Diese Arbeit wurde von der University of Western Ontario, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie unterstützt, und einen Zuschuss ER06-02-188 aus dem Ministryof Forschung und Innovation, Early Researcher Award. MMD wurde von einem CIHR-Trainings-Programm in der Reproduktion, frühe Entwicklung und die Auswirkungen auf die Gesundheit (REDIH) Graduate Scholarship unterstützt.

TAG 1 Stellen Sie folgende Lösungen frisch auf den Tag der Eizellenentnahme mit sterilem, destilliertem Wasser wie GIBCO Wasser. Um die Möglichkeit von DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden. 3% LMP-Agarose 30 mg niedrigem Schmelzpunkt (LMP) Agarose bis zu 1 ml H 2 O GIBCO lösen bei 70 ° C Lysis Solution 8 ul Lysispuffer 1 ul Proteinase K 1 ul 10% IGEPAL auf Eis bis zur Verwendung 2.01 Agarose: Lysis Solution (10 ul pro einzelne Eizelle, ist Betrag für 3 Oozyten) 20 ul 3% LMP-Agarose 10 pl Lysis Solution mischen bei 70 ° C SDS LySIS-Puffer (501 ul pro einzelnen Eizelle) <table border="0"><tbody><tr><td> 1x TE pH 7,5 </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> 50 pl </td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td></td><td> 501 ul </td></tr></tbody></table> 1. Eizellenentnahme <ol><li> Legen Sie die Maus seziert Eileiter in M2-Medium, und reißen Sie die Ampullen, die Cumulus-Zell-Komplex zu extrahieren. </li><li> Trennen Sie die Eizellen aus dem Cumulus-Zell-Komplex mit 0,3 mg / ml Hyaluronidase-Lösung in einem 30 ul Tropfen M2-Medium. Halten Sie die Oozyten in Lösung nur solange, wie es um die Cumulus-Zellen zu entfernen dauert, wie lange Exposition beschädigen könnten. Waschen Sie die Oozyten 3x in 30 ul Tropfen M2-Medium, das Entfernen Kumuluszellen in regelmäßigen Abständen. </li><li> Entfernen Sie das Zona pellucida mittels saurer Tyrode-Lösung. Legen Sie die Eizellen in einem 30 ul Tropfen der Lösung zuerst, und dann auf einen anderen übertragen 30ul Tropfen, wie alle Medien mitgeführt wird die Säure zu verdünnen und seine Effizienz zu reduzieren. Halten der Oozyten in Lösung nur so lange wie es die Zona zu entfernen, wie lange Belichtungszeit beschädigen könnten erfolgt. Hinweis: eine erhöhte Konzentration von sauren Tyrode-Lösung oder Pronase kann für den menschlichen Proben verwendet werden, da das menschliche Zona pellucida ist gegenüber einer Behandlung mit sauren Tyrode-Lösung als die Maus. </li><li> Waschen Sie die Eizellen noch einmal in einem 30 ul Tropfen M2-Medium. </li></ol> 2. Agarose Embedding und Lysis <ol><li> Um Agarose Einbettung durchführen, legen Sie die Lyse-Lösung auf einem 70 ° C Heizblock. Fügen Sie den vorgeheizten LMP-Agarose zur Lyse-Lösung, wodurch ein 2:1 Agarose: Lyse-Lösung. </li><li> Legen Sie eine einzelne Eizelle auf einen sauberen Objektträger aus Glas in minimalen M2 Medien. Nehmen Sie bis 10 ul der Agarose: Lyse-Lösung in eine Pipettenspitze, und (unter dem Mikroskop) sanft pressen eine kleine Menge (ca. 1 mu l oder weniger) auf den Objektträger, so dass sie mit dem minim mischenal Medien. Vorsichtig holen die Eizelle in die Pipettenspitze und legen Sie alle 10 pl in ein Eppendorf-Röhrchen mit 300 ul Mineralöl so die Raupe einer Kugel bildet. Hinweis: Dieser Prozess muss ziemlich schnell als der Agarose geschehen wird hart, wenn die Temperatur sinkt so wenig wie 5 ° C unter 70 ° C. </li><li> Das Röhrchen auf Eis für 10 Minuten. Zur Lyse durchführen, entfernen Sie die 300 ul Mineralöl und fügen Sie 500 ul des SDS Lysepuffer. Inkubieren über Nacht in einem 50 ° C Wasserbad. Hinweis: Lyse-Lösung (Tabelle 1) kann auch für diesen Zweck verwendet werden. </li></ol> TAG 2 Stellen Sie folgende Lösungen frisch am Tag der Bisulfit-Mutagenese. Um die Chance der DNA-Kontamination zu verringern, die Handschuhe wechseln oft und Filterspitzen. Halten Röhrchen entfernt, wenn sie