Die Autoren wollen in Vergangenheit und Gegenwart Mitglieder in den Adolfo García-Sastre und Peter Palese Labors danken für die Entwicklung der Influenza reversen Genetik Techniken und Plasmide. Research in AG-S Labors wird teilweise durch CRIP, ein NIAID finanzierten Center of Excellence für Forschung und Influenza Surveillance (HHSN266200700010C) und durch NIAD gewährt R01AI046954, U01AI070469 und P01AI058113 finanziert. Research in LM-S Labor wird teilweise durch NIAID gewähren RO1AI077719 finanziert.

1. Influenza-Virus zu retten Transfektion Influenza A-Virus gehört zur Familie der Orthomyxoviridae negativen RNA-umhüllte Viren. Das Influenza-A-Virus-Genom besteht aus acht verschiedenen RNA-Gene von negativer Polarität, dass codieren mindestens 4 11 virale Proteine ​​(Abbildung 1). Wir konzentrieren wird, in diesem Bericht über die Rettung eines der am häufigsten Laborstamm, Influenza A/PR/8/34, 5 mit AmbiSense Plasmide (PDZ) mit der 8 Influenza A/PR/8/34 viralen Segmente ( Abbildung 2). Für die Rettung von rekombinanten Influenza-Viren von Plasmid-DNA, empfehlen wir 3 unabhängige Transfektionen pro rekombinanten Virus. Wenn mehr als ein rekombinantes Virus zu retten versucht wird, Skala die folgenden Schritte accordantly, um die Anzahl von Viren, gerettet zu werden. Die nach der Transfektion und Infektion Protokoll ist für 6-well-Platten hergestellt. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 3 dargestellt. <ol><li> OptiMEM-Lipofectamine 2000 (LPF2000) Mischung: Prepare 250 ul OptiMEM Medien und 6-8 pl LPF2000 pro Transfektion. Inkubieren für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (RT). Unterdessen bereiten sich die Plasmid-Transfektion Mischung. </li><li> Plasmid-Transfektion Mischung: Bereiten Sie die Plasmid-Transfektion Cocktail in 50 ul OptiMEM Medien. Wir verwenden normalerweise 1 pg jedes Influenza-DNA-Plasmid pro retten. Add 1 ul der PDZ-Plasmiden (bei 1 ug / ul) PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M und NS in ein Röhrchen mit 50 ul OptiMEM Medien. </li><li> OptiMEM-LPF2000-DNA-Plasmid-Gemisch: In 250 ul aus Schritt 1.1 in die Influenza-DNA-Plasmid-Transfektion Mischung (Schritt 1,2). Inkubieren Sie diese Mischung für 20-30 Minuten bei RT. In der Zwischenzeit bereiten Suspensionen von 293T und MDCK-Zellen für die Transfektion. </li><li> Vorbereitung der 293T/MDCK Co-Kultur: Bevor Sie beginnen, bringen die PBS 1X, DMEM 10% FBS 1% PS Medien und EDTA-Trypsin-Gemisch auf 37 ° C. Die Dichte der Zellen sollte bei 80-90% Konfluenz Tag der Transfektion werden. Normalerweise kann man konfluenten 100 mm Schale von 293T und einem konfluenten 100 mm Schale von MDCK-Zellen für 10-12 verwendet werden rettet. Wir werden 250 ul Zellen pro Vertiefung verwendet werden. Beide Zelllinien werden in insgesamt 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS resuspendiert werden. <ul><li> Vorsichtig resuspendieren jeder Zelllinie in 10 ml DMEM 10% FBS 1% PS in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen. Sie haben eine Röhre für 293T-Zellen und eine Tube für MDCK-Zellen. </li><li> Resuspendieren 293T-Zellen in 3 ml DMEM 10% FBS 1% PS und wenn resuspendiert, liefern die 3 ml der MDCK-Zellen, diese Zellen zu resuspendieren. Dadurch erhalten Sie die Mischung aus 293T und MDCK-Zellen für Ihre Co-Kultur verwendet werden. </li><li> Add 250 ul der 293T/MDCK Zellen pro Well (10-12 6-well Brunnen). </li></ul></li><li> Nach 20-30 Minuten RT Inkubation (Schritt 1,3), 1 ml DMEM 10% FBS 1% PS auf die OptiMEM-LPF2000-Influenza-DNA-Plasmid-Gemisch. </li><li> Fügen Sie die 1,3 ml (Schritt 1,5) in die Vertiefungen mit dem 250 ul 293T/MDCK Zellen (Schritt 1,4). </li><li> Schütteln Sie die 6-well-Platte und lassen Sie die Transfektion inkubiert über Nacht (ON) in den Brutschrank bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Am nächsten Tag, ca. 16-24 Stunden nach der Transfektion, ändern Sie die Transfektion Medien und inkubieren Sie die transfizierten Zellen in DMEM 0,3% BA 1% PS mit 1 pg / ml TPCK-Trypsin für 48 Stunden. </li><li> Nach 48 Stunden der Veränderung der Medien, den Überstand der transfizierten Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Centrifuge das Gewebe Kulturüberstand in einer Mikrozentrifuge für 1-2 Minuten, 13.000 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Infect frischen MDCK-Zellen in 6-well-Platten (vernickelt am Vortag) oder 10-Tage alten Hähnchen embryonierten Eier mit 200 ul zentrifugiert Gewebe Kulturüberständen von Schritt 1,10. Inkubieren Sie die Zellen und / oder Eier bei 37 ° C für 2-3 Tage. <ol><li> Die Infektion von 10-Tage alten Hähnchen embryonierten Eiern: Alle Verfahren, die Hühner embryonierten Eier infizieren werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. <ol><li> Candle die 10-Tage alte Eier mit einem Licht-Durchleuchten Feld, um die Schnittstelle zwischen den Luftsack und die Allantoishöhle sehen. Machen Sie einen Bleistift an der Schnittstelle Grenze. </li><li> Mit einer 5 ml Spritze Nadel ein Loch in die Eierschale. </li><li> Mit einer 1 ml Spritze zu infizieren jedes Ei mit 200 ul des Gewebes Kulturüberständen von Schritt 1,10. </li><li> Decken Sie das Loch in der Eierschale mit geschmolzenem Wachs mit