Die Autoren bedanken sich bei Nada Naffakh und Marie-Anne Rameix-Welti (Institut Pasteur) für die rWSN-PB2-Strep Virus danken.

<html> Ein schematisches Flussdiagramm des Protokolls ist in gezeigt. 1 und eine Tabelle von Reagenzien wird unten dargestellt. 1. Infection (16 - 24 h) <ol><li> Samen aus HeLa-Zellen in 5 150 mm Zellkulturschalen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) hohen Glucose-Medium, so dass sie erreichen etwa 80% Konfluenz wurden die folgenden Tag (etwa 5 × 10 8 Zellen). Es ist wichtig, dass die Zellen nicht erreichen 100% Konfluenz. </li><li> Am nächsten Tag, verdünnen Strep-Tag Influenza Virus-Stock in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) mit 0,3% Rinderserumalbumin (BSA) mit einer Multiplizität der Infektion von 3. </li><li> Entfernen des Wachstumsmediums von den Zellen einmal mit PBS gewaschen, und 10 ml PBS, enthaltend das Virus zu den Zellen. Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur. </li><li> Ersetzen Sie die Infektion mit DMEM Medium-High Glucose, und weiterhin Inkubation bei 37 ° C. </li></ol>&quot;&gt; Die Länge der Inkubationszeit hängt von der Phase der Infektion zu untersuchen (siehe Diskussion) werden. 2. Subzelluläre Fraktionierung (3 h) <ol><li> Waschen der Zellen einmal mit kaltem PBS gewaschen und dann auszusetzen Zellen in kaltem PBS mit einem Gummischaber und in einen 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Pellet-Zellen in einer Tischzentrifuge für 5 min bei 1.000 rpm und dann absaugen PBS. </li><li> Resuspendieren Zellpellet wurde in 10 ml kaltem Saccharose-Puffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10 mM KCl, 2 mM Mg-Acetat (MgOAc), 3 mM CaCl 2, 340 mM Saccharose, 1 mM Dithiothreitol (DTT), 1% Protease-Inhibitor-Mix) . Nach Aussetzung, passieren Zellen durch eine 200 pl Pipettenspitze an einem 10 ml Kunststoff-Pipette Serum zu Zellklumpen zu stören. </li><li> Inkubieren Sie 10 min auf Eis. Sanft in regelmäßigen Abständen zu invertieren, um Zellen zu resuspendieren. </li><li> In Nonidet P-40 (NP-40) bis zu einer Endkonzentration von 0,5% und Wirbel mit hoher Geschwindigkeit für 15 Sekunden. Sofort für 10 min zentrifugieren bei 3.500 × g bei 4 ° C in einer Table-Top-KreiselpumpenGE. </li><li> Überstand entfernen und lagern bei 4 ° C. Dies ist die cytoplasmatische Fraktion. Das Pellet sollte kleiner und weißer als der ursprüngliche Zellpellet. Alle Fraktionen für mindestens 4 h bei 4 ° C gelagert werden </li><li> Waschen Sie das Pellet in 5 ml kaltem Saccharose-Puffer, Re-Zentrifuge, wie in Schritt 2,5 und den Überstand verwerfen. </li><li> Das Pellet (mit Kernen) in 1,5 ml kaltem nukleoplasmatischen Extraktionspuffer (50 mM HEPES pH 7,9, 150 mM KOAc, 1,5 mM MgCl 2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% Protease-Inhibitor-Mix). </li><li> Transfer zu einem gekühlten, Ganzglas-4 ml Dounce Homogenisator mit einem eng anliegenden Stößel und homogenisieren die Kerne mit 20 Schlägen. Vermeiden Sie Schaumbildung während der Homogenisierung. Der Widerstand sollte nach etwa 10 Schläge erhöhen. Effiziente Homogenisierung kann unter einem Phasenkontrast-Mikroskop bestätigt werden. </li><li> Übertragen des homogenisierten Kerne in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubieren 20 min auf einem rotierenden Rad bei 4 °C. </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Überstand