Arbeit in der Autoren Labor wird durch einen Zuschuss aus dem National Institute of General Medical Sciences (GM41628) und durch einen Zuschuss an die Stowers Institut für medizinische Forschung von der Helen Nelson Medical Research Fund in der Greater Kansas City Community Foundation unterstützt.

1. Erzeugung und Kultur der HEK293 Stabile Zelllinien, Ganzkörperansicht oder Mutant Versionen von FLAG-Epitop-markierten INO80 oder Andere INO80 Komplexe Untereinheiten <ol><li> Klon-cDNA in voller Länge oder mutierte menschliche INO80 ATPase-Untereinheit oder eine andere INO80 in den Säugetierexpressionsvektor pcDNA5 / FRT mit einer in-frame, N terminalen FLAG-Epitop-Tag kodiert. </li><li> Bestätigung der Sequenz der insertierten cDNAs durch DNA-Sequenzierung, bevor fortgefahren wird. </li><li> Um die Transfektion durchzuführen, wachsen Flp-In HEK293-Zellen in 10 cm-Gewebekulturplatten in einem Medium, das DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium), 5% Glutamin und 10% FBS (fötales Rinderserum). </li><li> Wenn die Zellen ~ 70% Konfluenz in den einzelnen Gewebekulturschale ein Gemisch von 40 ul FuGENE6 Transfektionsreagenz, 0,5 ug der geeigneten pcDNA5 / FRT-Expressionsplasmid, und 9,5 ug pOG44, die Flp-Rekombinase kodiert, in einem Gesamtvolumen 800 ul. </li><li> 48 Stunden später, Trypsinize und split Zellen in einem Verhältnis von 1:30 in 10-cm-Schalen, und sie wachsen in DMEM mit 5% Glutamin, 10% FBS und 100 ug / ml Hygromycin B für 3 - 4 Wochen. Ändern Sie den Kulturmedium, wenn es zu vergilben beginnt (in der Regel alle 3 - 5 Tage). </li><li> Um positive Klone, die die höchste Stufe der FLAG-markierten Protein exprimieren zu identifizieren, wählen Sie einzelne Hygromycin B-resistente Kolonien und sie auf einer einzigen Vertiefung einer 24-Well-Platte. <ol><li> Sobald die Zellen Konfluenz erreichen 80%, Ernten der Zellen aus jeder Vertiefung in ~ 1 ml PBS und Pellet durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 5 min. </li><li> Nach Entfernen des Überstands, Resuspendieren des Zellpellets in 60 ul SDS-PAGE-Probenpuffer. </li><li> Betreff Hälfte des Zellpellet resuspendiert SDS PAGE und Western-Blot auf die Expression des FLAG überwachen getaggt Köder-Protein; speichern Sie die andere Hälfte für zukünftige Analysen. </li></ol></li><li> Wenn kein FLAG-markierten menschlichen INO80 Protein in Zelllysaten detektiert, erweitern Sie den ersten klonalen Zell popuweitere nung durch Plattierung Zellen aus einzelnen Vertiefungen einer 24-Well-Platte in 15 cm Gewebekulturschalen. <ol><li> Zellen aus 15-cm-Schalen, resuspendieren nahezu konfluenten Zellen in eiskalter PBS und in ein 50 ml konisches Röhrchen geerntet. </li><li> Zu bringen, um ein Endvolumen von 50 ml durch Zugabe von zusätzlichem PBS. </li><li> Pellet-Zellen bei 1000 × g für 5 min entfernt und so viel wie möglich von dem Überstand. </li><li> Zellpellet in 1 ml Lys450-Puffer (20 mM HEPES-NaOH pH 7,9, 450 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 10 mM KCl, 4 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA, 10% Glycerin, 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). HINWEIS: hier und anderswo, DTT, PMSF und Protease-Inhibitor-Cocktail immer Puffer hinzuzufügen unmittelbar vor Beginn eines Experiments. </li><li> Immuno-Niederschlag FLAG-markierten Proteine ​​aus der resultierenden Ganzzelllysat mit 20 ul Anti-FLAG-Agarose-Gel, und zu analysieren, die die Flagge Eluate mittels Western Blot. [Für Details immunoprecipitation Verfahren siehe Schritt 5] </li></ol></li><li> Bereiten gefrorenen Bestände der gewünschten klonalen Zelllinien 12 und speichern sie in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung. </li></ol> 2. Wachsende HEK293 Zelllinien in Rollerflaschen Für große Vorbereitung INO80 Komplexe, Kulturzellen in 10 - 20 Rollerflaschen; eine typische Ausbeute aus jeder Rolle Flasche ist ~ 1 ml gepackte Zellen. <ol><li> Zu jedem Rollflasche, 200 ml DMEM, 5% Glutamin und 10% Kälberserum, ohne Hygromycin B. </li><li> Übertragen Sie alle Zellen aus einer nahezu konfluenten 15 cm Schüssel in jeder Rolle Flasche </li><li> Ort Rollerflaschen in einem 37 ° C Inkubator Rollflasche und drehen sich mit 0,2 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Sobald Zellen zu erreichen ~ 70% Konfluenz, abgießen und entsorgen Sie die Medium. </li><li> Fügen ~ 50 ml eiskaltem PBS zu jeder Flasche. Halten Flaschen horizontal, leicht schwenken, um die Zellschicht zu lösen. </li><li> Übertragen Sie die resuspendierten Zellen auf 250 ml plastic konischen Flaschen und auf Eis. </li><li> Spülen Rollerflaschen mit zusätzlichen PBS, sequentiell übertragen sie von Flasche zu Flasche. Wenn Spüllösung nicht mehr klar ist (in der Regel nach Gebrauch auf etwa 5 Flaschen spülen), fügen Sie ihn der Zellsuspension. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 min. </li><li> Vorsichtig resuspendieren Zellen in PBS, kombinieren sie zu einem einzigen 250-ml-Erlen Flasche, und auf Eis zu halten, bis die Weiterverarbeitung. </li></ol> 3. siRNA-vermittelten Knockdown von INO80 Untereinheiten in Zellen, Another FLAG-markierten INO80 Subunit Um INO80 Subkomplexe fehlt eine einzige Untereinheit zu erhalten, zu nutzen FLAG-Immunkomplexe aus INO80 siRNA behandelten Zellen oder Zellen, die stabil shRNA reinigen. Die &quot;umgekehrte&quot; siRNA (small interfering RNA) Transfektion hier beschriebene Protokoll ist für HEK293 Zellen, die in 15 cm-Schalen optimiert. Das Protokoll ist für eine einzelne 15-cm-Schale von Zellen und shoULD sich dementsprechend abhängig von der Anzahl der Zellen benötigt skaliert werden. Biochemisch nützlich Mengen INO80-Komplex aus siRNA-behandelten Zellen herzustellen, sollte man Skalierung auf bis zu 40 Kulturen in 15 cm-Schalen gewachsen; 4 ml gepacktes