Diese Arbeit wurde von NHI R01 Zuschuss GM59690 verliehen KLV unterstützt.

1. Erstmalige Beschreibung und Überlegungen <ol><li> Biofilm-Bildung wird im Allgemeinen durch die Zelldichte und die Wachstumsrate beeinflusst. Daher ist es notwendig, die Wachstumsrate (Zunahme der optischen Dichte (OD) über die Zeit) und Ausbeute (endgültige Zellzahl) des Stammes (e) von Interesse, indem einfache Wachstumskurve und Zellaussaatdichten Assays zu bestimmen. Defekte im Wachstum, oder eine fehlende Korrelation zwischen OD und Zellzahl, müssen berücksichtigt werden bei der Interpretation der Ergebnisse von Experimenten Spotting. </li><li> Schließen Sie die entsprechende positive und negative Kontrollen auf der gleichen Platte bei der Beurteilung faltige Kolonie-Bildung, als geringfügig von Platte zu Platte Variation Biofilmentwicklung auswirken können. </li><li> Identifizieren Sie die besten Bedingungen für das Auffinden, dh solche, die die deutlichsten Unterschiede zwischen der Kontrolle und Mutante (en) von Interesse zu offenbaren. Wachsen Stämme in Flüssigkultur unter verschiedenen Bedingungen, wie verschiedene Medien oder Temperaturen und anderen Stufes des Wachstums (exponentiellen oder stationären Phase) vor dem Spotting. Spot 10 ul der Kultur bei verschiedenen Zelldichten auf die entsprechenden Medien, und inkubieren Sie bei der gewünschten Temperatur bis Morphologien Kolonie sichtbar werden. </li><li> Der Endpunkt-Assay umfasst die Bewertung von faltiger Koloniebildung zu einem vorbestimmten Zeitpunkt nach dem Absetzen (dh 48 Stunden). Diese Einschätzung ist für nützlich, dass Stämme Ausstellung (oder werden vorgeschlagen, um zeigen) schweren Defekten in der Biofilmbildung. </li><li> Der zeitliche Verlauf Assay beurteilt faltige Kolonie-Bildung über einen bestimmten Zeitraum (zB jede Stunde) post-Spotting. Dieser Assay ermöglicht eine semi-quantitative Bewertung von Biofilmbildung durch die die Bestimmung des Beginns von faltiger Kolonie-Bildung und Entwicklung Muster über einen Zeitraum. Die Dauer des Experiments und die Anzahl der Sammelstellen für eine bestimmte Zeit Kurs sollte in Vorversuchen ermittelt werden. </li><li> Leicht nachvollziehen der Zeit post-Spotting, setzen Sie aufimer zu zählen. </li></ol> 2. Mikroskopische Beurteilung der Wrinkled Koloniemorphologie in V. fischeri <ol><li> Beimpfen V. fischeri Zellen in 5 ml LB-Salz (LBS) Medium 13 (1% [w / v] Trypton, 0,5% [w / v] Hefeextrakt, 2% [w / v] Natriumchlorid, 50 mM Tris-HCl [ pH 7,5]) enthält alle notwendigen Antibiotika und inkubieren unter Schütteln über Nacht bei 28 ° C Am Morgen, Subkultur der Zellen mit einer Verdünnung von 1:100 in 5 ml frisches Medium LBS und inkubieren unter den gleichen Bedingungen, bis die Zellen das gewünschte OD 600 erreicht haben (z. B. OD 600 = 0,2 oder 0,5). </li><li> 1 ml der Kultur in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifuge in einer Mikrozentrifuge Satz bei maximaler Geschwindigkeit für 1 Minute. Entfernen Sie den Überstand durch Absaugen. Die Zellen werden, um restliche Medien und extrazellulären Komponenten durch Resuspendieren des Pellets in 1 ml sterilem 70% künstlichem Meerwasser (ASW) (35 mM MgSO 4-7H 2 O, 7 mM CaCl entfernen2-2H 2 O, 210 mM NaCl, 7 mM KCl) und Wiederholen der Zentrifugation. Resuspendieren Sie das gewaschene Pellet in 1 ml 70% ASW. </li><li> Stellen Sie sicher, dass jede Probe die gleiche Anzahl von Zellen, wie durch die OD bei 600 nm geschätzt enthält. Nehmen Sie die erforderlichen Anpassungen durch Verdünnen konzentrierter Proben mit zusätzlichen 70% ASW. In Vorversuchen an Ort und Stelle zu verschiedenen Kulturen Anfangs-OD-Werte für eine optimale Ausgangspunkt OD für eine gegebene Menge von Stämmen oder Bedingungen zu bestimmen. Die besten Ergebnisse werden erzielt für V. fischeri, wenn Flecken aus Kulturen mit einem Außendurchmesser von etwa 0,2 erzeugt werden. </li><li> Spot 10 ul der gewaschenen Zellen auf LBS-Platten, die alle notwendigen Antibiotika. Beim Absetzen einer Kultur auf eine Platte, vergewissern Sie sich, um stetig die Pipette (mit dem Finger) knapp über der Agar-Oberfläche. Punkt der Abbildung, nicht in einem Winkel, und werfen Sie die Flüssigkeit langsam für eine gleichmäßige Verteilung des Spots. Typischerweise Jeder Stamm wird einmal pro Platte entdeckt (bis zu 6 Punkte pro Platte), with mehrere Platten (2-3) pro Experiment. </li><li> Um sicherzustellen, dass das gefleckte Kultur gleichmäßig verteilt bleibt, damit der Ort, um vor dem Bewegen der Platte in den Inkubator zu trocknen. Kehren Sie die Platten und inkubieren sie bei 28 ° C </li><li> Überwachen Sie die Morphologie der wachsenden Ort stündlich Anfang an 12-15 Stunden nach der Impfung. Wir verwenden ein Binokular (Zeiss Stemi 2000-C) mit einer Kamera Befestigung (ProgRes C10 PLUS) und der ProgRes