entfernen und lagern bei 4 ° C. Dies ist die nukleoplasmatischen Fraktion. </li><li> Pellet in 1,5 ml Verdauung Puffer (50 mM HEPES pH 7,9, 10 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM DTT, 1% Protease-Inhibitor-Mix, 100 U / ml Benzonase (für RNA-Analyse, Ersatz mit 20 U / ml RNase -freier DNase I)) vorgewärmt auf 37 ° C, und die Platte 10 min bei 37 ° C </li><li> In 42 ul 5 M NaCl (für Endkonzentration von 150 mM NaCl) und inkubieren 20 min weiter bei 4 ° C </li><li> Zentrifuge bei 16.000 × g in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Überstand entfernen und lagern bei 4 ° C. Dies ist der CH150-Fraktion. </li><li> Pellet in 1,5 ml kaltem High-Salz-Puffer (50 mM HEPES pH 7,9, 500 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,1% NP-40, 1 mM DTT, 1% Protease-Inhibitor-Mix) und inkubieren 20 min auf Eis. </li><li> Zentrifugieren bei 16.000 x g &lt;/ Em&gt; in einer Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 10 min. </li><li> Überstand entfernen und lagern bei 4 ° C. Dies ist der CH500-Fraktion. </li></ol> 3. Strep-Tag Reinigung (2 h) <ol><li> Dann werden 300 ul 5 M NaCl zu der zytoplasmatischen Fraktion (für Endkonzentration von 150 mM NaCl). </li><li> Aliquotieren 100 ul verpackt Strep-Tactin Sepharosekügelchen pro Fraktion in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> 10 Volumina Strep Waschpuffer (20 mM HEPES pH 7,9, 150 mM NaCl (500 mM NaCl CH500 Proben), 1 mM EDTA), um die Kügelchen, das Röhrchen zu mischen, und 5 min zentrifugiert bei 1000 × g in einer Tischzentrifuge zentrifugieren. </li><li> Überstand verwerfen, wiederholen Sie Schritt 3,3 und dann zweimal resuspendieren den Wulst Pellet in einem gleichen Volumen von Strep Waschpuffer. </li><li> Fügen Sie 200 ul gewaschene Strep-Tactin Kügelchenaufschlämmung zu jeder Fraktion (in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen für nuceloplasmic, CH150, CH500 und Fraktionen und einem 15 ml konischen Röhrchen für cytoplasmatische Fraktion). </li><li> DrehenRöhrchen 1 h bei 4 ° C auf einem rotierenden Rad. </li><li> Zentrifugenröhrchen 1 min bei 1.000 × g bei 4 ° C Überstand verwerfen. </li><li> 1 ml kaltem Strep Waschpuffer in jedes Röhrchen. Übertragen Sie Perlen aus 15 ml Tube (cytoplasmatische Fraktion) bis 1,5 ml Röhrchen. Alle Röhrchen 1 min bei 4 ° C, Zentrifugieren nach wie in Schritt 3.7. Wiederholen Sie diesen Waschschritt zweimal. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt, entfernen Sie alle Spuren von Waschpuffer mit einem flachen Pipettenspitze. Geben Sie 100 ul Elutionspuffer (Strep-Waschpuffer mit 2,5 mM Desthiobiotin) und vorsichtig mischen. </li><li> Inkubieren für 15 Minuten auf Eis. Vorsichtig mischen Perlen gelegentlich durch Tippen auf den Boden der Rohre. </li><li> Zentrifugenröhrchen 1 min bei 1000 x g bei 4 ° C in Mikrozentrifuge. Sammle Überstand mit eluierten Strep-getaggten vRNPs. </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Die Effizienz der Fraktionierung besten durch Western-Blot-Analyse der aufgetrennten Lysaten unter Verwendung antib beurteiltOdies spezifischen Marker für subzelluläre (Abb. 2). Insbesondere sollte ein erfolgreiches subnuklearen Fraktionierung geringe oder keine zelluläre RNA-Polymerase II (Pol II) in der nukleoplasmatischen oder lösliche Kernfraktion 4 und am meisten sollte mit 150 mM NaCl 5 extrahiert werden. Ein Abbau von Pol II ist auch reproduzierbar in Influenza-Virus-infizierten Zellen im Vergleich zu nicht infizierten Zellen, in Übereinstimmung mit der Literatur 6 beobachtet. Reinigung von vRNPs wird am besten durch Silber oder Coomassie-Färbung beurteilt, wie für eine zytoplasmatische Eluat in gezeigt. 