geöffnet abgewinkelt ist und Erinnerung alle Rohre, wenn nicht in Gebrauch ist. Wir empfehlen, dass Lösungen wie n +1 gemacht werden. <table border="0"><tbody><tr><td> 3 M NaOH </td> &lt;td&gt; 2,4 g NaOH in 20 ml autoklavierten ddH 2 O </td></tr><tr><td> 0,1 M NaOH </td><td> 0,5 ml 3M in 14,5 ml autoklavierten ddH 2 O </td></tr><tr><td> 0,3 M NaOH </td><td> 1,5 ml 3M in 13,5 ml autoklavierten ddH 2 O </td></tr></tbody></table> 2,5 M Bisulfit-Lösung <ol class="lalpha"><li> 3,8 g Natriumbisulfit 5,5 ml GIBCO destilliertem H 2 O 1 ml 3 M NaOH auflösen @ Raumtemperatur </li><li> 110 mg Hydrochinon 1 ml GIBCO destilliertem H 2 O aufzulösen bei 90 ° C (nur so lange wie es zu lösen hat, zu mischen regelmäßig) </li></ol> Wenn vollständig aufgelöst ist, zu mischen Lösung (a) und (b) * Fernhalten von Licht * 3. Bisulfit-Mutagenese <ol><li> Vollständig entfernen Sie die 500 ul SDS Lysepuffer und 300 ul Mineralöl (~ 20 Stunden). Jede Lysepuffer übrigen wird verdünnen the Agarose, wenn es erhitzt wird und der Wulst wird anfälliger für Auflösen in den nachfolgenden Schritten. Fahren Sie mit Bisulfit-Mutagenese sofort, oder bei -20 ° C für bis zu 5 Tage. </li><li> Entfernen Sie gegebenenfalls Oozyten aus dem Gefrierschrank und tauen (nur bis Agarosekugel relativ lichtdurchlässig ist). Inkubieren für 2,5 Minuten auf 90 ° C Heizblock, nach dem Inkubieren auf Eis für 10 Minuten. Hinweis: Verwenden Sie nicht gleichzeitig oder rühren, verlängern länger als 2,5 Minuten, oder schwanken Temperatur. </li><li> Zur Denaturierung durchführen, entfernen Sie die Mineralöl-und 1 ml 0,1 M NaOH in jedes Röhrchen, Flick und invertieren 5-6 mal. </li><li> Inkubation: 15 Minuten bei 37 ° C im Wasserbad, Invertieren alle 3-4 Minuten. Der Wulst sollte in der NaOH schweben. </li><li> Um Bisulfit-Behandlung durchzuführen, drehen Sie das Rohr vorsichtig, dann entfernen Sie die NaOH und 300 ul Mineralöl und 500 pl Bisulfit-Lösung. Das Röhrchen für 3,5 Stunden in einem 50 ° C im Wasserbad. * Fernhalten von Licht * </strong&gt; Hinweis: Die Länge der Inkubation Möglicherweise müssen empirisch für Gen von Interesse bestimmt werden. </li><li> Um Desulfonierung durchführen, Inkubation auf Eis für 3 Minuten, entfernen Sie dann die Mineralöl-und die Bisulfit-Lösung, spinnen sanft, und 1 ml 0,3 M NaOH. Flick und invertieren 5-6 mal. </li><li> Inkubation: 15 Minuten bei 37 ° C im Wasserbad, Invertieren alle 3-4 Minuten. Der Wulst sollte in der NaOH schweben. </li><li> Waschen Sie die Proben, indem Sie zunächst die Spinnerei sanft, dann entfernen Sie die NaOH und 1 ml 1x TE pH 7,5. Schütteln Sie für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (auf einem Schüttler). Spin sanft wieder, dann entfernen Sie die 1x TE. Wiederholen Sie diesen Vorgang zweimal Waschen. </li><li> 1 ml autoklavierten ddH 2 O. Schütteln Sie für 5-10 Minuten bei Raumtemperatur (auf einem Schüttler). Spin sanft, dann entfernen Sie das H 2 O. Wiederholen Sie ddH 2 O Waschen zweimal. </li><li> Den pH-Wert des Überstands; sollte pH 5,0 sein. Wenn immer noch zu einfach, nachwaschen mit H 2 O. Entfernen Sie das gesamte Überstand, so dass nur die Agarose seinad. </li></ol> 4. 1. und 2. Runde PCR-Amplifikation <ol><li> Bereiten 1. Runde PCR-Mix ** beim Waschen ** </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 uM Primer vorderen äußeren </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 uM Primer Reverse-Outer </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 240 ng / ml tRNA </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 13 ul </td></tr></tbody></table> In den Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR Perlen Schieben Sie die feste Agarose-Kügelchen in die PCR-Röhrchen (~ 10 ul) Hitze bis 70 ° C und mischen In 25 ul Mineralöl Gesamt: 50 pl <ol start="2"><li> Verstärken Hinweis: Ein Beispiel-Bedingungen für Maus Snrpn ist Denaturierung 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 1 Minute bei 50 ° C und 1Minute bei 68 ° C und eine endgültige 10 Minuten Verlängerungsschritt bei 68 ° C Glühtemperatur für 1. Runde PCR für Maus und Peg3 H19 beträgt 50 ° C. </li><li> Bereiten 2. Runde PCR-Mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 10 uM Primer vordere innere </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> 10 uM Primer Reverse-Innere </td><td> 0,5 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 19 ul </td></tr></tbody></table> In den Illustra Ready-to-Go Hot Start PCR Perlen Geben Sie 5 ul 1. Runde Produkt als Vorlage. Erhitzen Sie die 1. Runde Produkt bis 70 ° C für 1 Minute, um die Agarose zu erweichen. Stellen Sie sicher, unter der Schicht aus Mineralöl pipettieren. In 25 ul Mineralöl Gesamt: 50 pl Hinweis: Verschachtelte Primersequenzen für Snrpn, H19 und Peg3 kann in Market-Urteil Velker et al 10 zu finden,12. <ol start="4"><li> Verstärken Hinweis: Die Zyklusbedingungen für Maus Snrpn ist Denaturierung 2 min bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 30 Sekunden bei 94 ° C, 1 Minute bei 50 ° C und 1 Minute bei 68 ° C und eine endgültige Dehnung 10 Minuten Schritt bei 68 ° C 10. Maus H19 und Peg3 eine 50 ° C Annealing-Temperatur für 2 Runde PCR. </li><li> Als eines diagnostischen Tests können zweiten Runde Proben mit einem Restriktionsenzym, das Methylierung oder Stamm-spezifische geschnitten werden. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2. Runde Produkt </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Restriktionsenzym </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Puffer </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table><ol start="6"><li> Elektrophorese die Verdauungsprodukte auf einem 8% igen Acrylamidgel. Etwaige heterogenen Banden repräsentieren mehr als eine sequence. </li></ol> 5. TA Cloning und Kolonie-PCR <ol><li> Um 2. Runde Produkt zunächst erwärmt auf 70 klonen ° C für 1 Minute, um die Agarose, dann Ligat in den Vektor unter Verwendung des Promega pGEM-T Vektor-System (Fisher Scientific Cat # A1360) zu erweichen. </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 2. Runde PCR </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> pGEMT-easy-Vektor </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Ligase </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> 2x Ligationspuffer </td><td> 5 ul </td></tr></tbody></table> Inkubieren über Nacht bei 4 ° C in PCR-Maschine. <ol start="2"><li> Auftauen kompetente E. coli Zellen auf Eis für 15 Minuten (Zymo Research Corp Cat # T3009). In 3 ul Ligationsreaktion zu 8 ul E. coli und inkubieren Ligation auf Eis für 15 Minuten. </li><li> Hitzeschock für 40 Sekunden in einem 42 ° C im Wasserbad,und auf Eis für 2 Minuten inkubiert. In 60 ul SOC-Medium und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde (im Shaker). </li><li> Legen Sie alle der Reaktionsmischung auf eine LB / Agar / IPTG / X-Gal / Amp-Platte und inkubieren Platte bei 37 ° C über Nacht. </li><li> Bereiten Kolonie-PCR-Mix </li></ol><table border="0"><tbody><tr><td> 20 uM M13 Vorwärts-Primer </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 20 uM M13 Reverse Primer </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> 5X Grüne Go Taq-Puffer </td><td> 7,0 ul </td></tr><tr><td> 10 mM dNTP </td><td> 0,7 ul </td></tr><tr><td> Taq DNA-Polymerase </td><td> 0,28 ul </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td> 25,62 ul </td></tr><tr><td></td><td> Insgesamt 35 ul </td></tr></tbody></table> In 35 ul Colony PCR Master Mix in ein PCR-Tube. Wählen Sie einen weißen Bakterienkolonie von der Platte mit einer Pipettenspitze und wirbeln sie in die PCR-Reaktion. <ol start="6"><li> Verstärken mit