einem Wattestäbchen. </li><li> Inkubieren Sie die infizierten Eiern 37οC für 2-3 Tage. </li></ol></li><li> Die Infektion von frischen MDCK-Zellen: Der Tag vor dem Durchgang der Gewebekultur Überstand aus der 293T/MDCK Co-Kulturen, vorpare 6-Well-Platte Gerichte mit MDCK-Zellen zu erreichen 80-90% Konfluenz am nächsten Tag. Normalerweise kann eine konfluente 100 mm Gewebekulturplatte in 6-8 Bohrungen aufgeteilt werden. Waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS 1X, trypsinize und bereiten die 6-well Platten. Vorsichtig von Hand schütteln die Platten, um eine gleichmäßige Verteilung der Zellen haben. Kultur der Zellen, ON, in der 37 ° C Inkubator, 5% CO 2. Vor der Infektion, überprüfen Sie die Zellen unter dem Mikroskop, um eine Monoschicht bestätigen, dann, mit der Infektion vor: <ul><li> Wash-Zellen, zweimal mit 1 ml PBS 1X. </li><li> Infect mit 200 ul zentrifugiert Gewebe Kulturüberständen für 1 Stunde bei RT. Lassen Sie sich nicht die Zellen trocknen. Rock the 6-well-Platte alle 10 Minuten. </li><li> Nach 1 Stunde virale Absorption, entfernen Sie die Infektion Medien aus dem MDCK-Zellen und 2 ml DMEM 0,3% BA 1% PS mit 1 pg / ml TPCK-Trypsin. </li><li> Bei 48-72 Stunden nach der Passage, in Abhängigkeit von der Transfektionseffizienz und der Viruslast, wird ein zytopathischen Effekts (CPE) in den MDCK infizierten Zellen beobachtet werden. CPE deutet auf eine erfolgreiche Rettung. Sollte jedoch ein HA-Test (Abschnitt 2) noch durchgeführt, um die Präsenz des Virus im Gewebe Kulturüberständen zu bestätigen. </li></ul></li></ol></li><li> Ernte Allantoisflüssigkeit von infizierten Hühnern embryonierten Eiern: Alle Verfahren, die Allantoisflüssigkeit aus infizierten Eiern Ernte werden unter sterilen Bedingungen durchgeführt. Etwa 8-12 ml des Allantoisflüssigkeit kann von jedem 10-day-old-infizierte Eier geerntet werden. Vor der Ernte der Allantoisflüssigkeit, bebrüten die Hühnereier für 2 Stunden (oder ON) bei 4 ° C, um den Hühnerembryo töten und Koagulation des Blutes. <ul><li> Waschen Sie die Eierschalen mit 70% Ethanol, um sterile Bedingungen zu schaffen. </li><li> Öffnen Sie das Ei vorsichtig über den Luftraum, indem Sie mit einem Löffel. Entfernen Sie die kaputte Eierschale mit Hilfe einer Pinzette. </li><li> Mit einer 1 ml Nadel, entfernen Sie die Allantois, ohne das Ei ist Eigelb. </li><li> Stabilisierung der Hühnerembryo mit einem Spatel, wie Sie einer 10 ml Pipette Führung in der Allantoisflüssigkeit. Sammeln Sie so viele Allantoisflüssigkeit wie möglich in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen auf Eis in einem Eiskübel, ohne zu brechen oder das Sammeln einer der Eizelle Dotter. Verwenden Sie ein 15 ml Zentrifugenröhrchen für jedes Ei. </li><li> Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 4 ° C und übertragen die Allantoisflüssigkeit (ohne Berücksichtigung pelletiert roten Blutkörperchen), um ein frisches 15 ml Zentrifugenröhrchen. </li><li> Bewahren Sie die Röhrchen mit dem zentrifugiert Allantoisflüssigkeit bei 4 ° C, bis sie auf das Vorhandensein von gerettet Virus mit einer Hämagglutination (HA)-Test überprüft. </li></ul></li></ol> 2. HA-Test, um die Rettung von rekombinanten Influenzaviren bestätigen Hämagglutinationstest (HA) wird routinemäßig verwendet werden, um die Anwesenheit der geretteten Virus in MDCK Zellkultur-Überstände und / oder der Allantoisflüssigkeit geerntet Eier zu erkennen. Alternativ können Immunfluoreszenz-Assays (IFA) auch durchgeführt werden. Sobald ein Test identifiziert die Anwesenheit von Viren befreit, sollte das Virus plaquegereinigt und die genetische Zusammensetzung des Virus wird durch RT-PCR und Sequenzierung bestätigt werden. Die Anwesenheit des Virus in den MDCK Zellkultur-Überstände und / oder in der Allantoisflüssigkeit aus infizierten Eiern bestimmt makroskopisch mit HA vom Huhn (oder einer anderen Quelle) roten Blutkörperchen (RBC) werden. Das Vorhandensein von Viren induziert Hämagglutination von RBC, während das Fehlen des Virus ermöglicht die Bildung einer rot Pellet am Boden des Brunnens (Abbildung 4). Im Fall von Influenza-Virus, wird angenommen, dass etwa 10 3 -10 4 Plaque-bildenden Einheiten (PFU) erforderlich sind, um ein positives Signal in den HA-Test geben, weshalb eine IFA können parallel mit dem HA-Test durchgeführt werden, um zu bestätigen ein wahres negatives Ergebnis. IFA mit primären anti-Influenza-Antikörper ist empfindlicher als die HA-Test, weil weniger als 103-104 Viren mit dieser Technik nachgewiesen werden kann. Es ist möglich, als Überstände oder Allantois-Flüssigkeit, die HA-negativ sind positiv von der IFA. In diesem Fall sollte das Virus durch Passagieren verstärkt werden, wieder in MDCK-Zellen oder in Eiern. Allantoisflüssigkeit und / oder Gewebe Kulturüberständen aus dem zweiten Durchgang sollte nun deutlich positiv in den HA-Test. HA-Assays sind in V-Boden 96-well-Platten durchgeführt. Negative (z. B. PBS 1X) und positive (tissue Kulturüberständen und / oder Allantoisflüssigkeit aus einer Influenzavirus-Infektion) Kontrollproben sollten immer in einer HA-Assay zu validieren einbezogen werden. <ul><li> Geben Sie 50 ul PBS 1X in jedes Well der V-Boden 96-Well-Platte. </li><li> Add 50 uldie MDCK