3. Nach unserer Erfahrung wird das meiste Strep-PB2 in als Teil eines vollständig geformten vRNP, dh wenig löslich Polymerase wird gefangen genommen gereinigt. PA/PB1/PB2 Verhältnis von Silber oder Coomassie-Färbung beobachtet: Dies wird in der hohen NP wider. Ein geringeres Verhältnis schlägt Puffer Kontamination mit RNasen, da mehrere allgegenwärtige RNasen (wie RNase A) zu spalten viralen RNA in einer solchen Weise, dass Dissoziation bekanntaß die Polymerase von NP-Multimere 7. Interessanterweise führte die Behandlung mit Benzonase allein, während die ausreicht, um virale RNA zu verdauen, scheint keinen Einfluss auf die stöchiometrischen Verhältnisse der vRNP Proteine ​​haben. Obwohl wir nicht erklären kann dieses Phänomen beobachteten wir Unterbrechung der vRNPs nach Verdau mit anderen RNasen (Daten nicht gezeigt), was darauf hindeutet, dass Benzonase verlassen können bestimmte strukturelle Bedeutung RNA-Regionen intakt. Nach Reinigung des vRNPs aus dem Zytoplasma und Zellkern (durchgeführt, ohne Nucleaseverdau) können 8 schwach, aber diskrete Banden bei hohen Molekulargewichten durch Silberfärbung, der den vorhergesagten Molekulargewichten der 8 Influenza Genomsegmente entsprechen (siehe ref. 3 beobachtet werden ). Die relativen Mengen der vRNPs von jeder Fraktion bei 9 h nach Infektion gereinigt werden in gezeigt. 4. Die Verteilung der vRNPs ändert sich im Verlauf der Infektion, mit der stärksten Anreicherung in der CH150-Fraktion zu einem frühen Zeitpunkt, underhöhte Akkumulation im Zellkern und Zytoplasma zu spät Zeitpunkten. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig1.jpg" alt="1"/> Abbildung 1. Flussdiagramm der subzellulären Fraktionierung. Abgewandelter Form aus Lit.. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig2.jpg" alt="2"/> 2. Western-Blot-Analyse der subzellulären Fraktionen aus Influenza-Virus-infizierten Zellen. 10 9 HeLa-Zellen wurden mit Virusstamm WSN 9 h vor subzelluläre Fraktionierung infiziert. Gleiche Mengen an Gesamtprotein wurden pro Spur geladen und unter Verwendung der Antikörper gezeigt. RNA Polymerase II (Pol II) wurde unter Verwendung von Klon 8WG16, die alle Formen des C-terminalen Domäne (die Band ist hypophosphorylierte prominentesten) erkennt. Abgewandelter Form aus Lit.. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig3.jpg" alt="Abbildung 3"/> Abbildung 3.Silberfärbung Analyse der gereinigten vRNPs. HeLa-Zellen wurden mit rWSN (als Negativkontrolle) oder rWSN-PB2-Strep für 9 h, Strep Reinigung aus der zytoplasmatischen Fraktion gefolgt infiziert. Asterisk bezeichnet Bands, die nicht sichtbar sind nach RNase-Verdauung. Abgewandelter Form aus Lit.. 3. <img src="/files/ftp_upload/4028/4028fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Silberfärbung Analyse vRNPs aus verschiedenen zellulären Fraktionen gereinigt. 10 9 HeLa-Zellen wurden mit rWSN-PB2-Strep oder rWSN für 9 h infiziert, gefolgt von subzelluläre Fraktionierung und Reinigung Strep. Gleiche Mengen des Eluats aus jeder Fraktion wurden geladen. Abgewandelter Form aus Lit.. 3.