Zellpellet - diese werden ca. 2 ergeben. <ol><li> HEK293-Zellen wachsen die gewünschte Untereinheit des Komplexes INO80 stabil exprimieren, um in der Nähe von Konfluenz in 15 cm-Schalen. </li><li> Hinzufügen eines Volumens von siRNA Resuspensionspuffer (20 mM KCl, 6 mM HEPES, pH 7,5, und 0,2 mM MgCl 2) ausreicht, um eine 50 uM Stammlösung von siRNA in ein Röhrchen lyophilisiert siRNA herzustellen. Pipettieren die Lösung auf und ab ein paar Mal und Inkubation auf einem Kolbenpendel für 30 min bei RT, um sicherzustellen, dass die siRNA vollständig aufgelöst. </li><li> Bereiten Sie eine Transfektionscocktail enthält siRNAs und Transfektionsreagenz. Mix 10 ul der 50 uM siRNA-Stammlösung mit 32 ul Lipofectamine RNAiMAX und zu 4 ml Opti-MEM hinzufügen Reduzierte Serum Medium mit sehr schonende Durchmischung; alNieder alle Reagenzien auf RT vor Gebrauch ins Gleichgewicht. </li><li> Inkubieren der Mischung bei RT für 30 min. </li><li> Bereiten Flp-In HEK293-Zellen die gewünschte INO80 Untereinheit für die Transfektion stabil exprimieren. <ol><li> Während der Inkubation von Schritt 3.4, waschen Zellen in den 15-cm-Schalen einmal mit PBS RT. </li><li> Nach dem Entfernen PBS, Behandlung Zellen mit 1 ml Trypsin nur, bis sie zum Abheben der Platte beginnen. </li><li> Sofort 10 ml Vollmedium (DMEM + 5% Glutamin + 10% FBS), um Zellen mit Trypsin behandelt und vorsichtig mischen. Sammle die Zellen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 5 Minuten bei RT. </li><li> Zellpellet in ~ 4 ml Vollmedium, und zählen Sie die Zelle mit einer Aufwirbelung Hämocytometers. </li><li> Verdünnte Zellen mit komplettem Medium auf eine Konzentration von ~ 5,4 × 10 6 / ml. </li></ol></li><li> Zu jeder 15 cm Schüssel, fügen Sie 15 ml komplettem Kulturmedium, gefolgt von 4 ml Transfektion Cocktail. Vorsichtig schwenken, um die mittel-und Transfektionscocktail gewährleisten thoroughly gemischt. Schließlich, fügen Sie einem ml Zellsuspension und wieder vorsichtig schwenken, um Zellen gleichmäßig zu verteilen. </li><li> Nach 60 h der Kultur in einem 37 ° C, 5% CO 2-Inkubator, entfernen Sie vorsichtig Medium, Zellen in eiskaltem PBS, und fahren Sie sofort auf Kernextrakte herzustellen. </li></ol> 4. Herstellung von Kernextrakten Dieses Verfahren ist aus dem Protokoll von Dignam 13 modifiziert und kann nach oben oder unten in Abhängigkeit von der Größe des Ausgangszellpellets skaliert werden. Typischerweise 1 ml gepacktes Zellpellet ergibt 1 ml des endgültigen Kernextrakt. Alle Puffer sollten eiskalt sein, und alle Schritte sollten in einem Kühlraum oder auf Eis durchgeführt, wenn ein geeignetes Kühlraum nicht zur Verfügung steht. <ol><li> Isolierung der Kerne: <ol><li> Sanft Zellen übertragen zu einem geeignet bemessenen (15 oder 50 ml) abgestuft konischen Rohr und Schleudern bei 1000 × g für 10 min bei 4 ° C ist. </li><li> Entfernen Sie den Überstand, und messen die Lautstärke des gepackten Zell pellassen. 1 ml gepackte Zellen entspricht ~ 3 x 10 8 HEK293-Zellen. </li><li> Hinzufügen 5 gepackten Zellvolumina Puffer A (10 mM HEPES, pH 7,9, 1,5 mM MgCl 2, 10 mM KCl und frisch zuge 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). Zellpellet durch vorsichtiges Pipettieren. </li><li> Inkubieren auf Eis für genau 10 min. </li><li> Pellet die Zellen bei 1.000 g für 10 min bei 4 ° C, und entfernen Sie den Überstand. </li><li> Die Grße des Zellpellets sollte während der Inkubation in Puffer A bis zu 2-fach erhöht </li><li> Die Zellen in zwei gepackte Zellvolumen Puffer A, und übertragen Sie die Zellsuspension auf einem passenden Dounce Gewebehomogenisator. Wenn die mit weniger als 2 ml gepackter Zellen, mit einem 7 ml Homogenisator; für 2 - 4 ml gepackte Zellen, verwenden Sie ein 15 ml-Homogenisator; und für 10 oder mehr ml gepackter Zellen, verwenden Sie ein 40 ml-Homogenisator. </li><li> Homogenisierung der Zellsuspension mit dem losen Glaspistill der Dounce Homogenisator until 90% der Zellen färben sich positiv mit 1% Trypanblau. </li><li> Die Suspension in einem 45-ml-Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen und Schleudern bei 25.000 xg für 20 min bei 4 ° C in einem JA-17-Rotor oder ähnliches (siehe Tabelle der Werkstoffe / Zubehör). </li><li> Von der Kernpellet, den Überstand, der cytosolischen Proteine ​​oder Proteine, die bei der Fraktionierung aus dem Kern entweichen enthält. </li></ol></li><li> Extrahieren Kerne mit Salz: <ol><li> Fügen Puffer C (20 mM HEPES, pH 7,9, 25% Glycerin, 1,5 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA und frisch zuge 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail) in den Kernpellet; verwenden 2,5 ml Puffer C für jeweils 3 ml Ausgangszellvolumen (~ 1 x 10 9 Zellen). </li><li> Mit einem Glasstab oder einer Pipette zu verdrängen das Kernpellet von der Wand des Rohres und übertragen die gesamte Mischung auf einem Dounce-Homogenisator mit einer geeigneten Größe. </li><li> Resuspendieren der Kerne durch Homogenisieren the Mischung mit zwei Schlägen aus einer losen Stößel. </li><li> Übertragen Sie die Kernfraktion resuspendiert in ein gekühltes Becherglas. Wähle einen Becher derart, daß die Suspension wird das Becherglas auf mindestens 0,5 cm tief füllen. </li><li> Die Kernproteine ​​aus Chromatin oder andere unlösliche Strukturen zu extrahieren, schrittweise Erhöhung der Salzkonzentration der Suspension auf 0,42 M NaCl durch tropfenweise Zugabe von 5 M NaCl unter leichtem Rühren der Suspension mit einer Pipette oder Glasstab auf Eis; Wenn alle 5 M NaCl wurde zugegeben, sollte die Lösung sehr viskos oder gelartigen. Berechnung des Volumens von 5 M NaCl nötig, um die Lösung auf eine Endkonzentration von 0,42 M NaCl nach der folgenden Formel zu bringen: <img alt="Gleichung 1" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51720/51720equation1.jpg" width="500" /></li><li> Die