Zellkultur-Überstände und / oder Allantoisflüssigkeit aus den infizierten Eiern in die erste Vertiefung und machen 2-fach serielle Verdünnungen für die folgenden Vertiefungen. Entsorgen Sie die zusätzlichen 50 ul aus den letzten gut. </li><li> Dann werden 50 ul von 0,5% -1,0% Huhn roten Blutkörperchen (hergestellt in PBS 1X) in jede Vertiefung. </li><li> Inkubieren Sie die V-Boden 96-Well-Platte für 30-45 Minuten (bis zu einem red dot ist sichtbar in den Boden einer negativen Kontrolle PBS Probe) auf Eis. Lesen und interpretieren die Ergebnisse wie in Abbildung 4 dargestellt. </li></ul> 3. Passage der Zellkultur-Überstände Ein negatives Ergebnis in der HA-Test kann eine Folge der niedrigen Transfektionseffizienz mit niedrigen Virus im Gewebe Kulturüberständen und / oder Allantoisflüssigkeit werden. Passage dieser Proben in frischem MDCK und / oder Bruteiern ermöglicht Verstärkung des Virus (wie in Abbildung 3 dargestellt) Infektionen sind wie zuvor in Abschnitt 1.11.2 beschrieben, durchgeführt. 4. Repräsentative Ergebnisse Erfolgreiche Influenza-Virus zu retten wird durch das Vorhandensein einer positiven HA-Assay (Abbildung 4) bestätigt werden. Darüber hinaus wird die Existenz von CPE in Zellen mit dem Gewebe Kulturüberständen oder mit dem Allantoisflüssigkeit aus Eiern infiziert deuten auf eine positive viral zu retten. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Influenza Virus-Struktur: Influenza-Virus wird durch eine Lipid-Doppelschicht, die beiden viralen Glykoproteine ​​(HA, NA) und, umgeben auch die Ionenkanal-Protein, M2. HA ist die virale Attachment-Protein, verantwortlich für die Bindung an Sialinsäure-haltige Rezeptoren. NA ist verantwortlich für virale Freisetzung von Wirtszellen. Unter der Lipid-Doppelschicht, ist ein Protein Schicht der inneren Oberfläche Umschlag Matrix Protein 1, M1, die eine Rolle spielt in Virionen und Knospen und die nukleare Export-Protein (NEP), für die nukleare Export viraler ribonucleocapsids erforderlich zusammen. Der Kern des Virus besteht aus einem ribonucleoprotein (RNP)-Komplex hergestellt, bestehend aus 8 einsträngige RNA negativ viralen Gene durch die virale Nukleoprotein, NP eingekapselt. Im Zusammenhang mit dem RNP-Komplex der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase-Untereinheiten PA, PB1, PB2 und. Die Nicht-Strukturproteine ​​NS1 und PB1-F2, durch die RNA-Segmente NS und PB1 bzw. kodiert, sind nicht Bestandteil des Virion-Struktur. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig2.jpg" alt="Abbildung 2" /> Abbildung 2. Influenza-Virus zu retten Plasmide: Die acht Influenza-Virus Gene in die AmbiSense Plasmid PDZ geklont werden angezeigt. PDZ Plasmid 6, aus dem Protein Expressionsplasmid pCAGGs 7 abgeleitet, ist eine bidirektionale Plasmidvektor mit einem menschlichen RNA-Polymerase I-Promotor und eine Maus Terminator-Sequenz, dass die negativen Sinne genomische RNA kodiert; in entgegengesetzter Orientierung auf der Polymerase I zu vereinen, eine Polymerase II Transkription Kassette (chicken β-Aktin-Promotor und polyA) kodiert für die viralen Proteine ​​aus der gleichen Virus-Gen. cDNAs aus jeder viralen Segment werden durch RT-PCR mit Vorwärts-und Rückwärts-Primer enthält die SAPI Restriktionsendonukleasestelle und die nicht-kodierenden Regionen der einzelnen Segmente (black boxes am Ende der viralen Gene) generiert. Das PCR-Produkt wird in den PDZ mit Sap-I verdaut geklont. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig3.jpg" alt="Abbildung 3" /> Abbildung 3. Acht-Plasmid-basierte Influenza-Rescue-System: PDZ Plasmide, welche der 8 Influenza Virus-Gene sind co-transfiziert, in Suspension, in 293T-MDCK-Zellen Co-Kulturen (Tag 1). Vierundzwanzig Stunden nach der Transfektion, Medien, ohne FBS aber mit TPCK / Trypsin ersetzt wird (Tag 2). Achtundvierzig Stunden nach dem Wechsel Medien, wird das Gewebe Kulturüberstand geerntet und verwendet werden, um MDCK oder 10-Tage alten bebrüteten Hühnereiern (Tag 4) zu infizieren. 48-72 Stunden nach der Amplifikation, Gewebe Kulturüberständen von MDCK infizierten Zellen oder Allantoisflüssigkeit aus Eiern werden geerntet und auf Vorhandensein von Viren durch HA (Tag 6). Wenn kein Virus entdeckt wird, kann die gleiche Überstände und / oder Allantois-Flüssigkeit in frisch MDCK Zellen und / oder Bruteiern wieder passagiert werden. <img src="/files/ftp_upload/2057/2057fig4.jpg" alt="Abbildung 4" /> Abbildung 4. Hämagglutinin-Assay (HA): Hemagglutination von RBC durch Virus-Partikel ist makroskopisch sichtbar und ist die Basis für virale Partikel im Gewebe Kulturüberständen und / oder Allantois-Flüssigkeit zu erkennen. Obwohl die HA-Test unterscheidet nicht zwischen viralen Partikel, die infektiös sind und Partikel, die abgebaut werden und nicht mehr in der Lage, Zellen zu infizieren sind, diskriminieren, ist der Test ein guter Indikator für Vorhandensein von Viren in Proben. A) die Abwesenheit (oben) von Präsenz (unten) des Virus in den biologischen Proben wird durch die Anwesenheit von RBC in der Unterseite der Platte oder ihre Abwesenheit, bzw. ermitteltectively. B) Ein repräsentatives Ergebnis aus einer HA-Test ohne nachweisbare Mengen des Virus (oben) oder Anwesenheit (unten) des Virus gezeigt.