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A., Zvirbilene, A., Zvirblis, G., Götz, V., Wolff, T., Naffakh, N., Schwemmle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influenza+virus+ribonucleoprotein+complexes+gain+preferential+access+to+cellular+export+machinery+through+chromatin+targeting.">Influenza virus ribonucleoprotein complexes gain preferential access to cellular export machinery through chromatin targeting.</a> PLoS Pathogens. 7, e1002187 (2011).</li><li>Kimura, H., Tao, Y., Roeder, R. G., Cook, P. 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G., Fodor, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+association+between+viral+and+cellular+transcription+during+influenza+virus+infection.">Functional association between viral and cellular transcription during influenza virus infection.</a> Rev. Med. Virol. 16, 329-345 (2006).</li><li>Schwartz, L. B., Sklar, V. E., Jaehning, J. A., Weinmann, R., Roeder, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+the+multiple+forms+of+deoxyribonucleic+acid-dependent+ribonucleic+acid+polymerase+in+the+mouse+myeloma,+MOPC+315.">Isolation and partial characterization of the multiple forms of deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase in the mouse myeloma, MOPC 315.</a> J. Biol. Chem. 249, 5889 (1974).</li><li>Lambert, J. P., Baetz, K., Figeys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+proteins+and+DNA--proteomic+role+in+the+field+of+chromatin+research.">Of proteins and DNA--proteomic role in the field of chromatin research.</a> Mol. Biosyst. 6, 30 (2010).</li><li>Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SUMOylation+of+matrix+protein+M1+modulates+the+assembly+and+morphogenesis+of+influenza+A+virus.">The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus.</a> J. Virol. 85, 6618 (2011).</li><li>Liao, T. L., Wu, C. Y., Su, W. C., Jeng, K. S., Lai, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination+of+NP+protein+regulates+influenza+A+virus+RNA+replication.">Ubiquitination and deubiquitination of NP protein regulates influenza A virus RNA replication.</a> EMBO J. 29, 3879 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Während viele Studien, die kürzlich einzelne Proteine ​​oder Mobilfunknetze in Influenzavirus-Infektion beteiligt sind 8 identifiziert haben, bleibt die funktionelle Bedeutung der meisten dieser Interaktionen unklar. Angesichts der absoluten Abhängigkeit von Chromatin-basierten Funktionen für Influenza-Virus RNA-Synthese und die komplexe biophysikalische und biochemische Natur des Kerns 9, werden neue Techniken erforderlich, um diese Funktionen aufzuklären. Die Fraktionierung subnuklearen ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM-Hochglycose </td><td> Gibco </td><td> 11965-092 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma </td><td> A9418 </td><td></td></tr><tr><td> Protease-Inhibitor Mix G </td><td> Serva </td><td> 39101 </td><td></td></tr><tr><td> Benzonase Nuclease </td><td> Novagen </td><td> 71206 </td><td> 25 U / ul </td></tr><tr><td> DNase I, RNase-frei </td><td> ThermoScientific </td><td> EN0523 </td><td> 50 U / ul </td></tr><tr><td> Dounce Homogenisator </td><td> Wheaton </td><td> 432-1271 </td><td> Benutze Typ &quot;B&quot; Pistill </td></tr><tr><td> Strep-Tactin Sepharose </td><td> IBA GmbH </td><td> 2-1201-025 </td><td> 50% igen Suspension Spalte kann auch dazu verwendet werden </td></tr><tr><td> Desthiobiotin </td><td> IBAGmbH </td><td> 2-1000-002 </td><td></td></tr></tbody></table>

