auf der Unterseite der Brunnen zu gewährleisten. Vermeiden Sie Kreisbewegungen, sonst werden die Zellen in der Mitte des Brunnens konzentrieren.</li>
	<li>Inkubieren die Platte mindestens 24 h bei 37 ° C und 5 % CO 2 eine Monolage von inaktivierten HFFs in jede Vertiefung erhalten.</li>
	<li>Am nächsten Tag die Zellen unter einem inversen Mikroskop (10 X-Objektiv mit 0,3 NA) beobachten und überprüfen, dass sie befestigt und homogen verteilt. Ändern Sie das Medium, um die DMSO-Reste zu beseitigen. Entfernen Sie das Medium und fügen 500 µL vorgewärmten DMEM mit 10 % ergänzt FBS.</li>
</ol> 3. Embryo-Sammlung und Kultur <ol><li>vier Tage vor dem Embryo Sammlung verwalten 5 IU trächtige Stute &#39; s Serum Gonadotropin durch intraperitoneale Injektion, 6-12 Wochen alten weiblichen Mäusen. 
	Hinweis: Wir haben Weibchen aus dem 129S2 oder B6CFAF1 Stämme verwendet, obwohl Weibchen aus anderen Mausstämme verwendet werden können. Dennoch, wenn arbeiten mit Weibchen aus non-permissive Stämme (z. B. CBA), Medium sollte ergänzt werden mit 2i wie unter Schritt 4.2.</li>
	<li>Nach 48 h, 5 IE humanes Choriongonadotropin durch intraperitoneale Injektion verabreichen und paaren sich die Weibchen mit Männchen, mindestens 8 Wochen alt, im Verhältnis 1:1. Die Weibchen von den Männchen am nächsten Tag trennen.</li>
	<li>Am Vortag Embryo Sammlung, vorbereiten eine 35-mm-Zellkultur Petrischale mit mehreren 40 µL Tropfen des KSOMaag Mediums ergänzt mit 4 mg/mL Rinderserumalbumin (BSA) und füllen die Platte mit Mineralöl, die Tropfen in vollem Umfang abdecken. Inkubieren Sie die Schüssel bei 37 ° C und 5 % CO 2 auf das Medium equilibrate.</li>
	<li>Embryo Manipulation Pipetten, Vorbereitung erhitzen den dünneren Teil eines langen Spitzen Glases Pasteurpipette mit dem Bunsenbrenner. Sobald weich, die Flamme entziehen Sie und ziehen Sie die beiden Enden auseinander. Brechen sie auf die gewünschte Länge. Der innere Durchmesser an der Spitze sollte 100-150 µm.</li>
	<li>Einschläfern der weiblichen Mäusen durch zervikale Dislokation 45-48 h Post Coitum (p.c.).</li>
	<li>Sezieren die Mäuse um die Bauchhöhle verfügbar machen, indem die Haut mit einer gebogenen glatt scharfen Schere und das Bauchfell mit gerade scharfen Schere schneiden. Eine Gebärmutter mit Zange greifen, die Eileiter mit gerade scharfen Schere abgeschnitten und legen Sie sie in Hepes gepufferten CZB Medium (HCZB) 13 bei 37 ° c wiederholen Sie den Vorgang, der andere Eileiter entfernen.</li>
	<li>Flush die Eileiter mit einer 1 mL Spritze mit HCZB geladen gehalten von Uhrmacher-Pinzette, die 2 Zellen Embryonen zu sammeln. 
	Hinweis: Um der Spülung Nadel nehmen eine 30 G Injektionsnadel vorzubereiten, schneiden Sie das Ende und zu einer stumpfen Spitze auf einem Schleifstein geschliffen.</li>
	<li>Mit der Mund-Pipette-Apparat, die Embryonen abholen, waschen Sie sie in HCZB und Kultur sie in der Kulturschale vorbereitete Embryo bei 37 ° C und 5 % CO 2 bis zum Blastozystenstadium. Bis zu 50 Embryonen können in jedem Tropfen 40 µL kultiviert werden. Überwachen der Embryonalentwicklung alle 24 h unter einem Stereomikroskop. 
	Hinweis: Alternativ können Embryonen im Blastozystenstadium in Vitro Embryonenkultur verkürzen gesammelt werden. In diesem Fall einschläfern Sie den Weibchen am Tag 3,5-4,5 p.c., sezieren Sie die Gebärmutter zu. und spülen Sie es mit HCZB.</li>
</ol> 4. Stem Cell Ableitung <ol><li>Vorbereitung der Ableitung Platten <ol><li>am Tag der Embryo Aussaat, bereiten die Ableitung Medium durch Ergänzung DMEM Medium mit 100 µM 2-β-Mercaptoethanol, 1 x nicht-essentiellen Aminosäuren , 20 % der Serum-Ersatz und 10 3 U/mL LIF.</li>
		<li>Auf Wunsch auch hinzufügen 1 µM von der MEK-Inhibitor PD0325901 und 3 µM GSK3-Inhibitor CHIR99021 2i Medium zu erhalten.</li>
		<li>Nehmen die 4-Well-Platte mit der Monolage von inaktivierten HFFs (Schritt 2,6) von der Inkubator. Entfernen Sie das Medium und jedes gut fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium hinzu. Die Platte in den Inkubator zurück.</li>
	</ol></li> <li>Zona Pellucida Entfernung und Embryo Aussaat <ol><li>Vorbereitung eine 35 mm-Zellkultur Petrischale mit drei 30 µL Tropfen der sauren Tyrode &#39; s Lösung 14 und drei 30 µL Tropfen Ableitung Medium. Decken die Tropfen mit Mineralöl und halten Sie die Schüssel bei 37 ° c</li>