CapturePro und ImageJ Software-Programme zu beobachten und zu dokumentieren Koloniemorphologie und um den Beginn und das Fortschreiten der faltige Kolonie-Bildung zu bewerten. </li><li> Für die spezifische Konfiguration in Schritt 2.5 aufgeführt, werden die Spots von unten durch eine transparente Glas-Bühne mit einer CL 1500 EG kalte Lichtquelle beleuchtet, während die Bilder von oben erfasst werden. Dieses Setup ist optimal für die Bildgebung faltige Kolonie Entwicklung, weil V. fischeri Kolonien (Spots) sind durchscheinend. </li><li> In Abwesenheit der spezifischen Ausrüstung Runde aufgeführtEP 2.5, Monitor faltig Koloniemorphologie mit jedem Seziermikroskop sich für die vollständige Kolonie Betrachtungswinkel ermöglicht und verfügt über eine verstellbare Lichtquelle und im Idealfall eine angeschlossene Kamera. Falls erforderlich, kann eine digitale Kamera auch in Abwesenheit von einer angeschlossenen Kamera verwendet werden, aber das ist nicht optimal. </li><li> Um die besten sichtbar faltige Volksentwicklung, ist es notwendig, sowohl die Beleuchtungsstärke und Reflexionswinkel unterhalb der Bakterienkolonien, so dass die dreidimensionale Morphologie der Entwicklung von Biofilmen zu verzeichnen ist einzustellen. Bestimmung der optimalen Lichtverhältnissen, die den stärksten Kontrast zwischen der entdeckt Kolonie und dem umgebenden Hintergrund-Agar, so dass die Architektur (Falten) der Kolonie deutlich unterscheidbar ist bereitzustellen. </li><li> In einigen Fällen muss die Farbe des gefleckten Kolonie auch berücksichtigt werden, wie Veränderungen in Farbe Kolonie während Biofilmbildung auftreten können. Einstellen der Intensität und des Winkels der Lichtquelle zu offenbarendiese subtilen Veränderungen in der Färbung. Sobald die entsprechenden Einstellungen erreicht werden, halten sie für die Dauer des Experiments. </li><li> Beachten Sie, wie viel Zeit verstreicht von der Zeit der Inokulation zu dem Zeitpunkt, zu dem faltigen Koloniebildung initiiert für jeden Stamm oder eines Zustands. Den Anfangspunkt von faltiger Koloniebildung als der Zeitpunkt, bei dem die Bildung von Mustern und 3D-Strukturen (dh Streifen bildet sich an der äußeren Kante oder &quot;Wellen&quot; auftritt in der Mitte) zunächst ersichtlich. Mutierte Zellen verringert oder erhöht werden, um Zeit aufweisen Beginn von faltiger Koloniebildung (z. B. Bild. 2). </li><li> Dokumentieren Sie die Start-und Entwicklung von faltige Kolonie-Bildung durch die Erfassung geeigneter digitaler Bilder. Es ist wichtig, um die gleiche Vergrößerung zu verwenden, wenn das Sammeln von Bildern während des Experiments. Schalten Sie den Blick aus dem Okular des Mikroskops auf dem Computer-Bildschirm mit dem Hebel auf der Rückseite der Kamera befindet. Beim Umschalten zwischen Okularund Computer-Bildschirm betrachten, stellen Sie den Blick und konzentrieren sich entsprechend. </li><li> Bevor Bildgebung spotted Kulturen, wird der Deckel der Petrischale in der Regel entfernt, um das klarste Bild zu liefern. Dies ist jedoch ein optionaler Schritt, er entdeckt Kulturen durch den Deckel mit dem Setup in den Schritten 2.5 und 2.6 beschrieben abgebildet werden kann. </li><li> Zu jedem Zeitpunkt nach Beginn der faltigen Koloniebildung, beachten Sie das Muster der faltige Kolonie Entwicklung. Die Architektur kann von innen nach außen zu entwickeln, oder von außen nach innen dieser Bewertung stellt einen Mechanismus, um die Biofilme von verschiedenen Stämmen oder unter unterschiedlichen Bedingungen ausgebildet unterscheiden. </li><li> Messen Sie den Durchmesser des sich entwickelnden Kolonie zu jedem Zeitpunkt. Dies kann manuell erfolgen, oder digital über eine zugehörige Software-Programm. Wenn dies geschehen ist digital, verwenden Sie die ProgRes CapturePro Software-Programm und erste Kalibrierung der Skala bar auf die spezifische Vergrößerung in dem Experiment verwendet. Fügen Sie die Balken in jedem Bild eingefangen. </li><li> Um die Kolonie mit dem Durchmesser ImageJ Software-Programm berechnen, öffnen Sie jede Bilddatei. Standardisierung der Maßstab wie folgt: Wählen Sie den &quot;Straight-Option&quot; aus der Symbolleiste. Überlagern des eingebetteten Maßstab mit einer geraden Linie von der gleichen Länge und Breite. Wählen Sie &quot;Set Scale&quot; aus der Registerkarte mit der Bezeichnung &quot;Analyze&quot;. In der &quot;bekannten Strecke&quot;-Box, legen Sie die entsprechende Länge (von der Original-Maßstab bestimmt, dh 2 mm), und wählen Sie &quot;OK&quot;. </li><li> Verwenden Sie den &quot;Straight Line&quot;-Option, um eine horizontale Linie über der Stelle einfügen. Unter der Registerkarte Analysieren, wählen Sie &quot;Messen&quot;. In dem neuen Fenster Ergebnisse, wird die berechnete Länge zur Verfügung gestellt werden. Besorgen Sie sich eine zweite Messung, indem