affinity purification of influenza virus ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells

Wie alle Negativ-Strang-RNA-Viren, wird das Genom von Influenzaviren in Form von viralen Ribonukleoproteinkomplexe (vRNP), in dem die einzelsträngige Genoms durch das Nukleoprotein (NP) eingekapselt ist, und mit der Polymerase-Komplex aus trimeren verpackt der PA, PB1, PB2 und Untereinheiten. Allerdings, im Gegensatz zu den meisten RNA-Viren, Influenza-Viren führen virale RNA-Synthese in den Kernen der infizierten Zellen. Interessanterweise verwendet virale mRNA-Synthese zelluläre prä-mRNAs als Primer, und es wurde vorgeschlagen, dass dieser Prozess stattfindet Chromatin 1. Wechselwirkungen zwischen dem viralen Polymerase und der Wirts-RNA-Polymerase II, sowie zwischen NP und Host Nukleosomen wurden auch 1,2 ist. Vor kurzem hat die Erzeugung von rekombinanten Influenza Viren, die für eine Ein-Strep-Tag genetisch mit dem C-Terminus des PB2-Untereinheit der viralen Polymerase (rWSN-PB2-Strep 3) fusioniert hat seinen beschrieben. Diese rekombinanten Viren können die Reinigung von PB2-enthaltende Komplexe, einschließlich vRNPs, aus infizierten Zellen. Zur Gewinnung gereinigter vRNPs werden Zellkulturen infiziert und vRNPs sind affinitätsgereinigt aus Lysaten aus diesen Zellen abgeleitet. Allerdings haben die Lyse bisher angewandten auf einer Schritt-Detergens-Lyse, die, trotz der Gegenwart eines allgemeinen Nuklease, oft zu extrahieren Chromatin-gebundene Material nur ineffizient gestützt. Unsere Vorarbeiten schlug vor, dass ein großer Teil der nuklearen nicht vRNPs wurden während der traditionellen Zell-Lyse extrahiert, und konnte deshalb nicht Affinität gereinigt werden. Um diese Extraktion Effizienz zu steigern, und zur Trennung von nicht-nuklearen Chromatin-gebundenen vRNPs Chromatin-gebunden, passten wir einen stufenweisen Extraktion subzelluläre Protokoll, um Influenza-Virus-infizierten Zellen. Kurz gesagt, dieses Verfahren zuerst trennt die Kerne aus der Zelle und extrahiert dann lösliche nukleäre Proteine ​​(hier als die &quot;nukleoplasmatischen&quot;-Fraktion).Das verbleibende unlösliche nukleare Material wird dann mit Benzonase, ein unspezifischer DNA / RNA-Nuclease, die von zwei Salzgewinnung Schritte befolgt verdaut: zuerst mit 150 mM NaCl (genannt &quot;CH150&quot;), dann 500 mM NaCl (&quot;CH500&quot;) (Abb. 1 ). Diese Salzgewinnung Schritte wurden auf der Grundlage unserer Beobachtung gewählt, dass 500 mM NaCl ausreichend, um über 85% der nuklearen vRNPs solubilisieren dennoch erlauben die Bindung von getaggt vRNPs an die Affinitätsmatrix war. Nach subzelluläre Fraktionierung der infizierten Zellen, ist es möglich, Affinitätsreinigung PB2-markierten vRNPs von jedem einzelnen Fraktion und Analyse der Protein und RNA-Komponenten unter Verwendung von Western-Blot und Primer-Extension, jeweils. Vor kurzem verwendeten wir diese Methode, um diese vRNP Export Komplexe Form während des späten Punkte nach der Infektion auf der Chromatin-Fraktion mit 500 mM NaCl (CH500) 3 extrahiert entdecken.

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Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Influenza-Viren replizieren ihre RNA-Genom in Verbindung mit Host-Zell-Chromatin. Hier präsentieren wir eine Methode, um intakte virale Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin von infizierten Zellen zu reinigen. Gereinigten viralen Komplexe können sowohl durch Western-Blot und Primer-Extension von Protein-und RNA-Gehalt analysiert werden, beziehungsweise.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

affinity-purification-influenza-virus-ribonucleoprotein-complexes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

13.0K Aufrufe.  Universitätsklinikum Freiburg. Influenza-Viren replizieren ihre RNA-Genom in Verbindung mit Host-Zell-Chromatin. Hier präsentieren wir eine Methode, um intakte virale Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin von infizierten Zellen zu reinigen. Gereinigten viralen Komplexe können sowohl durch Western-Blot und Primer-Extension von Protein-und RNA-Gehalt analysiert werden, beziehungsweise.