viskose Suspension sorgfältig Transfer in 10 ml Polycarbonat Rohre für einen Typ 70.1 Ti-Rotor (oder gleichwertig) oder 70 ml Polycarbonat-Flaschen für einen Typ 45 Ti or ähnlich Rotor (siehe Tabelle der Materialien / Ausrüstung). Dicht schließen mit Parafilm bei Verwendung von 10-ml-Röhrchen mit Kappe oder Montage, wenn unter Verwendung von 70-ml-Flaschen. </li><li> Langsam rocken die verschlossenen Röhrchen bei 4 ° C für 30 min mit einem Kolbenpendel. </li><li> Dreh die Proben in einem 45 Ti-Typ oder 70.1 Ti-Rotor für 30 Minuten bei 120.000 × g bei 4 ° C ist. </li><li> Den Überstand in einem einzigen Kunststoffrohr oder Flasche. Dieser Überstand ist die Kernextrakt und das Pellet enthält Chromatin und andere Kerntrümmer. </li><li> Teilen Sie die Kernextrakt in handliche Teilmengen, einfrieren in flüssigem Stickstoff, und speichern Sie sie bei -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Immunoaffinitätsreinigung des Menschen INO80 oder INO80 Subkomplexe <ol><li> Zum Auftauen gefrorenen Kernextrakt, Ort Röhrchen, die den Extrakt auf den Tisch-oder Walzenrohre zwischen den Händen, bis die gefrorene Material wird zu einem Brei. Dann legen Sie die Röhrchen auf Eis oder im Kühlraum, bis der Extrakt ist komplett thawed. </li><li> Übertragen der aufgetauten Zellkernextrakt 10 ml Ultrazentrifugenröhrchen aus Polycarbonat und Spin bei 100.000 × g für 20 min bei 4 ° C in einem Typ 70.1 Ti-Rotor oder gleichwertig jede Niederschlag, die während des Gefrier-Auftau-Zyklus gebildet haben können. </li><li> Den Überstand in einem 15 ml konischen Röhrchen. Fügen Sie frisches DTT, PMSF und Protease Inhibitor Cocktail, um Endkonzentrationen von 1 mM DTT, 200 uM PMSF und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail. </li><li> Anti-Flag Agarose zur Immun vorzubereiten, Transfer 200 ul 50% Gülle von Anti-Flag Agarose-Kügelchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit einem P200 oder ähnliche Pipette mit einer Spitze, aus dem das Ende wurde mit einem sauberen Skalpell oder Rasierklinge. </li><li> Pellet die Perlen durch Zentrifugation in einer Tischmikrozentrifuge bei 8.000 g für 30 sek. Entfernen Sie den Überstand und Waschen der Kügelchen durch Resuspendieren der Beads in 1 ml Lys450 Puffer und Pellet die Perlen bei 8.000 g für 30 sek. Waschen Sie die bEADS zwei weitere Male. </li><li> Resuspendieren gewaschen Anti-FLAG-Agarose-Kügelchen in etwa 100 ul des Kernextrakt mit einem P200 oder ähnliches Volumen einstellbare Pipette mit einer Spitze, aus dem das Ende wurde mit einem sauberen Skalpell oder einer Rasierklinge und, mit der gleichen Spitze, Übertragung geschnitten die resuspendierten Perlen an den 15 ml konischen Röhrchen, die den Extrakt. Ein paar Mal wiederholen, bis alle Perlen haben an den 15-ml-Tube überführt. </li><li> Inkubieren des Extrakts / Perlen-Mischung für 4 h bei 4 ° C unter langsamer Rotation auf einer Labor-Rotator. OPTIONAL: Fügen Sie in einer Konzentration von 25 Einheiten / ml Benzonase zu entfernen verunreinigende DNA. </li><li> Sammeln Sie die FLAG-Agarose durch Zentrifugation bei 1.000 × g für 5 min bei 4 ° C ist. </li><li> Resuspendieren in 10 ml Lys450 zu waschen, Inkubation 5 min bei 4 ° C unter leichtem Schütteln auf einem Kolbenpendel. Pellet die Kügelchen bei 1.000 × g für 5 min bei 4 ° C ist. </li><li> Resuspendieren in 100 bis 150 ul Lys450 und Transfer Perlen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Co150 ul Lys450, bis alle die Perlen auf die Mikrozentrifugenröhrchen überführt worden - ntinue um die 15 ml konischen Röhrchen mit 100 zu spülen. </li><li> Spin-down die Perlen bei 8.000 xg für 30 sec bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. Waschen dreimal mit 1 ml Lys450 und einmal mit 1 ml EB100-Puffer (10 mM HEPES pH 7,9, 10% Glycerin, 100 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,05% Triton X-100, und frisch zuge 1 mM DTT, 200 uM PMSF , und 1: 1.000 Protease Inhibitor Cocktail). </li><li> Zur Elution gebundener Proteine, 200 ul EB100-Puffer mit 0,25 mg / ml 1x FLAG-Peptid. Inkubieren 30 min bei jeder 4 ° C auf einem Kolbenpendel. </li><li> Pellet die Kügelchen bei 8.000 xg für 30 sec bei 4 ° C in einer Mikrozentrifuge. Den Überstand, der den eluierten INO80 Komplex enthält, in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Elution vier weitere Male, und bündeln alle Überstände in einem einzigen Rohr. </li><li> Um restliche FLAG-Agarose-Perlen aus der eluierten Proteinfraktion zu entfernen,passieren die Eluat durch eine leere Spin-Säule. </li><li> Konzentrieren die eluierte Proteinfraktion ~ 10-fach unter Verwendung einer Ultrafilterzentrifuge Gerät (50.000 Molekulargewichtsgrenze). </li><li> Um das FLAG-Peptid zu entfernen, übergeben Sie die konzentrierte Proteinfraktion nacheinander durch zwei Entsalzungssäulen. </li><li> Teilen das gereinigte entsalzte Proteinfraktion in 20 ul-Aliquots in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 ° C gelagert. </li><li> Analysieren Sie die Zusammensetzung der Untereinheiten INO80 oder INO80 Subkomplexe auf Silber-gefärbten Gelen oder durch Western Blotting, und schätzen ihre Konzentrationen von semi-quantitativen Western-Blot unter Verwendung von rekombinanten Präparaten INO80 Untereinheiten bekannter Konzentration als Standards. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe aus höheren Eukaryoten durch die Schwierigkeit der Herstellung von biochemisch nützlichen Mengen solcher Komplexe, die mutierte oder fehlende bestimmte Untereinheiten Untereinheiten insgesamt behindert. Es gibt eine Reihe von technischen Hürden: Erstens hat die genetische Manipulation in Säugerzellen technisch anspruchsvoll und zeitaufwendig gewesen. Anders als Hefezellen, deren Genom kann leicht bearbeitet...