Sie einen senkrechten Linie quer über den Platz. Neuberechnung des Durchmessers. Notieren Sie den Mittelwert der beiden Messungen. Grafik den durchschnittlichen Durchmesser für jeden Fleck zu jedem Zeitpunkt über ein Software-Programm wie Excel. </li><li> Das Ende des Experiments erfolgt entweder zu einem festgelegten Zeitpunkt oder, wenn es keine weiterenEntwicklung des Biofilms. Wenn das Ende erreicht ist, zu konsolidieren die Bilder in einer Figur (en), um das Muster im Zeitablauf unter Verwendung eines Software-Programm, wie Powerpoint visualisieren. </li></ol> 3. Repräsentative Ergebnisse In diesen Experimenten verwendeten wir V. fischeri als Modellorganismus zur Bildung von Biofilmen durch die Auswertung der Entwicklung der runzligen Kolonien auf festem Agar-Oberfläche zu studieren. Biofilm-produzierende Stämme von V. fischeri bilden Kolonien mit umfangreichen 3D-Architektur innerhalb von 40 h (Abb. 1) 8,9,14. Wenn über einen Zeitverlauf untersucht, wird deutlich, dass faltige Koloniebildung durch Kontrollstamm schon um 12 leitet h nach Inokulation (abhängig von den spezifischen Bedingungen) (Abb. 2) 9. Im Gegensatz dazu wird Biofilmbildung ein Vertreter Mutante von etwa 4 h verzögert, nicht eingeleitet, bis ca. 16 h nach der Inokulation 9. REPEAts dieser Experimente vorgeschlagen, dass das Timing relativ konsistent war, so dass diese Einschätzung semi-quantitative 9. Eine zweite halb-quantitative Messung der Biofilmbildung nutzt die Änderung des Durchmessers des sich entwickelnden Kolonie im Laufe der Zeit. Wie in gezeigt. 3A, bildet eine repräsentative Biofilm-kompetenten Stamm Kolonien, dass Zunahme der Komplexität und Durchmesser relativ zu einem repräsentativen Belastungen, die nicht zu Biofilmen. Genaue Messungen über die Zeit der Durchmesser der Kolonien von diesen beiden Stämmen gebildeten zeigte, dass die Größe der Biofilm-zuständigen Kolonien mit einer größeren Geschwindigkeit als die Biofilm-negativen Kolonien erhöht und am Ende Zeitpunkt die beiden unterschiedlich um nahezu 2 - Falte (3B). Obwohl also Bilder eines repräsentativen Spät-Zeitpunkt oder &quot;Endpunkt&quot; Kolonie-Morphologie in der Literatur häufig dargestellt sind, können zusätzliche, semi-quantitative Daten gesammelt werden, die ein besseres Verständnis des Biofilms Defekt zu ermöglichen.<img alt="1" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig1.jpg" /> Abbildung 1. End-Point-Test. Diese Zahl ist ein Beispiel für eine Endpunkt-Assay unter Verwendung von nicht-repräsentativen Biofilm-bildenden (links) und Biofilm-bildenden (rechts) Stämme von V. fischeri. Diese Bilder wurden bei 40 h post-Spotting gesammelt. Diese Bilder wurden mit Wildtyp-V erzeugt fischeri, enthaltend einen Vektor-Kontrolle (nicht-Biofilm-bildenden) oder eine Überexpression RSCS Plasmid (Biofilm-bildenden) und waren Teil des Datensatzes für Morris et al., 2011 gesammelt. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig2.jpg" /> Abbildung 2. Zeit-Gänge-Assay. Das obere Feld enthält repräsentative Bilder von Biofilmbildung durch eine Biofilm-zuständigen Kontrollstamm von V. fischeri über einen ausgewählten zeitlichen Verlauf. Initiation der Biofilmbildung ist um 12 Uhr zeigt. Der untere Bereich enthält repräsentative iMagier von einem mutierten Stamm der V. fischeri, die eine Verzögerung (4h) in der Start von faltiger Koloniebildung im Laufe der Zeit, mit der Biofilmbildung Einleitung bei 16 h nach der Inokulation aufweist. Beachten Sie, dass bei 40 Stunden wurden die Stämme ähnliche in der Intensität und Strukturierung der Biofilm-Bildung zu suchen, während feine Unterschiede zwischen diesen Stämmen nur an den früheren Zeitpunkten beobachtet werden. Diese Bilder wurden mit RSCS überexprimierenden Wildtyp und Mutante generiert Sype V. fischeri Zellen und waren Teil des Datensatzes für Morris et al gesammelt., 2011. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4035/4035fig3.jpg" /> Abbildung 3. Colony Durchmesser als semi-quantitative Analyse der Biofilmbildung. (A) Zeitverlauf der Bildung von Biofilmen durch Vertreter Biofilm-bildenden (oberes Bild) und nicht-Biofilm-bildenden (unteres Bild) Stämme von V. fischeri. Beachten Sie, dass der Biofilm-bildenden Stamm eine stärkere Zunahme weistDurchmesser im Laufe der Zeit relativ zu dem nicht-bildender Stamm Biofilm. Diese Bilder wurden mit Wildtyp-V erzeugt fischeri, die eine Überexpression RSCS Plasmid (Biofilm-bildenden) oder ein Vektor-Kontrolle (nicht-Biofilm-bildenden) und waren Teil des Datensatzes gesammelt für Morris et al., 2011. (B) Grafische Darstellung des Anstiegs Koloniedurchmessers im Laufe der Zeit durch die beiden Stämme in der Platte A. Diese Daten unter Verwendung des ImageJ und Excel wurden wie in dem Protokoll behandelt.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