		<li>Nehmen die Embryo-Kulturschale aus dem Inkubator. Eins nach dem anderen, übertragen die Blastozysten von Kultur-Tropfen auf einen sauren Tyrode &#39; s Lösung Tropfen mit einem Embryo Manipulation Pipette. Wenn möglich, wählen Sie nur die erweiterte Blastozysten um die Ableitung zu starten.</li>
		<li>Überwachen die Zona Pellucida Verdauung unter dem Stereomikroskop. Sobald die Zona Pellucida verschwindet, übertragen die Blastozyste zu einer Ableitung Mittel um die sauren Tyrode auszuwaschen &#39; s Lösung.</li>
		<li>Nehmen die Ableitung 4-Well Platte aus Inkubator und Samen einer Zona-freie Blastozyste auf die Zuführung Zellen in jedem Bohrloch.</li>
		<li>Rückkehr die Ableitung 4-Well-Platte zum Inkubator und Kultur bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	</ol></li> <li>Monitoring Stammzellen Wachstum und Medium ändern <ol><li>Kulturen alle 24 h unter einem inversen Mikroskop (20 X Objektiv mit 0,45 NA) zu überwachen. Es ist wichtig zu beachten, ob es Anzeichen von Stammzell-Differenzierung, z. B. geschwollenen refraktiven Zellen rund um den Auswuchs oder sogar schieben die Zuführung Zellen beiseite.</li>
		<li>Jeden zweiten Tag, das Medium der Kultur verändern. Nehmen Sie die 4-Well-Platte aus dem Inkubator, entfernen Sie das Medium aus jedem Bohrloch und fügen Sie 800 µL vorgewärmten Ableitung Medium ergänzt mit LIF und 2i, hinzu, wenn verwendet. Pflegen die Kultur bis Auswüchse (6-8 Tage) eingehalten werden.</li>
	</ol></li></ol> 5. Stammzelle-Kultur und Wartung <ol><li>Prepare Kolle-ähnliche Griffe und Stammzellen Manipulation Pipetten. Folgen Sie Schritt 3.4 vorzubereitende Stammzell-Manipulation Pipetten mit einem Innendurchmesser an der Spitze von 250-300 µm. verwenden andererseits zog Pasteurpipette Kolle-ähnlichen Griff vorzubereiten. Erhitzen und gestalten Sie es bis zum Erreichen eines Hakens.</li>
	<li>Kultur 4-Well-Platte aus dem Inkubator nehmen und zu den Auswuchs unter einem Stereomikroskop suchen. Verwenden Sie den Griff um die differenzierte Zellen und die Anleger, die den Auswuchs umgeben wegzudrücken. 
	Hinweis: Zur Vermeidung von eventuellen Differenzierung der Auswuchs ist es wichtig, die differenzierte Zellen vom Rand der Auswuchs entfernen.</li>
	<li>Auswuchs mit einer Stammzelle Manipulation Pipette abzusaugen und legen Sie sie in ein neues Gericht in einem 50 µL Trypsin-EDTA Tropfen.</li>
	<li>Verwenden ein Skalpell zu den Auswuchs in mehrere Teile geschnitten, um es sowohl mechanisch als auch enzymatisch disaggregieren.</li>
	<li>Sofort, übertragen die Auswuchs Fragmente zu einem frischen Tropfen Ableitung Medium Trypsin Aktion neutralisieren.</li>
	<li>Übertragen die Auswuchs Fragmente auf einen neuen 4-Well-Platte mit einem monomolekularen Film Feeder. Übertragen Sie bis zu 10 Fragmente pro Bohrloch und Kultur sie mit Ableitung Medium bei 37 ° C und 5 % CO 2.</li>
	<li>Pflegen die Stammzell-ähnliche Kulturen für mindestens sechs Wochen vor der Prüfung der mESC-Linie gegründet. Das Medium verändern, jeden anderen Tag und Subkultur ihnen einmal pro Woche.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Biswas, A., Hutchins, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells.">Embryonic stem cells.</a> Stem Cell Dev. 16 (2), 213-221 (2007).</li><li>Weinberger, L., Ayyash, M., Novershtern, N., Hanna, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+stem+cell+states:+naive+to+primed+pluripotency+in+rodents+and+humans.">Dynamic stem cell states: naive to primed pluripotency in rodents and humans.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 155-169 (2016).</li><li>Evans, M. J., Kaufman, M. 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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Obwohl mESC Linie Ableitung ein bekannter Verfahren routinemäßig in vielen Laboratorien eingesetzt wird, ist der Wirkungsgrad nicht immer so hoch wie erwartet aufgrund der multiplen Faktoren, die Aufrechterhaltung der Pluripotenz stören können. In diesem Artikel zeigen wir Schritt für Schritt, wie man mESC Linien mit hohen Wirkungsgraden über ein einfaches und zuverlässiges Protokoll zu etablieren. Diese Effizienz sind ähnlich denen in der Literatur beschrieben.
Um maximale Effizienz z...