Evolutionär konservierte Familie SNF2 Chromatin-Remodeling-Komplexe sind Schlüsselregulatoren des Chromatins Organisation und DNA-Zugänglichkeit 1. Diese Umbau-Komplexe schließen immer eine zentrale SNF2 artigen ATPase Untereinheit, die in einigen Fällen, montiert mit verschiedenen Zubehör Proteine ​​und bildet mit mehreren Untereinheiten makromolekulare Baugruppen. Um die molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess zu untersuchen, ist es wichtig, die Beiträge der gegebenen Untermengen von Untereinheiten und / oder den Domain-Strukturen Aktivitäten der Komplexe zu verstehen. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit, hoch gereinigten Mutante Komplexe, insbesondere Protein-Untereinheiten oder Domänenstrukturen fehlt erzeugen. Vorherige Struktur-Funktions-Studien von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexe sind allgemein für die Hefe-Modellsystem fokussiert aufgrund der überlegenen Handhabbarkeit des Hefe-Genom (siehe zB Lit. 1-4). Angesichts der Erhaltung derZusammensetzung Einheit und Funktionalität unter ortho-Remodeling-Komplexe, Untersuchungen der Struktur und Funktion der Hefe-Remodeling-Komplexen haben wichtige Einblicke in ihre Gegenstücke in höheren Eukaryoten ist. Dennoch nennenswerte Spezies-spezifische Unterschiede zwischen den Umbau Komplexe existieren, von Gewinn oder Verlust der Spezies-spezifische Untereinheiten, Gewinn oder Verlust der Arten-spezifische Domänen von konservierten Untereinheiten und Sequenzvariabilität innerhalb konservierten Domänen von konservierten Untereinheiten entstehen. Solche Unterschiede können im Prinzip durch die Notwendigkeit für höhere eukaryotische Zellen zu neuen molekularen und zellulären Umgebungen anzupassen angetrieben werden. So verstehen, wie Untereinheiten der höheren eukaryotischen Umbau Komplexe dazu beitragen, die Nukleosomen Umbauprozess ist wertvoll, denn es wirft nicht nur Licht auf die grundlegenden Mechanismen der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess, sondern kann auch wertvolle Einblicke in die Mechanismen, durch die Chromatinstruktur und Genexpression in higsie Eukaryonten reguliert. Bisher gab es nur strukturelle und funktionelle Untersuchungen mit mehreren Untereinheiten Säuger Chromatin-Remodeling-Komplexe, zum Teil aufgrund der Schwierigkeiten bei der biochemisch definiert Chromatin-Remodeling-Komplexe und Unterkomplexe beschränkt. Wir haben teilweise diese Schwierigkeiten mit den unten beschriebenen Verfahren, bei denen Immunaffinitätsreinigung verwendet wird, um intakt INO80 oder INO80 Subkomplexe aus menschlichen Zellen stabil exprimiert N-terminal FLAG-Epitop markierten Wildtyp-oder mutierte Versionen von INO80 5-7 vorzubereiten umgangen (Abbildung 1) . Intakte INO80 Komplexe aus menschlichen Zellen zu erhalten, wird Flp-vermittelte Rekombination verwendet werden, um transgene HEK293-Zelllinien, die stabil FLAG-Epitop markierten cDNAs Untereinheiten des Komplexes INO80 8-10 kodieren, zu erzeugen. Da die Überexpression von INO80 Untereinheiten kann etwas giftig sein, ist es notwendig, zu isolieren und zu pflegen klonalen Zelllinien unter selektiven CoBedingungen ausgebracht, um eine stabile Expression des Transgens in den vielen Passagen für die Erweiterung des Großzellkulturen erforderlich zu gewährleisten. Um kleinere INO80 Subkomplexe, die nur eine Teilmenge der Untereinheiten enthalten, zu erhalten, haben wir erfolgreich verwendet zwei Ansätze (Abbildung 2a, b). In der ersten, erzeugen wir HEK293 Flp-In-Zelllinien, die stabil mutierten Versionen INO80 die Domains für die Wechselwirkung mit spezifischen Untereinheiten 5 erforderlich fehlt. Alternativ wird siRNA-vermittelten Zuschlags verwendet, um die gewünschte Untereinheit von den Zellen eines geeigneten FLAG-markierten INO80 Einheit (unveröffentlichte Daten) Expression führen. Schließlich, um die Menschen INO80 Komplexe zu reinigen, ist FLAG-Agarose-Chromatographie basiert 11 verwendet, um eine INO80 haltigen Fraktion aus Kernextrakten zu bereichern, damit eine effektive Senkung der Anwesenheit von verunreinigenden Cytosolproteine ​​in der letzten Fraktion, die gereinigtes INO80 oder INO80 Subkomplexe.