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	<li>Neumann, G., Watanabe, T., Ito, H., Watanabe, S., Goto, H., Gao, P., Hughes, M., Perez, D. R., Donis, R., Hoffmann, E., Hobom, G., Kawaoka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+influenza+A+viruses+entirely+from+cloned+cDNAs.">Generation of influenza A viruses entirely from cloned cDNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 9345-9350 (1999).</li><li>Fodor, E., Devenish, L., Engelhardt, O. G., Palese, P., Brownlee, G. G., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rescue+of+influenza+A+virus+from+recombinant+DNA.">Rescue of influenza A virus from recombinant DNA.</a> J Virol. 73, 9679-9682 (1999).</li><li>Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+influenza+virus+vectors.">Recombinant influenza virus vectors.</a> Future Virology. 2, 401-416 (2007).</li><li>Palese, P., Shaw, M. L., Knipe, D. M., Howley, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthomyxoviridae.+The+viruses+and+their+replication.">Orthomyxoviridae. The viruses and their replication.</a> Fields Virology. , 1647-1689 (2006).</li><li>Schickli, J. H., Flandorfer, A., Nakaya, T., Martinez-Sobrido, L., Garcia-Sastre, A., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-only+rescue+of+influenza+A+virus+vaccine+candidates.">Plasmid-only rescue of influenza A virus vaccine candidates.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 356, 1965-1973 (2001).</li><li>Quinlivan, M., Zamarin, D., Garcia-Sastre, A., Cullinane, A., Chambers, T., Palese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attenuation+of+equine+influenza+viruses+through+truncations+of+the+NS1+protein.">Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the NS1 protein.</a> J Virol. 79, 8431-8439 (2005).</li><li>Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+selection+for+high-expression+transfectants+with+a+novel+eukaryotic+vector.">Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.</a> Gene. 108, 193-199 (1991).</li></ol>