Embryonale Stammzellen (ESC) sind pluripotente Zellen aus Präimplantations Embryonen, die behalten die Fähigkeit, selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen1zu unterscheiden. Basierend auf diesen Eigenschaften, ESC sind ein nützliches Werkzeug für die regenerative Medizin, Krankheit Modellierung und Tissue engineering Studium2geworden.
ESC wurden zum ersten Mal von Präimplantationsdiagnostik Mäuseembryonen, mit ESC (mESC) Mauslinien mit geringen Erfolg3,4Ursprung abgeleitet. Jahrelang blieb der Herleitung Wirkungsgrad niedrig wegen der Schwierigkeit der Aufrechterhaltung der Pluripotenz in Vitro. Außerdem das Vorhandensein von Feeder Zellen5, die Ableitung effizienter zu gestalten, Kolonie Anlage fördern und verbessern karyotypic Stabilität6, einige Modifikationen von den Protokoll führen zu einer Verbesserung der Pluripotenz Wartung. Die wichtigsten waren die Zugabe von Leukämie hemmenden Faktor (LIF), mESC Kulturmedium7,8, die Verwendung von Embryonen aus dem 129S2 permissive Hintergrund9 und die Kultur der mESC mit Medium ergänzt mit definierten Serum, frei von möglichen Differenzierung Faktoren10. Vor kurzem hat zwingende Beweise gezeigt, dass Zusatz von einem Cocktail aus zwei kleinen Molekül-Modulatoren der Signalwege, die mESC Kulturmedium (bekannt als 2i) am besten, Pluripotenz beizubehalten. Die 2i cocktail besteht aus einer Kombination von MEK-Inhibitor PD0325901, die die Differenzierung Signale reduziert durch die Hemmung des Mitogen-activated Protein Kinase (MAPK) Weges, und der GSK3β-Inhibitor CHIR99021, die Zelle Überleben bei geringer Dichte verbessert durch die Aktivierung der Wnt-Signalweg-11.
In diesem Artikel beschreiben wir ein einfaches Protokoll um effizient mESC Linien von Maus Blastozysten abzuleiten. Wir folgen Standardverfahren, Kultivierung der Embryonen von freizügigen Belastungen für Feeder-Zellen in Ableitung Medium mit LIF und ein Serum-Ersatz-12ergänzt. Nach diesem Protokoll mESC Linien kann mit Wirkungsgraden Äquivalent zu denen, die in 2i Medium abgeleitet werden. Trotzdem können 2i hinzugefügt werden, um mögliche Probleme mit Pluripotenz Wartung oder beim Arbeiten mit nicht-freizügigen Belastungen zu vermeiden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1125">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">1 mL sryringe</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:141px;">309628</td>
			<td style="width:524px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">2-&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">4-well plate</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">176740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:263px;">Acidic Tyrode&#39;s solution&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">See recipe in Nagy et al, 2003. For short-term storage (up to 1 month) keep it at 4&#186;C. Alternatively, for long-term storage keep it at -20&#186;C. If the efficiency of the solution diminishes, it should be acidified by the adition of a small drop of HCl 1M.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">BSA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A3311</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:263px;">Chicken anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 488</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-21200</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Oct4, Tuj1, &#945;SMA and AFP mouse antibodies.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">CHIR990212</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1386</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.15 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">CryoTube</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">3754518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMSO</td>
			<td style="width:199px;">Sigma</td>
			<td style="width:141px;">41640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">DMEM</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>L0107</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">FBS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td>S1810</td>
			<td>Inactivate it prior to use by heating for 30 mins at 56&#186;C. Aliquot and store at -20&#186;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Flushing needle</td>
			<td style="width:199px;">BD&#160;</td>
			<td>304000</td>
			<td>Cut the end of the needle and ground to a blunt tip on an abrasive stone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Gelatin from porcine skin</td>
			<td style="width:199px;">Fluka</td>
			<td>48724</td>
			<td>Dilute at 0,2% in destilled water and autoclave it. Each dilution can be used for a month.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 594</td>
			<td>Molecular Probes - Invitrogen</td>
			<td style="width:141px;">A-11037</td>