Serie: Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally established in 1999 1,2 plasmid-based reverse genetic techniques to generate recombinant viruses have revolutionized the influenza research field because specific questions have been answered by genetically engineered, infectious, recombinant influenza viruses. Such studies include virus replication, function of viral proteins, the contribution of specific mutations in viral proteins in viral replication and/or pathogenesis and, also, viral vectors using recombinant influenza viruses expressing foreign proteins 3.

Rescue of influenza A viruses from plasmid DNA is a basic and essential experimental technique that allows influenza researchers to generate recombinant viruses to study multiple aspects in the biology of influenza virus, and to be used as potential vectors or vaccines.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

Forschung

Immunologie und Infektion

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe pneumonia "Legionnaires' disease"1. In protozoan and mammalian phagocytes, L. pneumophila employs a conserved mechanism to form a specific, replication-permissive compartment, the "Legionella-containing vacuole" (LCV). LCV formation requires the bacterial Icm/Dot type IV secretion system (T4SS), which translocates as many as 275 "effector" proteins into host cells. The effectors manipulate host proteins as well as lipids and communicate with secretory, endosomal and mitochondrial organelles2-4.
The formation of LCVs represents a complex, robust and redundant process, which is difficult to grasp in a reductionist manner. An integrative approach is required to comprehensively understand LCV formation, including a global analysis of pathogen-host factor interactions and their temporal and spatial dynamics. As a first step towards this goal, intact LCVs are purified and analyzed by proteomics and lipidomics.
The composition and formation of pathogen-containing vacuoles has been investigated by proteomic analysis using liquid chromatography or 2-D gel electrophoresis coupled to mass-spectrometry. Vacuoles isolated from either the social soil amoeba Dictyostelium discoideum or mammalian phagocytes harboured Leishmania5, Listeria6, Mycobacterium7, Rhodococcus8, Salmonella9 or Legionella spp.10. However, the purification protocols employed in these studies are time-consuming and tedious, as they require e.g. electron microscopy to analyse LCV morphology, integrity and purity. Additionally, these protocols do not exploit specific features of the pathogen vacuole for enrichment.
The method presented here overcomes these limitations by employing D. discoideum producing a fluorescent LCV marker and by targeting the bacterial effector protein SidC, which selectively anchors to the LCV membrane by binding to phosphatidylinositol 4-phosphate (PtdIns(4)P)3,11 . LCVs are enriched in a first step by immuno-magnetic separation using an affinity-purified primary antibody against SidC and a secondary antibody coupled to magnetic beads, followed in a second step by a classical Histodenz density gradient centrifugation12,13 (Fig. 1).
A proteome study of isolated LCVs from D. discoideum revealed more than 560 host cell proteins, including proteins associated with phagocytic vesicles, mitochondria, ER and Golgi, as well as several GTPases, which have not been implicated in LCV formation before13. LCVs enriched and purified with the protocol outlined here can be further analyzed by microscopy (immunofluorescence, electron microscopy), biochemical methods (Western blot) and proteomic or lipidomic approaches.

Purification of Pathogen Vacuoles from Legionella-infected Phagocytes

This article describes a method for the isolation and purification of intact Legionella-containing vacuoles (LCVs) from amoeba and macrophages. The two-step protocol comprises LCV enrichment by immuno-magnetic separation using an antibody against a bacterial LCV marker and further purification by density gradient centrifugation.