Mount Sinai School of Medicine hat die geistigen Eigentumsrechte im Bereich der rekombinanten Influenza-Viren, und AG-S ist ein Erfinder in diesem geistigen Eigentums.

Rettung von rekombinanten Influenza-Viren von Plasmid-DNA ist ein einfacher und unkomplizierter Vorgang, sobald das Protokoll routinemäßig im Labor durchgeführt, aber am Anfang, mehrere Dinge schief gehen kann. Es ist zwingend notwendig, um gute Plasmidpräparation haben, um das Virus zu erzeugen. Die richtige Wartung der Zelllinien (293T und MDCK) ist entscheidend für eine erfolgreiche virale retten. Traditionell ist eine genetische Tag in einer Influenza-Gen-kodierenden Plasmid eingefügt, durch stille Mutagenese....

Zell-Linien 293T (Katalog-Nummer CRL-11268) und MDCK (Katalog-Nummer CCL-34)-Zelllinien werden in einem 37 ° C Inkubator mit 5% CO 2 in DMEM 10% FBS, 1% PS erhalten. Die Zellen sind erhältlich Form der American Type Culture Collection (ATCC, 10801 University Boulevard, Manassas, VA. 20110-2209 USA). Bebrüteten Hühnereiern Embryonierte 10-Tage alten Hühnereiern können von Charles River Laboratories, specific pathogen Fee Avian Supply (SPAFAS) Avian Produkte und Dienstleistungen bezogen werden. Franklin Commons, 106 Route 32, North Franklin, CT 06254 USA. Die Eier werden bei 37 ° C vor und nach der viralen Infektion inkubiert. Vor und nach der Virusinfektion, Eier durchleuchtet, um die Lebensfähigkeit der Embryonen zu bestimmen. Es ist sehr wichtig für tote Eier vor und nach der Virusinfektion zu suchen. Vor der Infektion ein totes Ei kann leicht durch das Fehlen der Blutgefäße sowie das Fehlen von Embryos Mobilität beobachtet werden. Wenn candled, bewegen lebenden Embryos. Nach Virusinfektion ein totes Ei (wahrscheinlich Influenzavirus-Infektion im Zusammenhang) wird leicht durch die schlechte Aussehen des Eies als von den kleineren und blutigen Volumen von Allantoisflüssigkeit gesehen gesichtet werden. Infizierte-Eier sind in Doppel autoklavierbar Taschen verworfen und autoklaviert folgenden Standardverfahren. Huhn roten Blutkörperchen (RBC) Huhn RBC aus Truslow Farms, 201 Valley Road, Chestertown, MD 21620 gekauft werden. Lagerung bei 4 ° C. Für HA-Assays, waschen 5 ml des Huhns RBC mit 45 ml PBS 1X in einer 50 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie für 5 Minuten bei 1000 rpm, RT. Entsorgen Sie sorgfältig den Überstand und die Nutzung einer 1:1000 Verdünnung des pelletierten RBC in PBS 1X (Endkonzentration von 0,5-1,0% RBC). Tissue Kulturüberständen und Allantois Flüssigkeiten Beide, Gewebe Kulturüberständen und Allantois Flüssigkeiten können bei 4 ° C gelagert werden für eine kurze Zeit. Nach der Bestätigung Virus zu retten, sind Viren aus der Zelle Überstände oder Allantoisflüssigkeit bei -80 ° C gelagert Plasmide Alle Plasmide sind bereit, mit einem Plasmid Maxi Kit nach den Empfehlungen des Herstellers. Alle Plasmide sind Aliquot bei Konzentrationen von 1 pg / ml in ddH 2 O und bei -20 ° C. Für kurzfristige Lagerung kann das Plasmid bei 4 ° C zu halten sein Die Konzentration des gereinigten DNA-Plasmid wird durch Spektrophotometrie bei 260 nm bestimmt, mit der Reinheit wird unter Verwendung der 260:280 nm-Verhältnis. Zubereitungen mit 1,8 bis 2,0 260:280 nm Verhältnisse gelten für angeeignet Virus zu retten Zwecke. Darüber hinaus sollte das Plasmid Konzentration und Reinheit mit Agarosegel-Chromatographie bestätigt werden. AmbiSense PDZ Plasmide (6) mit den acht Influenza A/PR/8/34 viralen Gene (7) sind in Abbildung 2 dargestellt. Viren Das beschriebene Protokoll zur Rettung Influenza A/PR/8/34 finden Sie unter Sicherheitsstufe (BSL) 2 Bedingungen durchgeführt werden. Kontaminiertem Material, einschließlich Gewebe Kulturüberständen und bebrüteten Eiern, sollte vor der Entsorgung sterilisiert werden. Rettung von anderen Influenza-Viren können höhere BSL Bedingungen und daher besondere Bedingungen / security Messungen müssen befolgt werden. Gewebekultur-Medien und Lösungen DMEM 10% FBS 1% PS: 445 ml Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM), 50 ml Fetal Bovine Serum (FBS), und 5 ml 100X Penicillin / Streptomycin (PS). Lagerung bei 4 ° C. Diese Medien werden verwendet, um 293T und MDCK-Zellen als auch für die Transfektionen aufrecht zu erhalten. DMEM 0,3% BA 1% PS: 495,7 ml DMEM, 4,3 ml 35% Rinderalbumin (BA). Lagerung bei 4 ° C. Kurz bevor zu verwenden, fügen TPCK behandelt Trypsin, um eine endgültige Konzentration von 1 ug / ml. Infektiöse Medien. 10X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS): 80 g NaCl, 2 g KCl, 11,5 g Na 2 HPO 4 .7 H 2 O, 2 g KH 2 PO 4. Add ddH 2 O auf 1 Liter auffüllen. Der pH-Wert auf 7,3. Sterilisieren im Autoklaven. Lagerung bei Raumtemperatur. 1X PBS: 10x PBS im Verhältnis 1:10 mit ddH 2 O. Sterilisieren im Autoklaven und bei Raumtemperatur lagern.