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			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:173px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">10-013-CV</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glutamax-I (stablized glutamine)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">35050-079</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12176C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FuGENE6 transfection reagent&#160;&#160;</td>
			<td>Promega</td>
			<td style="width:147px;">E2312</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hygromycin B, sterile in PBS</td>
			<td>AG Scientific</td>
			<td style="width:147px;">H-1012-PBS</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pcDNA5/FRT vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V6010-20</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Flp-In HEK293 cells&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">R780-07</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">pOG44 Flp-Recombinase Expression Vector</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">V600520</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZview&#160; Red ANTI-FLAG&#160; M2 Affinity Gel&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F2426</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calf serum</td>
			<td>SAFC</td>
			<td style="width:147px;">12138C</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TARGETplus SMARTsiRNA pool</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">various</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">5x siRNA resuspension buffer&#160;</td>
			<td>Dharmacon / Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">#B-002000-UB-100</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lipofectamine RNAiMAX&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">13778</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">51985-091</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Cellgro</td>
			<td style="width:147px;">45000</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">TrypLE (trypsin)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td style="width:147px;">12604</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1x FLAG Peptide</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3290</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Bio-Spin Chromatography Column</td>
			<td style="width:212px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:147px;">737-5021</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amicon Ultra Centrifugal Filter Device (50k MWCO)</td>
			<td style="width:212px;">Amicon</td>
			<td style="width:147px;">UFC805024&#160;</td>
			<td style="width:173px;">Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Desalting Columns&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:147px;">89882</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, mouse</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F3165</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Anti-FLAG M2 antibody, rabbit</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">F7425</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td style="width:212px;">Sigma</td>
			<td style="width:147px;">P8340</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">benzonase&#160;</td>
			<td>Novagen</td>
			<td style="width:147px;">70664</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;"></td>
			<td style="width:212px;"></td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Equipment</td>
			<td style="width:212px;">Company</td>
			<td style="width:147px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Wheaton Dounce Tissue Grinders</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td style="width:147px;">06-435C&#160;</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JS-4.2 rotor in a J6 centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339080</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">JA-17 rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">369691</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 ml polycarbonate tubes&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355630</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">70 ml polycarbonate bottles&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">355655</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 45 Ti rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">339160</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Type 70.1 Ti rotor&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:147px;">342184</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BD Clay Adams Nutator Mixer</td>
			<td style="width:212px;">BD Diagnostics</td>
			<td style="width:147px;">15172-203&#160;</td>
			<td style="width:173px;">VWR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glas-Col Tube/Vial Rotator</td>
			<td style="width:212px;">Glas-Col</td>
			<td style="width:147px;">099A RD4512</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PCR thermal cycler PTC 200</td>
			<td>MJ Research</td>
			<td style="width:147px;">PTC 200</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">roller bottle incubator</td>
			<td style="width:212px;">Bellco biotechnology</td>
			<td style="width:147px;">353348</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:359px;">Immobilon-FL Transfer Membrane 7 x 8.4</td>
			<td style="width:212px;">Millipore</td>
			<td style="width:147px;">IPFL07810</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">lubricated 1.5ml microcentrifuge tubes&#160;</td>
			<td style="width:212px;">Costar</td>
			<td style="width:147px;">3207</td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and purification of human ino80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes

INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe regulieren Nukleosomen Dynamik und DNA-Zugänglichkeit durch Katalyse ATP-abhängigen Nukleosomen Umbau. Menschliche INO80 Komplexe aus Protein-Untereinheiten 14 einschließlich INO80 eine SNF2 artigen ATPase, die sowohl als die katalytische Untereinheit und dem Stützgerüst zur Montage der Komplexe dient. Funktionen der anderen Untereinheiten und die Mechanismen, durch die sie den INO80 Komplexes Chromatin-Remodeling-Aktivität beitragen noch schwer, was zum Teil auf die Herausforderung der Erzeugung INO80 Baugruppen in menschlichen Zellen oder heterologen Expressionssystemen. Dieses Protokoll beschreibt JOVE eine Prozedur, die die Reinigung der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling Subkomplexe, die eine Untereinheit fehlt oder eine Teilmenge der Untereinheiten ermöglicht. N-terminal FLAG-Epitop markiert INO80 cDNA stabil in humanen embryonalen Nierenzellen (HEK) 293-Zelllinien mit Flp-vermittelte Rekombination eingeführt. In dem Fall, dass eine Untergruppe von Untereinheiten des Komplexes ist INO80 zu be gelöscht, statt einer Mutante INO80 Proteine, die die Plattform für die Montage dieser Untereinheiten sind, nicht immer zum Ausdruck bringt. Im Falle eine individuelle Untereinheit ist erschöpft sein, eine Transfekte siRNAs dieser Untereinheit in ein HEK 293-Zelllinie, die stabil FLAG getaggt INO80 ATPase. Kernextrakte werden hergestellt und FLAG Immunpräzipitation durchgeführt, um die Proteinfraktionen, die INO80 Derivate bereichern. Die Zusammensetzungen gereinigt INO80 Subkomplexe kann dann unter Verwendung von Verfahren wie beispielsweise Immunoblotting, Silberfärbung und Massenspektrometrie analysiert werden. Die INO80 und INO80 Subkomplexe entsprechend diesem Protokoll erzeugt wird, kann weiter analysiert werden unter Verwendung von verschiedenen biochemischen Tests, welche in den beiliegenden JOVE Protokoll beschrieben sind. Die hier beschriebenen Methoden können für die Untersuchung der strukturellen und funktionellen Eigenschaften einer Säuger mehreren Untereinheiten Chromatin-Remodeling-Komplexe und Modifikation angepasst werden.