			<td>1:500 dilution. Secondary antibody for Sox2 rabbit antibody.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">HBSS</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">L0611</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Hepes-buffered CZB&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Home-made</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td>See composition in Chatot et al, 1989</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Human chorionic gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Divasa-Farmavic</td>
			<td style="width:141px;">Veterin-Corion 3000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human foreskin fibroblasts</td>
			<td style="width:199px;">ATCC</td>
			<td style="width:141px;">ATCCSCRC-1041</td>
			<td>For long term storage it is recommended to store them in liquid nitrogen.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:199px;">Life Technologies</td>
			<td>&#160;10828-028</td>
			<td style="width:524px;">Photosensitive. It is recommended to aliquot it in small volumes such as 10 ml and store it at -20&#186;C (check the expiration date). Avoid freeze and thaw cycles.&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">KSOMaag Evolve</td>
			<td style="width:199px;">Zenith Biotech</td>
			<td style="width:141px;">ZEKS-050</td>
			<td style="width:524px;">Supplement with 4 mg/ml BSA. Equilibrate at 37&#186;C and 5% CO2 a day prior to use.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Leukemia Inhibitory Factor</td>
			<td style="width:199px;">Merk Millipore</td>
			<td>ESG1106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:263px;">Mice&#160;</td>
			<td style="width:199px;">Charles River/Harlan</td>
			<td style="width:141px;"></td>
			<td style="width:524px;">It is recommended to use mice from a permissive strain in terms of mESC derivation (such as 129S2 or C57BL). However, inbreed strains are less efficient producing embryos. Therefore, it is recomended to use a hybrid strain, such as 129S2 x C57BL or B6CBAF1 to take advantage of the hybrid vigor.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410</td>
			<td>Embryo tested. Photosensitive.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">Mitomycin C</td>
			<td style="width:199px;">Serva</td>
			<td>2980501</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute the powder with MilliQ water at 0.5 mg/ml. Store at 4&#186;C protected from light. Attention, it is harmful and suspected of causing cancer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse anti-tubulin &#946; III (Tuj1)</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td style="width:141px;">MMS-435P</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-&#945;SMA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:141px;">A5228</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti-AFP</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:141px;">MAB1368</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Mouse monoclonal anti Oct3/4&#160;</td>
			<td>Santa cruz</td>
			<td style="width:141px;">Sc-5279</td>
			<td>1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Non-Essential Amino Acids</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11140-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:263px;">PD0325901</td>
			<td style="width:199px;">Axon Medchem&#160;</td>
			<td style="width:141px;">1408</td>
			<td style="width:524px;">Reconstitute with 2.08 ml DMSO for each mg of powder, to obtain a 1 mM stock solution. Aliquot at desired volume and store at -20&#186;C. Avoid freeze and thaw cycles.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (35mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td style="width:141px;">153066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Petri dish (60mm)</td>
			<td>Thermo Scientific Nunc</td>
			<td>150288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:263px;">Pregnant mare&#39;s serum gonadotropin</td>
			<td style="width:199px;">Foligon</td>
			<td>Foligon-1000 UI</td>
			<td style="width:524px;">Dilute in NaCl 0.9% at 50 IU/ml. Aliquot it in 1 ml and store at -20&#186;C for up to two months. Once thawed do not freeze again.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Rabbit policlonal anti-Sox2</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td style="width:141px;">AB5603</td>
			<td>1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">T75 falcon</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:141px;">130190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:263px;">Trypsin-EDTA 10x</td>
			<td style="width:199px;">BioWest</td>
			<td style="width:141px;">X0930</td>
			<td>Dilute 1:10 in HBSS to obtain a 1x solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

