Mit dieser Mengendurchflusszytometrie-Methode können Forscher die kinetischen und Gleichgewichtsbräuche der eingebrachten Membraninteraktion berechnen und die Anzahl der Proteine schätzen, die von Stellen auf der PPH-Membran eingebracht werden. Die Vorteile dieser Methode sind die Einfachheit und Verfügbarkeit von Reagenzien und Geräten. Diese Methode dient ausschließlich der Grundlagenforschung.
Das Protokoll wurde entwickelt, um Proteinlipidwechselwirkungen in der Blutberechnung zu untersuchen, und kann in anderen Bereichen verwendet werden, um die Wechselwirkung von Proteinen mit verschiedenen Lipidmembranen zu charakterisieren. Die Methode kann für die Mengenbewertung der Ligandenbindungsdynamik an den verschiedenen Zellen und Ligandentypen verwendet werden. Beginnen Sie die kinetischen Bindungsexperimente, indem Sie die Phospholipidvesikel im Tyrode-Puffer auf eine Konzentration von einem Mikromolar und ein Gesamtvolumen von 250 Mikrolitern verdünnen.
Mischen Sie dann fluoreszierend markierten Gerinnungsfaktor X oder FX FD und eine Konzentration von 500 Nanomolar mit den Phospholipidvesikeln in einem Verhältnis von eins zu eins, um ein Gesamtvolumen von 500 Mikrolitern zu erhalten. Injizieren Sie sofort 500 Mikroliter der gemischten Suspension in das Durchflusszytometer. Bei einer Durchflussrate mit einer Anregungswellenlänge von 488 Nanometern und einem Emissionsfilter von 585 Nanometern; mit einer Breite von 42 für Kanal FL zwei.
Als nächstes messen Sie die mittlere Fluoreszenz in Kanal FL vier mit Anregung bei 633 Nanometern und Emissionsfilter bei 660 Nanometern mit einer Breite von 20. Wenn die Sättigung der Bindung erreicht ist, verdünnen Sie die Probe schnell um das 20-fache mit dem Tyrode-Puffer und überwachen Sie die Dissoziation, bis eine Basisfluoreszenz oder ein Plateau erreicht ist. Für Gleichgewichtsbindungsexperimente werden fünf mikromolare künstliche Phospholipidvesikel mit unterschiedlichen Konzentrationen von FX FD von null bis 1000 nanomolar im Tyrode-Puffer für 20 Minuten inkubiert.
Nach der Inkubation verdünnen Sie jede Probe um das 20-fache auf ein Endvolumen von 200 Mikrolitern mit dem Puffer von Tyrode und analysieren Sie die verdünnte Probe dann innerhalb von 30 Sekunden durch Durchflusszytometrie. Um die Daten zu analysieren, exportieren Sie die Experimente im FSC-Format aus der Zytometrie-Datenerfassungssoftware in die Zytometersoftware zur Datenanalyse. Indem Sie die Datei auswählen und dann auf die Registerkarten Exportieren und FSC-Dateien klicken.
Sobald Sie fertig sind, öffnen Sie die FCS-Dateien in der Zytometer-Software, indem Sie die Dateien auf dem Computer auswählen und die Dateien in den Arbeitsbereich des Programms ziehen. Für das Gating der Mikrovesikel identifizieren Sie den Bereich der Mikrovesikel durch Fluoreszenz des lipophilen Farbstoffs, DIC 16 drei. Verwenden Sie dann die Schaltfläche "Plot" im Arbeitsblatt, um aus FL zwei D I C 16 in Protokollkoordinaten einen Punktplot-SSC zu erstellen.
Wählen Sie dann die rechteckige Gate-Taste, um einen Gating-Bereich zu zeichnen. Um die kinetischen Experimente zu analysieren, erstellen Sie ein Punktdiagramm unter Verwendung der Koordinaten der Fluoreszenz über die Zeit für die Region der Vesikel. Exportieren Sie als Nächstes die Daten über die Änderung der Fluoreszenz im Laufe der Zeit im CSV-Format;indem Sie Sample auswählen und mit der rechten Maustaste auf die Registerkarte Export klicken, gefolgt von FL viermal in Parametern, wählen Sie das Verzeichnis zum Speichern aus, bevor Sie auf das CSV-Format auswählen klicken und auf die Registerkarte Export klicken.