In dieser Arbeit beschreiben wir eine semi-quantitative Methode zur Beurteilung Biofilmbildung mit V. fischeri als Modellorganismus. Genauer gesagt, nutzen wir ein Binokular mit Kamera Befestigung an Biofilmbildung und Entwicklung als faltige Kolonie-Bildung im Laufe der Zeit auf einer festen Agar-Oberfläche überwachen. In diesem Protokoll, skizzieren wir zwei spezifische Arten von Methoden, die wir häufig benutzen, um faltige Kolonie-Bildung zu bewerten. Der erste ist der Endpunkt-Assay, die uns um die abschließende, umfassende 3D-Architektur, Strukturieren und Durchmesser eines gefleckten Kultur an einem ausgewählten &quot;endgültige&quot; Zeitpunkt beobachten können. Dieser Ansatz ist besonders nützlich für die Beurteilung der Mutanten oder Bedingungen, die auf dramatische Mängel in der Biofilmbildung führen. Allerdings ist dieser Ansatz nicht zwischen mehr feine Unterschiede auftreten Zeitpunkten vor dem ausgewählten Endpunkt zu unterscheiden. Um genauer zu überwachen faltig Koloniebildung, verwenden wir einen zeitlichen Verlauf Assay, mit dem wir den Beginn der w identifizieren könnenrinkled Koloniebildung und beobachten ihre Entwicklung im Laufe der Zeit. Durch diesen Ansatz können feinere Unterschiede in der Zeit von faltiger Koloniebildung, 3D-Architektur, und Strukturieren identifiziert werden. Wir nutzten diese Zeit natürlich Assay auf zwei semi-quantitative Untersuchungen der Biofilmbildung zu generieren. Erstens kann der Zeitpunkt, zu dem ein Stamm beginnt, 3D-Architektur zu entwickeln, die der Kontrolle Stämme verglichen werden. Wir haben festgestellt, dass die Verzögerung bei der Bildung von Biofilmen zu einer bestimmten Mutante unter den gleichen Bedingungen relativ konstant 9 ist. Zum Beispiel, in den Daten gezeigt. 2, die Mutante zeigte konsistent etwa 4 h Verzögerung bei der Einleitung Biofilmbildung. Eine zweite halb-quantitative Messung der Biofilmbildung ist die Veränderung der Größe des Durchmessers der gefaltete Kolonie (Ort). Wir haben festgestellt, dass der Durchmesser von faltiger Kolonien schrittweise unterscheidet sich von der nicht-Biofilm Kolonien erreicht über eine 2-facher Unterschied in der Endzeitpunkt (3 </strong&gt;) (Morris und Visick, unveröffentlichte Daten). Bis heute haben wir nicht eine Phänotyp ohne das andere (dh Bildung von Biofilmen ohne eine Erhöhung der Kolonie Durchmesser) (unveröffentlichte Daten) beobachtet, obwohl es möglich bleibt, einige Mutanten wird sich anders verhalten. In der Tat ist es für V. berichtet cholerae, dass einige faltige Kolonien führen zu einem erheblichen Anstieg der Kolonie Durchmesser, während andere dies nicht tun 15. Dennoch könnte die Beurteilung der Änderung des Durchmessers im Laufe der Zeit in der Charakterisierung von potentiellen Biofilm Mutanten und / oder unterstützen eine zusätzliche quantitatives Maß von Mutanten mit Verzögerungen in der Entwicklung. Von den beiden Maßnahmen der Biofilmbildung (Zeit und Durchmesser), die Festlegung des Beginns der faltigen Koloniebildung ist empfindlicher, aber auch mehr subjektive, als die Bestimmung des Durchmessers des Spots. Trotzdem bieten beide Maßnahmen eine semi-quantitative Bewertung von einem Phänotyp, die äußerst nützlich, um Biofilm-Forscher aber nicht ohne weiteres zugänglich ist quantification. Bei der Durchführung von Tests entdeckt kultiviert, ist es wichtig, die Umgebungsbedingungen, in denen die entdeckten Stämme kultiviert werden, zu berücksichtigen. Wrinkled Koloniebildung wird oft von verschiedenen Umweltbedingungen, einschließlich der Verfügbarkeit von Nährstoffen, Temperatur und Luftfeuchtigkeit beeinflusst. Um die Variabilität zwischen den Experimenten zu reduzieren, ist es hilfreich, diese Bedingungen zu standardisieren so viel wie möglich (dh die Normung der