derivation of stem cell lines from mouse preimplantation embryos

Maus embryonalen Stammzellen (mESC) Ableitung ist der Prozess, durch welche, den pluripotenten Zelllinien aus preimplantation Embryos ansässig sind. Diese Zeilen erhalten die Möglichkeit, entweder selbst zu erneuern oder unter bestimmten Bedingungen zu unterscheiden. Aufgrund dieser Eigenschaften mESC sind ein nützliches Werkzeug in der regenerativen Medizin, Krankheit Modellierung und Gewebe Ingenieurstudium. Dieser Artikel beschreibt ein einfaches Protokoll mESC Linien mit hoher Ableitung Wirkungsgraden (60-80 %) erhalten durch Kultivierung Blastozysten von freizügigen Mausstämme Feeder-Zellen in definierten Mediums mit Leukämie hemmenden Faktor ergänzt. Das Protokoll kann auch angewendet werden um effizient mESC Linien nicht freizügig Mausstämme, abgeleitet durch die einfache Zugabe von einem Cocktail aus zwei kleine Molekül-Inhibitoren auf die Ableitung Medium (2i Medium). Einzelheiten über die Vorbereitung und die Kultur der Feeder-Zellen, Sammlung und Maus-Embryonen und Ableitung und Kultur mESC Linien stehen zur Verfügung. Dieses Protokoll erfordert keine speziellen Ausrüstung und kann in jedem Labor mit grundlegenden Säugerzelle Kultur Expertise durchgeführt werden.

Nach diesem Protokoll sollte mehr als 95 % der Auswuchs Bildung nach der ersten Woche der Kultur (Abbildung 1A) erreicht werden. MESC Linien nach sechs Passagen sind Variable unter experimentellen Wiederholungen mit eine durchschnittliche Erfolgsquote von 60-80 %. Die Zugabe von 2i deutlich verbessert nicht die Ergebnisse bei der Arbeit mit freizügigen Mausstämme, z. B. mit einem 129S2 Hintergrund, aber es ist notwendig, bei der Arbeit mit nicht-freizügige...

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Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Ableitung von Stammzelllinien aus Präimplantations Mausembryonen

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.3K Aufrufe.  Universitat Autònoma de Barcelona. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, um effizient leiten und Kultur pluripotenten Stammzelllinien aus Maus-Embryonen im Blastozystenstadium.

Serie: Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

Ableitung von Herzvorläuferzellen aus embryonalen Stammzellen

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

Effiziente Ableitung von Retinapigmentepithel-Zellen aus Stammzellen

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

Derivation of Highly Purified Cardiomyocytes from Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Small Molecule-modulated Differentiation and Subsequent Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes available for basic research and translational applications. To differentiate hiPSCs into cardiomyocytes, various protocols including embryoid body (EB)-based differentiation and growth factor induction have been developed. However, these protocols are inefficient and highly variable in their ability to generate purified cardiomyocytes. Recently, a small molecule-based protocol utilizing modulation of Wnt/&#946;-Catenin signaling was shown to promote cardiac differentiation with high efficiency. With this protocol, greater than 50%-60% of differentiated cells were cardiac troponin-positive cardiomyocytes were consistently observed. To further increase cardiomyocyte purity, the differentiated cells were subjected to glucose starvation to specifically eliminate non-cardiomyocytes based on the metabolic differences between cardiomyocytes and non-cardiomyocytes. Using this selection strategy, we consistently obtained a greater than 30% increase in the ratio of cardiomyocytes to non-cardiomyocytes in a population of differentiated cells. These highly purified cardiomyocytes should enhance the reliability of results from human iPSC-based in vitro disease modeling studies and drug screening assays.