generation of recombinant influenza virus from plasmid dna

Die Bemühungen durch eine Reihe von Influenza Forschergruppen haben maßgeblich an der Entwicklung und Verbesserung von Influenza A-Virus durch reverse Genetik. Ursprünglich im Jahr 1999 gegründet<sup&gt; 1,2</sup&gt; Plasmid-basierte reverse genetische Techniken zur rekombinanten Viren zu erzeugen revolutioniert haben die Influenza-Forschungsfeld, weil bestimmte Fragen durch gentechnisch veränderte, infektiöse, rekombinante Influenza-Viren bereits beantwortet wurden. Solche Studien sind die Virusreplikation, Funktion von viralen Proteinen, den Beitrag der spezifischen Mutationen in der viralen Proteine ​​in viralen Replikation und / oder Pathogenese und auch, mittels viraler Vektoren rekombinante Influenza-Viren Expression fremder Proteine<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Erzeugung von rekombinanten Influenza Virus von Plasmid-DNA

Efforts by a number of influenza research groups have been pivotal in the development and improvement of influenza A virus reverse genetics. Originally ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

30.2K Aufrufe.  University of Rochester School of Medicine and Dentistry. Rettung von Influenza A-Viren von Plasmid-DNA ist eine grundlegende und wichtige experimentelle Technik, die Influenza-Forscher an rekombinanten Viren zu erzeugen, um mehrere Aspekte in der Biologie des Influenza-Virus zu untersuchen und als potentielle Vektoren oder Impfstoffe verwendet werden können.

Serie: Generation of Recombinant Influenza Virus from Plasmid DNA

High-throughput Detection Method for Influenza Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, precise diagnosis of the infecting strain and rapid high-throughput screening of vast numbers of clinical samples is paramount to control the spread of pandemic infections. Current clinical diagnoses of influenza infections are based on serologic testing, polymerase chain reaction, direct specimen immunofluorescence and cell culture 1,2.
Here, we report the development of a novel diagnostic technique used to detect live influenza viruses. We used the mouse-adapted human A/PR/8/34 (PR8, H1N1) virus 3 to test the efficacy of this technique using MDCK cells 4. MDCK cells (104 or 5 x 103 per well) were cultured in 96- or 384-well plates, infected with PR8 and viral proteins were detected using anti-M2 followed by an IR dye-conjugated secondary antibody. M2 5 and hemagglutinin 1 are two major marker proteins used in many different diagnostic assays. Employing IR-dye-conjugated secondary antibodies minimized the autofluorescence associated with other fluorescent dyes. The use of anti-M2 antibody allowed us to use the antigen-specific fluorescence intensity as a direct metric of viral quantity. To enumerate the fluorescence intensity, we used the LI-COR Odyssey-based IR scanner. This system uses two channel laser-based IR detections to identify fluorophores and differentiate them from background noise. The first channel excites at 680 nm and emits at 700 nm to help quantify the background. The second channel detects fluorophores that excite at 780 nm and emit at 800 nm. Scanning of PR8-infected MDCK cells in the IR scanner indicated a viral titer-dependent bright fluorescence. A positive correlation of fluorescence intensity to virus titer starting from 102-105 PFU could be consistently observed. Minimal but detectable positivity consistently seen with 102-103 PFU PR8 viral titers demonstrated the high sensitivity of the near-IR dyes. The signal-to-noise ratio was determined by comparing the mock-infected or isotype antibody-treated MDCK cells.
Using the fluorescence intensities from 96- or 384-well plate formats, we constructed standard titration curves. In these calculations, the first variable is the viral titer while the second variable is the fluorescence intensity. Therefore, we used the exponential distribution to generate a curve-fit to determine the polynomial relationship between the viral titers and fluorescence intensities. Collectively, we conclude that IR dye-based protein detection system can help diagnose infecting viral strains and precisely enumerate the titer of the infecting pathogens.

This method describes the use of Infrared dye based imaging system for detection of H1N1 in bronchioalveolar lavage (BAL) fluid of infected mice at a high sensitivity. This methodology can be performed in a 96- or 384-well plate, requires &lt;10 &mu;l volume of test material and has the potential for concurrent screening of multiple pathogens.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Influenza virus is a respiratory pathogen that causes a high degree of morbidity and mortality every year in multiple parts of the world. Therefore, ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

Affinitätsreinigung des Influenza-Virus Ribonukleoproteinkomplexe aus dem Chromatin der infizierten Zellen

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Rescue of Recombinant Newcastle Disease Virus from cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented, negative-sense, single-stranded, enveloped RNA virus (Figure 1) with potential applications as a vector for vaccination and treatment of human diseases. In-depth exploration of these applications has only become possible after the establishment of reverse genetics techniques to rescue recombinant viruses from plasmids encoding their complete genomes as cDNA2-5. Viral cDNA can be conveniently modified in vitro by using standard cloning procedures to alter the genotype of the virus and/or to include new transcriptional units. Rescue of such genetically modified viruses provides a valuable tool to understand factors affecting multiple stages of infection, as well as allows for the development and improvement of vectors for the expression and delivery of antigens for vaccination and therapy. Here we describe a protocol for the rescue of recombinant NDVs.