Agarplatten zu einem festgelegten Volumen und Kultivieren der entdeckt Stämme bei einer kontrollierten Temperatur). Zur weiteren Kontrolle, die Variabilität zwischen Spotting Experimente, ist wichtig, um die entsprechenden Kontrolle-Stämme innerhalb jeder Gruppe von Experimenten sind. Schließlich, bei der Interpretation der Daten aus diesen Tests ist es notwendig, jede einem Experiment mehrmals (3 +), insbesondere bei der Bewertung durchzuführen feine Unterschiede in faltige Koloniebildung (zB eine Verzögerung in der Biofilmbildung oder Strukturieren Unterschiede). Einige Einschränkungen dieses Protokolls sind: 1) dann selbst bestimmenIng. ob Zellen einen Defekt in Wachstum haben kann schwierig sein: das Wachstum von Zellen in Flüssigkultur Umständen nicht genau Wachstumsraten auf festen Medien, und eine genaue Bestimmung des Wachstums von Biofilm-bildenden Zellen, die zusammenhalten, nicht möglich sein kann; 2) Stämme mit Wachstumsstörungen wird es problematisch zu analysieren, 3) es nicht möglich sein, Unterschiede zwischen Stämmen Durchmesser mit feinen Biofilm-Phänotypen zu unterscheiden, 4) für Stämme, die nicht in einem konzentrischen Ring nicht wachsen kann es nicht möglich, genau zu messen Veränderungen im Durchmesser, 5), während Strukturieren während Biofilmbildung beobachtet werden kann, gibt es keine Möglichkeit, die Strukturierung der resultierenden Biofilm zu quantifizieren, und 6) gibt es keine Möglichkeit, um die Z-Dimension des Biofilms mit diesem experimentellen Aufbau zu messen . Trotz dieser Beschränkungen dieses Protokoll jedoch stellt ein Mittel, um numerische Daten zu erhalten, um bei der Beurteilung faltige Koloniebildung zu unterstützen. In diesem Protokoll, verwenden wir eine spezielle BildgebungSystem (dh, ein Zeiss Binokular und ProgRes CapturePro Imaging-Software) zu beobachten und auszuwerten faltig Koloniebildung. Abbildungssystem hier beschriebenen ist stark: die Fähigkeit, den Beginn von faltiger Koloniebildung zu erfassen, und somit zu beurteilen Entwicklung mit einem zeitlichen Verlauf Ansatz wird stark durch die Verwendung von einem Präpariermikroskop verbessert. Allerdings, wenn diese Technologie nicht verfügbar ist, kann das Protokoll für die Verwendung mit anderen Geräten, einschließlich einer einfachen Digitalkamera mit einem Zoom-Fokus angepasst werden. Während dieses Protokoll steht die Bewertung von faltiger Volksentwicklung, könnte es auch so modifiziert werden Pellikelbildung, eine Form von Biofilm, der, wenn die Zellen wachsen statisch in flüssiger Kultur entsteht bewerten. Dieses Protokoll kann auch als nützlich erweisen bei der Beurteilung der anderen Indikatoren der Biofilmbildung, einschließlich der Berücksichtigung von speziellen Farbstoffen in die gefleckten Kolonien während der Entwicklung von Biofilmen. Diese umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Farbstoffe, wie Kongorot und calcoflu beschränktoder die auf die Cellulose, eine gemeinsame Komponente von bakteriellen Biofilmen 16 zu binden. Zusätzlich Dieses Protokoll, obwohl für den Einsatz entwickelt mit V. fischeri, ist nicht auf diese beschränkt, sondern Organismus kann verallgemeinert werden, um das Studium Biofilmbildung in zahlreichen verschiedenen Organismen, wie Bacillus subtilis 4, 5 Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus 6 und Pseudomonas aeruginosa 7, die zeigen alle faltigen Koloniebildung. Schließlich kann es auch angepasst an andere Morphologien Kolonie, die ein Entwicklungsmuster, wie zum Beispiel, möglicherweise, der Strukturierung, die während des Wachstums von xanthus 17 und Antenne Strukturentwicklung in Pseudomonas aeruginosa 18 auftritt haben zu studieren. Dieses Protokoll ist somit der allgemeinen Benutzung zur Mikrobiologie und Biofilm-Forscher.