Figur 1 zeigt ein Flussdiagramm eine Zusammenfassung der zur Erzeugung, Reinigung und Charakterisierung menschlicher INO80 ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexen Verfahren. Wie in den 2 und 3 dargestellt, diese Verfahren ermöglichen die Erzeugung von beiden Wildtyp INO80 und INO80 Subkomplexe, die verschiedenen Untereinheiten fehlen, wodurch die nachfolgende biochemische Analysen der Beitrag dieser fehlenden Untereinheiten an enzyma...

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Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Wildtyp-und Mutantenversionen der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexes. Epitop-markierte Versionen der INO80 Untereinheiten stabil in HEK293-Zellen exprimiert, und die Gesamtkomplexe und Komplexe ohne spezifische Sätze von Untereinheiten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt.

Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

INO80 chromatin remodeling complexes regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Human INO80 ...

generation-purification-human-ino80-chromatin-remodeling-complexes

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Education

JoVE Journal

JoVE Core

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA and Chromosome Structure

SCIENTISTS IN ACTION

9.7K Aufrufe.  Stowers Institute for Medical Research.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Erzeugung und Reinigung von Wildtyp-und Mutantenversionen der menschlichen INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexes. Epitop-markierte Versionen der INO80 Untereinheiten stabil in HEK293-Zellen exprimiert, und die Gesamtkomplexe und Komplexe ohne spezifische Sätze von Untereinheiten durch Immunaffinitätschromatographie gereinigt. 

Serie: Generation and Purification of Human INO80 Chromatin Remodeling Complexes and Subcomplexes

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

Reinigung und Visualisierung von Influenza A Virus Ribonukleoproteinkomplexe

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Forschung

Biologie

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

Menschliche Inselzellen der Bauchspeicheldrüse Isolation: Part II: Reinigung und Kultur der Menschenrechte Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

Färbung von Proteinen in Gelen mit Coomassie G-250 ohne organische Lösungsmittel und Essigsäure

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Preparation, Purification, and Characterization of Lanthanide Complexes for Use as Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for magnetic resonance imaging (MRI). Many commercially available ligands are especially useful because they contain 
functional groups that allow for fast, high-purity, and high-yielding conjugation to macromolecules and biomolecules via amine-reactive 
activated esters and isothiocyanate groups or thiol-reactive maleimides. While metalation of these ligands is considered common 
knowledge in the field of bioconjugation chemistry, subtle differences in metalation procedures must be taken into account when 
selecting metal starting materials. Furthermore, multiple options for purification and characterization exist, and selection of the most 
effective procedure partially depends on the selection of starting materials. These subtle differences are often neglected in published 
protocols. Here, our goal is to demonstrate common methods for metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes 
that can be used as contrast agents for MRI (Figure 1). We expect that this publication will enable biomedical scientists to incorporate 
lanthanide complexation reactions into their repertoire of commonly used reactions by easing the selection of starting materials and 
purification methods.

We demonstrate the metalation, purification, and characterization of lanthanide complexes. The complexes described here can be conjugated to macromolecules to enable tracking of these molecules using magnetic resonance imaging.