Die Reinigung von Pathogen Vakuolen aus<em&gt; Legionellen</em&gt;-Infizierten Phagozyten

The opportunistic pathogen Legionella pneumophila is an amoeba-resistant bacterium, which also replicates in alveolar macrophages thus causing the severe ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

Phenotypic and Functional Analysis of Activated Regulatory T Cells Isolated from Chronic Lymphocytic Choriomeningitis Virus-infected Mice

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance and homeostasis maintenance by regulating the immune response. The primary role of Treg cells is to suppress the proliferation of effector T (Teff) cells and the production of cytokines such as IFN-&#947;, TNF-&#945;, and IL-2. It has been demonstrated that Treg cells&#39; ability to inhibit the function of Teff cells is enhanced during persistent pathogen infection and cancer development. To clarify the function of Treg cells under resting or inflamed conditions, a variety of in vitro suppression assays using mouse or human Treg cells have been devised. The main aim of this study is to develop a method to compare the differences in phenotype and suppressive function between resting and activated Treg cells. To isolate activated Treg cells, mice were infected with lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) clone 13 (CL13), a chronic strain of LCMV. Treg cells isolated from the spleen of LCMV CL13-infected mice exhibited both the activated phenotype and enhanced suppressive activity compared with resting Treg cells isolated from na&#239;ve mice. Here, we describe the basic protocol for ex vivo phenotype analysis to distinguish activated Treg cells from resting Treg cells. Furthermore, we describe a protocol for the measurement of the suppressive activity of fully activated Treg cells.

Here, we describe a protocol to analyze the phenotype of regulatory T (Treg) cells isolated from na&#239;ve and chronic lymphocytic choriomeningitis virus-infected mice. In addition, we provide a process to evaluate the suppressive activity of the Treg cells.

Die phänotypische und funktionale Analyse von aktivierten regulatorischen T-Zellen isoliert von chronischer lymphatischer Choriomeningitisvirus-infizierte Mäuse

Regulatory T (Treg) cells, which express Foxp3 as a transcription factor, are subsets of CD4+ T cells. Treg cells play crucial roles in immune tolerance ...

Determination of Biofilm Initiation on Virus-infected Cells by Bacteria and Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with respect to how viral members of the microbiome affect subsequent microbe interactions with these virus-infected host cells. The co-habitation of virus with bacteria and fungi is principally present on the mucosal surfaces of the oral cavity and genital tract. Mucosal cells, particularly those with persistent chronic or persistent latent viral infections, could have a significant impact on members of the microbiome through virus alteration in number and type of receptors expressed. Modification in host cell membrane architecture would result in altered ability of subsequent members of the normal flora and opportunistic pathogens to initiate the first step in biofilm formation, i.e., adherence. This study describes a method for quantitation and visual examination of HSV&#39;s effect on the initiation of biofilm formation (adherence) of S. aureus and C. albicans.

A method is described herein for the determination of inter-Kingdom association and competition (bacterial and fungal) for adherence to virus-infected HeLa cell monolayers. This protocol can be extended to multiple combinations of prokaryotes, eukaryotes, and viruses.

Bestimmung von Biofilm Initiation auf Virus-infizierte Zellen durch Bakterien und Fungi

The study of polymicrobial interactions across the taxonomic kingdoms that include fungi, bacteria and virus have not been previously examined with ...

Generation of Escape Variants of Neutralizing Influenza Virus Monoclonal Antibodies

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface glycoproteins of the virus. The generation of escape variants is a powerful method in elucidating how viruses escape immune detection and in identifying critical residues required for antibody binding. Here, we describe a protocol on how to generate influenza A virus escape variants by utilizing human or murine monoclonal antibodies (mAbs) directed against the viral hemagglutinin (HA). With the use of our technique, we previously characterized critical residues required for the binding of antibodies targeting either the head or stalk of the novel avian H7N9 HA. The protocol can be easily adapted for other virus systems. Analyses of escape variants are important for modeling antigenic drift, determining single nucleotide polymorphisms (SNPs) conferring resistance and virus fitness, and in the designing of vaccines and/or therapeutics.

We describe a method by which we identify critical residues required for the binding of human or murine monoclonal antibodies that target the viral hemagglutinin of influenza A viruses. The protocol can be adapted to other virus surface glycoproteins and their corresponding neutralizing antibodies.

Generation von Escape Varianten des Influenza-Virus Monoclonal Antikörper neutralisieren

Influenza viruses exhibit a remarkable ability to adapt and evade the host immune response. One way is through antigenic changes that occur on the surface ...