<html><table border="1"><tbody><tr><td> Name der Ausrüstung </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000-C Lupen-Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> 45505300000000000 </td><td> (Erhalten durch Lukas Mikroskop) </td></tr><tr><td> ProgRes C10 PLUS </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> 017953-602-26 </td><td> Kamera-Aufsatz (erhalten durch Lukas Microscope) </td></tr><tr><td> CL 1500 EG-Kaltlichtquelle </td><td> Zeiss </td><td> 4355400000000000 </td><td> (Erhalten durch Lukas Mikroskop) </td></tr><tr><td> ProgRes CapturePro </td><td> JENOPTIK Optical Systems GmbH </td><td> Kostenlose Software mit registrierten Kamera </td><td> Computer-Programm für die Bilderfassung </td></tr><tr><td> Image J </td><td> NIH </td><td> Kostenlose Software aus:ij / download.html &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html </td><td> Computerprogramm für die Messungen des Durchmessers </td></tr></tbody></table>

a semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development

Biofilme, oder die Oberfläche gebundenen Gemeinschaften von Zellen in einer extrazellulären Matrix verkapselt, stellen einen gemeinsamen Lebensstil für viele Bakterien. Innerhalb eines Biofilms, bakteriellen Zellen weisen oft Physiologie verändert wurde, einschließlich erhöhte Resistenz gegen Antibiotika und andere Belastungen der Umwelt ein. Darüber hinaus können Biofilme spielen eine wichtige Rolle in der Wirt-Mikroben-Interaktionen. Biofilme entstehen, wenn Bakterien Übergang von einzelnen, zu planktonischen Zellen bilden komplexe, mehrzellige Gemeinschaften 2. Im Labor sind Biofilme durch die Beurteilung der Entwicklung von spezifischen Phänotypen Biofilm untersucht. Eine gemeinsame Biofilm-Phänotyp beinhaltet die Bildung faltig oder runzelig Bakterienkolonien auf Agar-Medien 3. Wrinkled Koloniebildung erlaubt ein besonders einfaches und nützliches Mittel zur Identifizierung und Charakterisierung Bakterienstämme, die eine veränderte Biofilm-Phänotypen, und an Umweltbedingungen, die Einfluss auf die Biofilmbildung zu untersuchen. Wrinkled Koloniebildung dient als Indikator der Biofilmbildung in einer Vielzahl von Bakterien, einschließlich sowohl Gram-positive Bakterien, wie Bacillus subtilis 4, und Gram-negative Bakterien, wie Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7 und Vibrio fischeri 8. Die marinen Bakterium V. fischeri wurde zum Vorbild für die Bildung von Biofilmen durch die kritische Rolle von Biofilmen bei Host Kolonisation: Biofilme durch produzierte V. fischeri Förderung ihrer Besiedlung der hawaiianischen Bobtail Squid Euprymna scolopes 10.08. Wichtig ist, korreliert Biofilm-Phänotypen in vitro beobachtet mit der Fähigkeit von V. fischeri Zellen wirksam zu kolonisieren Wirtstiere: Stämme für die Bildung von Biofilmen in vitro beeinträchtigt besitzen eine Kolonisierung Defekt 9,11, während die Stämme, die eine erhöhteBiofilm-Phänotypen sind für die Besiedlung 8,12 verbessert. V. fischeri ist somit ein einfaches Modellsystem, um die Mechanismen, durch die Bakterien regulieren Biofilmbildung und wie Biofilme Auswirkungen Host Kolonisation zu beurteilen. In diesem Bericht beschreiben wir eine semi-quantitative Methode zur Beurteilung Biofilmbildung mit V. fischeri als Modellsystem. Dieses Verfahren beinhaltet die sorgfältige Spotting von Bakterienkulturen in definierten Konzentrationen und Volumina auf Agar-Medien, eine gefleckte kultur ist gleichbedeutend zu einer einzelnen Kolonie. Diese &quot;spotted Kultur&quot; Technik kann genutzt werden, um grobe Biofilm-Phänotypen bei einzelnen, vorgegebenen Zeit-Punkte (Endpunkt-Assays) zu vergleichen oder zu identifizieren und zu charakterisieren subtile Biofilm-Phänotypen durch die Zeit-Gänge-Assays von Biofilm Entwicklung und Messungen der Kolonie Durchmesser werden , der durch Bildung von Biofilmen beeinflusst. Somit stellt diese Technik eine semi-quantitative Analyse der Bildung von Biofilmen, promitting Auswertung der Zeitpunkt und die Strukturierung von faltige Kolonie Entwicklung und der relativen Größe des sich entwickelnden Struktur, Eigenschaften, die über die einfache Morphologie insgesamt zu verlängern.

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A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Wir bieten eine einfache, semi-quantitative Methode zur Biofilm-Bildung zu untersuchen<em&gt; In-vitro-</em&gt;. Diese Methode nutzt die Vorteile des Zeiss Stemi 2000-C Lupen-Mikroskop (mit Kamera-Anhang), um sowohl das Timing und die Muster der Bildung von Biofilmen zu überwachen, wie durch die Entwicklung der runzligen Kolonien beurteilt.

Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

a-semi-quantitative-approach-to-assess-biofilm-formation-using

Research

JoVE Journal

Biology

23.1K Aufrufe.  Loyola University Medical Center. Wir bieten eine einfache, semi-quantitative Methode zur Biofilm-Bildung zu untersuchen In-vitro-. Diese Methode nutzt die Vorteile des Zeiss Stemi 2000-C Lupen-Mikroskop (mit Kamera-Anhang), um sowohl das Timing und die Muster der Bildung von Biofilmen zu überwachen, wie durch die Entwicklung der runzligen Kolonien beurteilt.