Herstellung, Reinigung und Charakterisierung von Lanthanoidkomplexe für die Verwendung als Kontrastmittel für die Magnetresonanz-Tomographie

Polyaminopolycarboxylate-based ligands are commonly used to chelate lanthanide ions, and the resulting complexes are 
useful as contrast agents for ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Generation, Purification, and Characterization of Cell-invasive DISC1 Protein Species

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases Alzheimer's disease (A&beta;, tau), Parkinson's Disease (&alpha;-synuclein), Huntington's disease (polyglutamine, huntingtin), and others. Protein aggregation is thought to occur due to disturbed proteostasis, i.e. the imbalance between the arising and degradation of misfolded proteins. Of note, the same proteins are found aggregated in sporadic forms of these diseases that are mutant in rare variants of familial forms.
Schizophrenia is a chronic progressive brain condition that in many cases goes along with a permanent and irreversible cognitive deficit. In a candidate gene approach, we investigated whether Disrupted-in-schizophrenia 1 (DISC1), a gene cloned in a Scottish family with linkage to chronic mental disease1, 2, could be found as insoluble aggregates in the brain of sporadic cases of schizophrenia3. Using the SMRI CC, we identified in approximately 20 % of cases with CMD but not normal controls or patients with neurodegenerative diseases sarkosyl-insoluble DISC1 immunoreactivity after biochemical fractionation. Subsequent studies in vitro revealed that the aggregation propensity of DISC1 was influenced by disease-associated polymorphism S704C4, and that DISC1 aggresomes generated in vitro were cell-invasive5, similar to what had been shown for A&beta;6, tau7-9, &alpha;-synuclein10, polyglutamine11, or SOD1 aggregates12. These findings prompted us to propose that at least a subset of cases with CMD, those with aggregated DISC1 might be protein conformational disorders.
 Here we describe how we generate DISC1 aggresomes in mammalian cells, purify them on a sucrose gradient and use them for cell-invasiveness studies. Similarly, we describe how we generate an exclusively multimeric C-terminal DISC1 fragment, label and purify it for cell invasiveness studies. Using the recombinant multimers of DISC1 we achieve similar cell invasiveness as for a similarly labeled synthetic &alpha;-synuclein fragment. We also show that this fragment is taken up in vivo when stereotactically injected into the brain of recipient animals.

The generation, purification and cell invasion of intracellular, cytoplasmic full length DISC1 protein aggresomes from cell cultures and of a labeled, multimeric recombinant DISC1 protein fragment in E. coli are described. Cell invasiveness is shown for recipient cells in cell culture and for neurons in vivo after stereotactical brain inoculation.

Generation, Reinigung und Charakterisierung von Cell-invasive DISC1 Protein Spezies

Protein aggregation is seen as a general hallmark of chronic, degenerative brain conditions like, for example, in the neurodegenerative diseases ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generierung von High Quality Chromatin Immunpräzipitation DNA Vorlage für Hochdurchsatz-Sequenzierung (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and the control of gene transcription in the cell nucleus. The kindlins are ~75 kDa multidomain proteins and bind to an NPxY motif and upstream T/S cluster of the integrin &#946;-subunit cytoplasmic tail. The hematopoietically-important kindlin isoform, kindlin-3, is critical for platelet aggregation during thrombus formation, leukocyte rolling in response to infection and inflammation and osteoclast podocyte formation in bone resorption. Kindlin-3&#39;s role in these processes has resulted in extensive cellular and physiological studies. However, there is a need for an efficient method of acquiring high quality milligram quantities of the protein for further studies. We have developed a protocol, here described, for the efficient expression and purification of recombinant murine kindlin-3 by use of a baculovirus-driven expression system in Sf9 cells yielding sufficient amounts of high purity full-length protein to allow its biophysical characterization. The same approach could be taken in the study of the other mammalian kindlin isoforms.

Kindlins are fundamental to cell adhesion through integrins but studies of them have been hampered by the difficulty encountered in expressing them recombinantly in bacterial hosts. We describe here methods for their efficient production in baculovirus-infected insect cells.

Effizienten Herstellung und Reinigung von rekombinantem murinem Kindlin-3 von Insektenzellen für biophysikalische Studien

Kindlins are essential coactivators, with talin, of the cell surface receptors&#160;integrins and also participate in integrin outside-in signalling, and ...

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and DNA accessibility by catalyzing ATP-dependent nucleosome remodeling. Biochemically dissecting the contributions of individual subunits of such complexes to the multi-step ATP-dependent chromatin remodeling reaction requires the use of assays that monitor the production of reaction products and measure the formation of reaction intermediates. This JOVE protocol describes assays that allow one to measure the biochemical activities of chromatin remodeling complexes or subcomplexes containing various combinations of subunits. Chromatin remodeling is measured using an ATP-dependent nucleosome sliding assay, which monitors the movement of a nucleosome on a DNA molecule using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA)-based method. Nucleosome binding activity is measured by monitoring the formation of remodeling complex-bound mononucleosomes using a similar EMSA-based method, and DNA- or nucleosome-dependent ATPase activity is assayed using thin layer chromatography (TLC) to measure the rate of conversion of ATP to ADP and phosphate in the presence of either DNA or nucleosomes. Using these assays, one can examine the functions of subunits of a chromatin remodeling complex by comparing the activities of the complete complex to those lacking one or more subunits. The human INO80 chromatin remodeling complex is used as an example; however, the methods described here can be adapted to the study of other chromatin remodeling complexes.

Here we describe biochemical assays that can be used to characterize ATP-dependent chromatin remodeling enzymes for their abilities to 1) catalyze ATP-dependent nucleosome sliding, 2) engage with nucleosome substrates, and 3) hydrolyze ATP in a nucleosome- or DNA-dependent manner.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...