Öffnen Sie nach der Übertragung die CSV-Datei in einer statistischen Software, um die einfache gleitende durchschnittliche Fluoreszenz und die Zeit für jeweils 1000 Ereignisse zu berechnen, nähern Sie sich einem Diagramm der Abhängigkeit der einzelnen gleitenden durchschnittlichen Fluoreszenz von der Zeit unter der Annahme der exponentiellen Abhängigkeit und verwenden Sie den Wert, um die kinetische Assoziationskonstante mit einer Gleichung zu berechnen. Berechnen Sie dann die kinetische Dissoziationskonstante mit der Gleichung wie zuvor beschrieben. Um das Datum des Gleichgewichtsbindungsassays zu analysieren, bestimmen Sie die durchschnittliche Fluoreszenz von FX FD im Bereich der Vesikel für jede ausgewählte Konzentration von FX FD und nähern Sie sich dann der Abhängigkeit des gebundenen Faktors Fluoreszenz von der Konzentration des hinzugefügten Faktors unter der Annahme der Einzelplatzbindung an.
Berechnen Sie die durchschnittlichen Bindungsparameter mit einer Gleichung aus mindestens drei unabhängigen Wiederholungen. Fahren Sie fort, kalibrierte Perlen vorzubereiten, indem Sie gelfiltrierte Blutplättchen mit Calcium IANA 4A dreiundzwanzig, einhundertsiebenundachtzig in Gegenwart von 2,5 Millimolar Calciumchlorid für 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Addieren die aktivierten Blutplättchen die verschiedenen Konzentrationen von FX FD und inkubieren Sie die Blutplättchen mit zwei Volumenprozent Formaldehyd.
Nach einer Stunde stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Blutplättchen mit drei molaren Glycin und 5% BSA für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann reinigen Sie die Mischung aus dem nicht umgesetzten Farbstoff mit Zentrifugation bei 400 mal G für fünf Minuten. Entfernen Sie das Supernat, bevor Sie das Pellet im Puffer von Tyrode mit 0,5% BSA wieder suspendieren.
Als nächstes messen Sie den Fluoreszenzpegel der Kalibrierkügelchen in jeder Probe mit einem Spektrofluorometer und dann mit dem Durchflusszytometer. Bestimmen Sie die Anzahl der Perlen in jeder Probe mit Hilfe eines Zellzählers. Wandeln Sie die Fluoreszenzintensität der jeweiligen Perlenprobe mit einem Spektrofluorometer in die Konzentration des löslichen Fluoreszenzfarbstoffs um und berechnen Sie die Fluoreszenzfarbstoffkonzentration für die Anzahl der Spektrofluorometermoleküle neu.
Erstellen Sie ein Abhängigkeitsdiagramm der durchschnittlichen Fluoreszenz der Kügelchen in einem Durchflusszytometer auf der Anzahl der Flurophormoleküle für jede Probe. Nähern Sie sich dann der Abhängigkeit durch die Linienproportionalität an, indem Sie die Analyse anpassen und lineare Tabs in der richtigen Reihenfolge anpassen. Berechnen Sie aus der Näherung in der Gleichung den Umrechnungsfaktor der mittleren Fluoreszenz zu Bindungsstellen.
Berechnen Sie später die scheinbare Anzahl der Bindungsstellen pro Vesikel von Interesse. Die repräsentative Analyse zeigt Gating der künstlichen Phosphorlipidvesikel, die einen Mikrometer groß sind, mit dem eingearbeiteten lipophilen Fluoreszenzfarbstoff, Farbstoff I C 16, das Gate wurde basierend auf einer Probe gesetzt, die die gleiche Größe künstliche Lipidvesikel ohne den Fluoreszenzfarbstoff enthielt. Die Kinetik des Proteins, das an die Vesikel bindet, wurde in der ersten Phase analysiert, indem die Probe kontinuierlich gesammelt wurde.
Die gewonnenen Daten wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. Die durchflusszytometrischen Messungen sollten so schnell wie möglich nach dem Mischen der Lösungen und der Verdünnung mit dem Puffer von Tyrode beginnen. Die vorgeschlagene Methode könnte mit Oberflächenplasmaresonanz für die Untersuchung von Membranwechselwirkungen ergänzt werden, die hochempfindlich mit guter temporärer Auflösung ist und keine Lieferung erfordert Der Hauptvorteil dieser Methode ist ihre Zugänglichkeit und Einfachheit.