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A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic activity of vascular endothelial cells in vitro1-5. However, recently growing evidence has shown that this assay is not limited to test vascular behavior for endothelial cells. Instead, it also has been used to test the ability of a number of tumor cells to develop a vascular phenotype6-8. This capability was consistent with their vasculogenic behavior identified in xenotransplanted animals, a process known as vasculogenic mimicry (VM)9. There is a multitude of evidence demonstrating that tumor cell-mediated VM plays a vital role in the tumor development, independent of endothelial cell angiogenesis6, 10-13. For example, tumor cells were found to participate in the blood perfused, vascular channel formation in tissue samples from melanoma and glioblastoma patients8, 10, 11. Here, we described this tubular network assay as a useful tool in evaluation of vasculogenic activity of tumor cells. We found that some tumor cell lines such as melanoma B16F1 cells, glioblastoma U87 cells, and breast cancer MDA-MB-435 cells are able to form vascular tubules; but some do not such as colon cancer HCT116 cells. Furthermore, this vascular phenotype is dependent on cell numbers plated on the Matrigel. Therefore, this assay may serve as powerful utility to screen the vascular potential of a variety of cell types including vascular cells, tumor cells as well as other cells.

A tube formation assay is used to evaluate vascular activity of tumor cells.

Ein Matrigel-Based Rohr Formation Assay zur vaskulären Aktivität von Tumorzellen Beurteilen

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Forschung

Biologie

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

Umbau eines Capture-ELISA zu einem Luminex xMAP Assay unter Verwendung eines Multiplex-Antikörper-Screening-Methode

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of genetically-encoded fluorescent proteins has proven a valuable strategy for elucidating dynamic morphogenetic processes as they occur in the intact organism. During the past decade, the development of photoactivatable and photoconvertible fluorescent proteins has opened the possibility to investigate the fate of discrete subpopulations of tagged proteins1. Unlike photoactivatable proteins, photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) are readily tracked and imaged in their native emission state prior to photoconversion, making it easier to identify and select regions by optical inspection. PCFPs, such as Kaede2, KikGR3, Dendra4 and EosFP5, can be shifted from green to red upon exposure to UV or blue light due to a His-Tyr-Gly tripeptide sequence which forms a green chromophore that can be photoconverted to a red one by a light-catalyzed &beta;-elimination and subsequent extension of a &pi;-conjugated system3. PCFPs and their monomeric variants are useful tools for tracking cells6-10 and studying protein dynamics11-14, respectively. During recent years, PCFPs have been expressed in different animal model, such as zebrafish6, chicken7,8 and mouse9,10 for cell fate tracking. Here we report a protocol for cell-specific photoconversion of PCFPs in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted proteins at later developmental stages. This methodology allows studying, in a tissue-specific manner, cell biological events underlying morphogenesis in the zebrafish animal model.

Here, we present a method for the photoactivated switch of photoconvertible fluorescent proteins (PCFPs) in the living zebrafish embryo and further tracking of photoconverted protein at specific time points during development. This methodology allows monitoring of cell biological events underlying different developmental processes in a live vertebrate organism.

Handy-Tracking Mit Photoconvertible Proteine ​​während der Zebrafisch-Entwicklung

Embryogenesis is a dynamic process that is best studied by using techniques that allow the documentation of developmental changes in vivo. The use of ...

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to the histological and morphological development of vertebrate embryos. In particular, the use of chimeric embryos has established the importance of neural crest in directing the species-specific morphology of the craniofacial complex. The method described herein utilizes two avian species, duck and quail, with remarkably different craniofacial morphology. This method greatly facilitates the investigation of molecular and cellular regulation of species-specific pattern in the craniofacial complex.&#160;Experiments in quail and duck chimeric embryos have already revealed neural crest-mediated tissue interactions and cell-autonomous behaviors that regulate species-specific pattern in the craniofacial skeleton, musculature, and integument. The great diversity of neural crest derivatives suggests significant potential for future applications of the quail-duck chimeric system to understanding vertebrate development, disease, and evolution.

This article describes a method to generate chimeric embryos that are&#160;designed to test the species-specific contributions of neural crest and/or other tissues to craniofacial development.

Die Beurteilung artspezifische Um Beiträge Craniofacial Entwicklung mit Wachtel-Ente Chimären

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

The Soft Agar Colony Formation Assay

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft agar colony formation assay is a well-established method for characterizing this capability in vitro and is considered to be one of the most stringent tests for malignant transformation in cells. This assay also allows for semi-quantitative evaluation of this capability in response to various treatment conditions. Here, we will demonstrate the soft agar colony formation assay using a murine lung carcinoma cell line, CMT167, to demonstrate the tumor suppressive effects of two members of the Wnt signaling pathway, Wnt7A and Frizzled-9 (Fzd-9). Concurrent overexpression of Wnt7a and Fzd-9 caused an inhibition of colony formation in CMT167 cells. This shows that expression of Wnt7a ligand and its Frizzled-9 receptor is sufficient to suppress tumor growth in a murine lung carcinoma model.