Here, we describe a robust protocol for human cardiomyocyte derivation that combines small molecule-modulated cardiac differentiation and glucose deprivation-mediated cardiomyocyte purification, enabling production of purified cardiomyocytes for the purposes of cardiovascular disease modeling and drug screening.

Ableitung von Highly Purified Kardiomyozyten aus Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen mit Small Molecule modulierte Differenzierung und anschließende Glucose Starvation

Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CMs) have become an important cell source to address the lack of primary cardiomyocytes ...

Establishment of Genome-edited Human Pluripotent Stem Cell Lines: From Targeting to Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human development and investigate the pathophysiology of disease. By employing site-specific nucleases (SSNs) for genome editing, the rapid derivation of new hPSC lines harboring specific genetic alterations in an otherwise isogenic setting becomes possible. Zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs) and clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 are the most commonly used SSNs. All of these nucleases function by introducing a double stranded DNA break at a specified site, thereby promoting precise gene editing at a genomic locus. SSN-meditated genome editing exploits two of the cell&#39;s endogenous DNA repair mechanisms, non-homologous end joining (NHEJ) and homology directed repair (HDR), to either introduce insertion/deletion mutations or alter the genome using a homologous repair template at the site of the double stranded break. Electroporation of hPSCs is an efficient means of transfecting SSNs and repair templates that incorporate transgenes such as fluorescent reporters and antibiotic resistance cassettes. After electroporation, it is possible to isolate only those hPSCs that incorporated the repair construct by selecting for antibiotic resistance. Mechanically separating hPSC colonies and confirming proper integration at the target site through genotyping allows for the isolation of correctly targeted and genetically homogeneous cell lines. The validity of this protocol is demonstrated here by using all three SSN platforms to incorporate EGFP and a puromycin resistance construct into the AAVS1 safe harbor locus in human pluripotent&#160;stem cells.

Genome editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) can be done quickly and efficiently. Presented here is a robust experimental procedure to genetically engineer hPSCs as exemplified by editing the AAVS1 safe harbor locus to express EGFP and introduce antibiotic resistance.

Einrichtung von Genom bearbeitet humanen pluripotenten Stammzelllinien: Von Targeting zur Isolation

Genome-editing of human pluripotent stem cells (hPSCs) provides a genetically controlled and clinically relevant platform from which to understand human ...

Quantitative Analysis of Protein Expression to Study Lineage Specification in Mouse Preimplantation Embryos

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for embryo collection, immunofluorescence, imaging on a confocal microscope, and image segmentation and analysis are described. This method allows quantitation of the expression of multiple nuclear markers and the spatial (XYZ) coordinates of all cells in the embryo. It takes advantage of MINS, an image segmentation software tool specifically developed for the analysis of confocal images of preimplantation embryos and embryonic stem cell (ESC) colonies. MINS carries out unsupervised nuclear segmentation across the X, Y and Z dimensions, and produces information on cell position in three-dimensional space, as well as nuclear fluorescence levels for all channels with minimal user input. While this protocol has been optimized for the analysis of images of preimplantation stage mouse embryos, it can easily be adapted to the analysis of any other samples exhibiting a good signal-to-noise ratio and where high nuclear density poses a hurdle to image segmentation (e.g., expression analysis of embryonic stem cell (ESC) colonies, differentiating cells in culture, embryos of other species or stages, etc.).

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analysis of protein expression to study lineage specification in mouse preimplantation embryos. The procedures necessary for collection of blastocysts, whole-mount immunofluorescent detection of proteins, imaging of samples on a confocal microscope, and nuclear segmentation and image analysis are described.

Quantitative Analyse der Proteinexpression zu studieren Lineage Spezifikation in Maus Präimplantationsembryonen

This protocol presents a method to perform quantitative, single-cell in situ analyses of protein expression to study lineage specification in mouse ...

Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Verlust- und Gewinn-of-function-Ansatz Frühe Zellschicksal Bestimmungsfaktoren in Preimplantation Maus Embryonen zur Untersuchung

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

Feeder-free Derivation of Melanocytes from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can direct the differentiation of hPSCs into the cell type of interest by manipulating the culture conditions to recapitulate signals seen during development. One such cell type is the melanocyte, a pigment-producing cell of neural crest (NC) origin responsible for protecting the skin against UV irradiation. This protocol presents an extension of a currently available in vitro Neural Crest differentiation protocol from hPSCs to further differentiate NC into fully pigmented melanocytes. Melanocyte precursors can be enriched from the Neural Crest protocol via a timed exposure to activators of WNT, BMP, and EDN3 signaling under dual-SMAD-inhibition conditions. The resultant melanocyte precursors are then purified and matured into fully pigmented melanocytes by culture in a selective medium. The resultant melanocytes are fully pigmented and stain appropriately for proteins characteristic of mature melanocytes.

This work describes an in vitro differentiation protocol to produce pigmented, mature melanocytes from human pluripotent stem cells via a neural crest and melanoblast intermediate stage using a feeder-free, 25 day protocol.

Feeder freie Ableitung von Melanozyten aus humanen pluripotenten Stammzellen

Human pluripotent stem cells (hPSCs) represent a platform to study human development in vitro under both normal and disease conditions. Researchers can ...

Affinity Labeling Detection of Endogenous Receptors from Zebrafish Embryos

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish embryos has been implemented. This technique takes advantage of the selectivity and sensitivity conferred by affinity labeling of a given receptor by its ligand with the specificity of the immunoprecipitation. We have used AFLIP to detect the type III TGF-&#946; receptor (TGFBR3), also know as betaglycan, during early zebrafish development. AFLIP was instrumental in validating the efficacy of a TGFBR3 morphant zebrafish phenotype. In the first step, embryo protein extracts are prepared and used to generate 125I-TGF-&#946;2-TGFBR3 complexes that are purified by immunoprecipitation. Later, these complexes are covalently cross-linked and revealed using SDS-PAGE separation and autoradiography detection. This technique requires the availability of a labeled ligand for, and a specific antibody against, the receptor to be detected, and shall be easily adapted to identify any growth factor or cytokine receptor that meets these requirements.

A novel technique for the detection of low abundance endogenous receptors present in zebrafish embryos is described. We have named it AFLIP because it consists of affinity labeling of the receptor by its ligand linked to immunoprecipitation.

Affinitatsmarkierung Nachweis endogener Receptors von Zebrafischembryonen

By combining the powers of Affinity Labeling and Immunoprecipitation (AFLIP), a technique for the detection of low abundance receptors in zebrafish ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using different methods. Here, we produced iPS cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system. All obtained iPS cell lines exhibited characteristics of pluripotent cells, including the ability to differentiate toward derivatives of all three germ layers in vitro and in vivo. This strategy opens up the possibility of using cells from diseased fetuses to develop new therapies for birth defects.

In this study, we generate induced pluripotent stem cells from mouse amniotic fluid cells, using a non-viral-based transposon system.

Die Herstellung von pluripotenten Stammzellen aus Maus Fruchtwasserzellen ein Transposon-System verwenden

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

Integration Free Derivation of Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) cells. Maintenance of hiPS cells on feeder cells or undefined matrices are susceptible to batch variances, pathogenic contamination and risk of immunogenicity. Utilizing the defined recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix in combination with xeno-free and defined media formulations reduces variability and allows for the consistent generation of hiPS cells. The Sendai virus (SeV) vector is a non-integrating RNA-based system, thus circumventing concerns associated with the potential disruptive effect on genome integrity integrating vectors can have. Furthermore, these vectors have demonstrated relatively high efficiency in the reprogramming of dermal fibroblasts. In addition, enzymatic single cell passaging of cells facilitates homogeneous maintenance of hiPS cells without substantial prior experience of stem cell culture. Here we describe a protocol that has been extensively tested and developed with a focus on reproducibility and ease of use, providing a robust and practical way to generate defined and xeno-free human hiPS cells from fibroblasts.

Robust derivation of human induced pluripotent stem (hiPS) cells was achieved by using non-integrating Sendai virus (SeV) vector mediated reprogramming of dermal fibroblasts. hiPS cell maintenance and clonal expansion was performed using xeno-free and chemically defined culture conditions with recombinant human laminin 521 (LN-521) matrix and Essential E8 (E8) Medium.

Integration Freie Ableitung von human induzierten pluripotenten Stammzellen mit Laminin 521 Matrix

Xeno-free and fully defined conditions are key parameters for robust and reproducible generation of homogenous human induced pluripotent stem (hiPS) ...