Newcastle disease virus (NDV) has been extensively studied in the last few years in order to develop new vectors for vaccination and therapy, among others. These studies have been possible due to techniques to rescue recombinant virus from cDNA, such as those we describe here.

Rettung von rekombinanten Newcastle Disease Virus aus cDNA

Newcastle disease virus (NDV), the prototype member of  the Avulavirus genus of the family Paramyxoviridae1, is a non-segmented,  negative-sense, ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and glycosylated versions of the influenza A virus surface glycoproteins - the hemagglutinin (HA) and the neuraminidase (NA). As an example, we chose the HA and NA proteins expressed by the novel H7N9 virus that recently emerged in China. However the protocol can be easily adapted for HA and NA proteins expressed by any other influenza A and B virus strains. Recombinant HA (rHA) and NA (rNA) proteins are important reagents for immunological assays such as ELISPOT and ELISA, and are also in wide use for vaccine standardization, antibody discovery, isolation and characterization. Furthermore, recombinant NA molecules can be used to screen for small molecule inhibitors and are useful for characterization of the enzymatic function of the NA, as well as its sensitivity to antivirals. Recombinant HA proteins are also being tested as experimental vaccines in animal models, and a vaccine based on recombinant HA was recently licensed by the FDA for use in humans. The method we describe here to produce these molecules is straight forward and can facilitate research in influenza laboratories, since it allows for production of large amounts of proteins fast and at a low cost. Although here we focus on influenza virus surface glycoproteins, this method can also be used to produce other viral and cellular surface proteins.

Here we describe a way to express correctly folded and functional influenza virus surface antigens derived from the novel Chinese H7N9 virus in insect cells. The technique can be adapted to express ectodomains of any viral or cellular surface proteins.

Rekombinante Expression von Funktions Hämagglutinin und Neuraminidase-Proteine ​​aus dem Roman H7N9 Influenza-Virus mit dem Baculovirus-Expressionssystem

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous emergence of new influenza virus strains due to mutation and re-assortment complicates the control of the virus and necessitates the permanent development of novel drugs and vaccines. The laboratory-based study of influenza requires a reliable and cost-effective method for the propagation of the virus. Here, a comprehensive protocol is provided for influenza A virus propagation in fertile chicken eggs, which consistently yields high titer viral stocks. In brief, serum pathogen-free (SPF) fertilized chicken eggs are incubated at 37 &#176;C and 55-60% humidity for 10 &#8211; 11 days. Over this period, embryo development can be easily monitored using an egg candler. Virus inoculation is carried out by injection of virus stock into the allantoic cavity using a needle. After 2 days of incubation at 37 &#176;C, the eggs are chilled for at least 4 hr at 4 &#176;C. The eggshell above the air sac and the chorioallantoic membrane are then carefully opened, and the allantoic fluid containing the virus is harvested. The fluid is cleared from debris by centrifugation, aliquoted and transferred to -80 &#176;C for long-term storage. The large amount (5-10 ml of virus-containing fluid per egg) and high virus titer which is usually achieved with this protocol has made the usage of eggs for virus preparation our favorable method, in particular for in vitro studies which require large quantities of virus in which high dosages of the same virus stock are needed.

Fertile chicken eggs are widely used to produce large amounts of human influenza A virus as they provide a convenient and cost-effective system to prove high yields of virus.

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies. 
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Die intranasale Verabreichung von rekombinantem Influenza Vaccines in chimären Maus-Modelle zu Mucosale Immunität Studieren

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Generation of Recombinant Human IgG Monoclonal Antibodies from Immortalized Sorted B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, including the development of immunotherapeutics. However, the techniques to identify and produce such antibodies tend to be arduous and sometimes the heavy and light chain pair of the antibodies are dissociated. Here, we describe a relatively simple, straightforward protocol to produce human recombinant monoclonal antibodies from human peripheral blood mononuclear cells using immortalization with Epstein-Barr Virus (EBV) and Toll-like receptor 9 activation. With an adequate staining, B cells producing antibodies can be isolated for subsequent immortalization and clonal expansion. The antibody transcripts produced by the immortalized B cell clones can be amplified by PCR, sequenced as corresponding heavy and light chain pairs and cloned into immunoglobulin expression vectors. The antibodies obtained with this technique can be powerful tools to study relevant human immune responses, including autoimmunity, and create the basis for new therapeutics.

Synthesis of human monoclonal antibodies is the first step in studies aimed at unraveling the pathophysiological mechanisms of auto-antibody-mediated immune responses. We have developed a protocol to generate recombinant human immunoglobulin G (IgG) monoclonal antibodies from blood sorted B cells, including B-cell isolation, antibody cloning and in vitro synthesis.

Erzeugung von rekombinanten humanen IgG monoklonalen Antikörpern aus Immortalisierte Sortiert B Cells

Finding new methods for generating human monoclonal antibodies is an active research field that is important for both basic and applied sciences, ...