The soft agar colony formation assay is a method used to confirm cellular anchorage-independent growth in vitro. The goal of this protocol is to illustrate a stringent method for the detection of the tumorigenic potential of transformed cells and the tumor suppressive effects of proteins on transformed cells.

Die Soft-Agar Koloniebildungstest

Anchorage-independent growth is the ability of transformed cells to grow independently of a solid surface, and is a hallmark of carcinogenesis. The soft ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

Interzelluläre Gap Junction-Kommunikation: Eine funktionelle Biomarker zur Beurteilung Unerwünschte Auswirkungen von Schadstoffen und Toxinen und gesundheitlichen Vorteile von Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

Development of an Individual-Tree Basal Area Increment Model using a Linear Mixed-Effects Approach

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots located in Xinjiang Province, northwest China. To prevent high correlations among observations from the same sampling unit, we developed the model using a linear mixed-effects approach with random plot effect to account for stochastic variability. Various tree- and stand-level variables, such as indices for tree size, competition, and site condition, were included as fixed effects to explain the residual variability. In addition, heteroscedasticity and autocorrelation were described by introducing variance functions and autocorrelation structures. The optimal linear mixed-effects model was determined by several fit statistics: Akaike&#8217;s information criterion, Bayesian information criterion, logarithm likelihood, and a likelihood ratio test. The results indicated that significant variables of individual-tree basal area increment were the inverse transformation of diameter at breast height, the basal area of trees larger than the subject tree, the number of trees per hectare, and elevation. Furthermore, errors in variance structure were most successfully modeled by the exponential function, and the autocorrelation was significantly corrected by first-order autoregressive structure (AR(1)). The performance of the linear mixed-effects model was significantly improved relative to the model using ordinary least squares regression.

Mixed-effects models are flexible and useful tools for analyzing data with a hierarchical stochastic structure in forestry and could also be used to significantly improve the performance of forest growth models. Here, a protocol is presented that synthesizes information relating to linear mixed-effects models.

Entwicklung eines Individual-Tree Basal Area Increment Modells mit einem linearen Mixed-Effects-Ansatz

Here, we developed an individual-tree model of 5-year basal area increments based on a dataset including 21898 Picea asperata trees from 779 sample plots ...

Harvesting and Disaggregation: An Overlooked Step in Biofilm Methods Research

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the surface and disaggregating the clumps, and analyzing the sample. Of the four steps, harvesting and disaggregation are the least studied but nonetheless critical when considering the potential for test bias. This article demonstrates commonly used harvesting and disaggregation techniques for biofilm grown on three different surfaces. The three biofilm harvesting and disaggregation techniques, gleaned from an extensive literature review, include vortexing and sonication, scraping and homogenization, and scraping, vortexing and sonication. Two surface types are considered: hard non-porous (polycarbonate and borosilicate glass) and porous (silicone). Additionally, we provide recommendations for the minimum information that should be included when reporting the harvesting technique followed and an accompanying method to check for bias.

This paper details methods that demonstrate three common biofilm harvesting and disaggregation techniques on two surface types, ruggedness testing of a harvesting method and minimum information to consider when choosing and optimizing harvesting and disaggregation techniques to increase reproducibility.

Ernte und Disaggregation: Ein übersehener Schritt in der Erforschung von Biofilmmethoden

Biofilm methods consist of four distinct steps: growing the biofilm in a relevant model, treating the mature biofilm, harvesting the biofilm from the ...

Bewertung der Bildung von Acinetobacter-Biofilmen und Charakterisierung von Biofilmen

Quantification, Viability Assessment, and Visualization Strategies for Acinetobacter Biofilms

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, biofilm quantification and visualization are important methods to assess the potential of Acinetobacter strains to cause nosocomial infections. The biofilms forming on the surface of the microplate can be quantified in terms of volume and cell numbers. Biofilm volumes can be quantified by staining using crystal violet, washing, destaining using ethanol, then measuring the solubilized dye using a microplate reader. To quantify the number of cells embedded in the biofilms, the biofilms are scrapped off using cell scrapers, harvested in the saline, vigorously agitated in the presence of glass beads, and spread on Acinetobacter agar. Then, the plates are incubated at 30 &#176;C for 24-42 h. After incubation, the red colonies are enumerated to estimate the number of cells in biofilms. This viable count method can also be useful for counting Acinetobacter cells in mixed-species biofilms. Acinetobacter biofilms can be visualized using fluorescent dyes. A commercially available microplate designed for microscopic analysis is employed to form biofilms. Then, the bottom-surface attached biofilms are stained with SYTO9 and propidium iodide dyes, washed, then visualized with confocal laser scanning microscopy.

Autor im Rampenlicht: Ein umfassendes Protokoll für die Quantifizierung, Bewertung und Visualisierung von Acinetobacter-Biofilmen 

This protocol describes the preparation of the inoculum, the biofilm quantification on microtiter plates using crystal violet dye, the viable count in biofilms, and the visualization of biofilms of Acinetobacter.

Quantifizierung, Viabilitätsbewertung und Visualisierungsstrategien für Acinetobacter-Biofilme

Acinetobacter causes nosocomial infections and its biofilm formation can contribute to the survival on dry surfaces such as hospital environments. Thus, ...