Co-immunoprecipitation of the Mouse Mx1 Protein with the Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions of proteins with other macromolecules in a complex sample is called co-immunoprecipitation. The described co-immunoprecipitation protocol allows to demonstrate and further investigate the interaction between the antiviral myxovirus resistance protein 1 (Mx1) and one of its viral targets, the influenza A virus nucleoprotein (NP). The protocol starts with transfected mammalian cells, but it is also possible to use influenza A virus infected cells as starting material. After cell lysis, the viral NP protein is pulled-down with a specific antibody and the resulting immune-complexes are precipitated with protein G beads. The successful pull-down of NP and the co-immunoprecipitation of the antiviral Mx1 protein are subsequently revealed by western blotting. A prerequisite for successful co-immunoprecipitation of Mx1 with NP is the presence of N-ethylmaleimide (NEM) in the cell lysis buffer. NEM alkylates free thiol groups. Presumably this reaction stabilizes the weak and/or transient NP&#8211;Mx1 interaction by preserving a specific conformation of Mx1, its viral target or an unknown third component. An important limitation of co-immunoprecipitation experiments is the inadvertent pull-down of contaminating proteins, caused by nonspecific binding of proteins to the protein G beads or antibodies. Therefore, it is very important to include control settings to exclude false positive results. The described co-immunoprecipitation protocol can be used to study the interaction of Mx proteins from different vertebrate species with viral proteins, any pair of proteins, or of a protein with other macromolecules. The beneficial role of NEM to stabilize weak and/or transient interactions needs to be tested for each interaction pair individually.

This co-immunoprecipitation protocol allows to study the interaction between the influenza A virus nucleoprotein and the antiviral Mx1 protein in human cells. The protocol emphasizes the importance of N-ethylmaleimide for successful co-immunoprecipitation of Mx1 and influenza A virus nucleoprotein.

Co-Immunopräzipitation der Maus Mx1 Protein mit dem Influenza A Virus Nucleoprotein

Studying the interaction between proteins is key in understanding their function(s). A very powerful method that is frequently used to study interactions ...

Nasal Wipes for Influenza A Virus Detection and Isolation from Swine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and new strains are continually emerging. Swine are able to be infected by diverse lineages of influenza A virus making them important hosts for the emergence and maintenance of novel influenza A virus strains. Sampling pigs in diverse settings such as commercial swine farms, agricultural fairs, and live animal markets is important to provide a comprehensive view of currently circulating IAV strains. The current gold-standard ante-mortem sampling technique (i.e. collection of nasal swabs) is labor intensive because it requires physical restraint of the pigs. Nasal wipes involve rubbing a piece of fabric across the snout of the pig with minimal to no restraint of the animal. The nasal wipe procedure is simple to perform and does not require personnel with professional veterinary or animal handling training. While slightly less sensitive than nasal swabs, virus detection and isolation rates are adequate to make nasal wipes a viable alternative for sampling individual pigs when low stress sampling methods are required. The proceeding protocol outlines the steps needed to collect a viable nasal wipe from an individual pig.

The authors present a protocol to collect swine nasal wipes to detect and isolate influenza A viruses.

Nasal Tücher für Influenza-A-Virus-Erkennung und Isolierung von Schweine

Surveillance for influenza A viruses in swine is critical to human and animal health because influenza A virus rapidly evolves in swine populations and ...

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus (IAV), virus fusion with the endosomal membrane as well as the subsequent disassembly of the viral capsid, called uncoating, is governed by the ionic conditions inside endocytic vesicles. The early steps in the virus life cycle are hard to study because endosomes cannot be directly accessed experimentally, creating the need for an in vitro approach. Here, we describe a method based on velocity gradient centrifugation of purified virions through a two-layer glycerol gradient, which enables analysis of the IAV core and its stability. The gradient contains a non-ionic detergent (NP-40) in its lower layer to remove the viral membrane by solubilization as the virus sediments toward the bottom. At neutral pH, viral cores are pelleted as stable structures. The major core components, matrix protein (M1) and the viral ribonucleoproteins (vRNPs), can be clearly identified in the pellet fraction by SDS-PAGE. Decreasing the pH to 6.0 or lower in the bottom layer selectively removes M1 from the pellet followed by release of vRNPs at more acidic conditions. Viral protein bands on Coomassie-stained gels can be subjected to densitometric quantification to monitor intermediate states of IAV disassembly. Besides pH, other factors that influence viral core stability can be assessed, such as salt concentration and putative viral uncoating factors, simply by modifying the detergent-containing glycerol layer accordingly. Taken together, the presented technique allows highly reproducible and quantitative analysis of viral uncoating in vitro. It can be applied to other enveloped viruses that undergo complex uncoating processes.

In Vitro Disassembly of Influenza A Virus Capsids by Gradient Centrifugation

Disassembly of influenza A virus cores during virus entry into host cells is a multistep process. We describe an in vitro method to analyze the early stages of viral uncoating. In this approach, velocity gradient centrifugation is used to biochemically dissect the steps that initiate uncoating under defined conditions.

In - vitro - Zerlegung von Influenza - A - Virus Kapside durch Gradientenzentrifugation

Acid-triggered molecular processes closely control cell entry of many viruses that enter through the endocytic system. In the case of influenza A virus ...