Denaturierung für 10 Minuten bei 94 ° C, gefolgt von 30 Zyklen von 45 Sekunden bei 94 ° C, 30 Sekunden bei 57 ° C und 1 Minute bei 72 ° C und eine endgültige Dehnung 10 Minuten bei 72 ° C 4 ul Elektrophorese auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Senden ~ 30 ul des PCR-Produkts für die Sequenzierung. Hinweis: Oozyten, 5 Kolonie-PCR-Produkte sequenziert. </li><li> Sobald Sequenzierung erhaltenen Ergebnisse sind, können Methylierungsmuster zu lesen. Jede Original-CG, die als CG blieb wurde methyliert, und jedes Original CG, die heute ein TG wurde nicht methyliert. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse In unserer Arbeit mit dem Aufdruck wir Assay-Methylierung in einzelnen Eizellen und Embryonen (Abbildung 1). Nach verschachtelten PCR-Amplifikation mit Primern konvertierter, ist es möglich, einen erfolgreichen Umwandlung durch Visualisierung einer korrekten Fragments die auf einem Agarosegel (2) zu bestätigen. Eine einzelne Eizellestellt einen elterlichen Allel, und in der Theorie, hat man aufgedruckten Methylierungsmuster. Als solches kann zweiten Runde PCR-Produkte für unbeabsichtigte Verunreinigungen geprüft werden. Ein Restriktionsenzym empfindlich auf DNA-Methylierung (wie HinfI oder DpnII) verwendet werden, um die zweite Runde PCR-Produkt verdauen zu beurteilen, ob ein methyliertes Allel oder unmethylierten (3) enthält. Ein methyliertes C innerhalb des Enzym-Erkennungssequenz gespalten wird, während ein unmethylierten C, die T umgewandelt wird nicht mehr durch das Enzym erkannt und ist nicht geschnitten. Jede Probe, die MII-Eizelle sowohl methylierter und nicht methylierter Allele sollte verworfen werden, da es indikativ für Cumulus Zellkontamination (Abbildung 3) ist. Nach Ligation und Transformation, kann eine erfolgreiche Kolonie PCR-Amplifikation werden auf einem Agarosegel visualisiert werden, um sicherzustellen, Proben mit dem richtigen Produkt zur Sequenzierung Größe gesendet werden (Abbildung 4). Schließlich wird die Sequenz von fünf einzelnen cldiejenigen aus einer MII Eizelle produzieren sollten fünf identische Methylierungsmuster und identisch nonCpG Conversion-Raten (Abbildung 5a). Alle Proben, die mehr als ein Muster enthalten, sollten verworfen werden (Abbildung 5b) werden. Seit ovulierten MII-Oozyten zwei Chromosom-Kopien oder eine angehängte Polkörper haben, gibt es eine Möglichkeit für den Erhalt von zwei ähnlichen Sequenz Muster (Abbildung 5c). Wir empfehlen Verwerfen von Daten aus Eizellen, die höchst unterschiedliche Methylierungsmuster haben seit Cumulus Zellkontamination kann nicht ausgeschlossen werden. <img alt="1" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig1.jpg" /> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Einzel-Oocyte Bisulfit-Mutagenese-Assay. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig2.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse aus 2. Runde Verstärkung für Snrpn aus einer singenle MII Oozyte auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Spuren 1-4 sind vier Single-MII-Oozyten und Spur 5 ist eine Negativ-Kontrolle (keine Eizelle). Erwartete Fragmentlänge für Snrpn beträgt 420 bp. L, Leiter. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig3.jpg" /> 3. Repräsentative Ergebnisse von 2 Runde methylierungsspezifische Restriktionsverdau für Snrpn aus einer Eizelle MII auf einem 8% igen Acrylamidgel. HinfI diagnostischen Restriktionsverdau zeigt unmethyliert DNA, die ein T, das die Restriktionsstelle schafft trägt (420bp, Spur 1) oder methylierte DNA, die eine C innerhalb Erkennungsstelle enthält (Schnitt, 262, 103 und 54 bp, Spur 2). Die Verdauung in denen sowohl methylierter und nicht methylierter Restriktionsenzymstellen (Cut &amp; Uncut Bands, Spur 3) sind bezeichnend für Cumulus-Zell-Kontamination. L, Leiter. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig4.jpg" /> Abbildung 4. </strong&gt; Repräsentative Ergebnisse für Kolonie-PCR-Amplifikation für Snrpn aus einer Eizelle MII auf einem 1,5% Agarosegel unterworfen. Voraussichtlich Fragmentlänge nach Ligation Snrpn in den pGEM-T Easy Vektor und unter Verwendung von M13 Vorwärts und Rückwärts-Primer ist 656 bp. Lane 1-8, 1-8 Amplikons aus Klonen. Clone 5 hat eine falsche Fragmentlänge und sollte nicht zum Sequenzieren geschickt werden. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4046/4046fig5.jpg" /> Abbildung 5. Vertreter Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII. Snrpn wird in Oozyten methyliert. Schwarze Kreise zeigen methylierte CpG. Weiße Kreise zeigen unmethylierte CpGs. CpG Anzahl und die Platzierung ist repräsentativ für eine B6-Stamm weiblichen Maus. a) Erwartete Ergebnisse für die Sequenzierung Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII. Nur ein einzelner DNA-Strang ist in allen fünf Klone zu amplifizieren. Oozyten mit einem einzigen Methylierungsmuster und identische nicht-CpG-Konvertierung Geplappern sollten Auswertung einbezogen werden (prozentuale Umwandlung von nicht-CpG angegeben auf der rechten Seite wurde die Anzahl der nicht-CpG Cytosine, die, wie in Prozent der gesamten nicht-CpG Cytosine Thymin berechnet). b) Die Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII mit Cumulus-Zell-Kontamination. Beachten Sie die Unähnlichkeit zwischen Methylierung Staaten und Muster, die Umwandlung Mehrfachsteckgliedern Verstärkung. c) Sequenzierung Ergebnisse für Snrpn aus einer einzigen Eizelle MII mit beiden Chromosomen-Kopien oder Polkörper Eingliederung.

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	<li>Jaenisch, R., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+gene+expression:+how+the+genome+integrates+intrinsic+and+environmental+signals.">Epigenetic regulation of gene expression: how the genome integrates intrinsic and environmental signals.</a> Nat. 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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Diese einzelne Eizelle Assay enthält viele Schritte mit einer Zahl, die kritisch sind und bedürfen einer besonderen Pflege. Die erste ist Oozyte Waschen. Es ist besonders wichtig zu waschen Jeder Oocyt mehrmals in frischem Medium fällt nach Hyaluronidase-Behandlung, so viele Kumuluszellen wie möglich zu entfernen. Darüber hinaus bei der Übertragung von Eizellen, um saure Tyrode-Lösung für Zona pellucida Entfernung sicherstellen umgebenden Medium ist klar, von Cumulus-Zellen. Die Eizelle ist sehr klebrig zona nac...

Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte. <table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td colspan="4"> Eizellenentnahme </td></tr><tr><td> Hyaluronidase </td><td> Sigma </td><td> H4272 </td><td></td></tr><tr><td> Saure Tyrode </td><td> Sigma </td><td> T1788 </td><td></td></tr><tr><td> Proteinase K </td><td> Sigma </td><td> P5568 </td><td></td></tr><tr><td> 10% IGEPAL </td><td> Bioshop </td><td> NON999.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Lysis Solution </td></tr><tr><td> Tris, pH 7,5 </td><td> Bioshop </td><td> TRS001.5 </td><td></td></tr><tr><td> LiCl </td><td> Sigma </td><td> L9650 </td><td> &amp; Nbsp; </td></tr><tr><td> EDTA, pH 8,0 </td><td> Sigma </td><td> E5134 </td><td></td></tr><tr><td> LiDS </td><td> Bioshop </td><td> LDS701.10 </td><td></td></tr><tr><td> DTT </td><td> Invitrogen </td><td> P2325 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> SDS-Lysepuffer </td></tr><tr><td> TE pH 7,5 </td><td> Bioshop (Tris) Sigma (EDTA) </td><td> TRS001.5 E5134 </td><td></td></tr><tr><td> 10% SDS </td><td> Bioshop </td><td> SDS001.500 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Bisulfit-Konvertierung </td></tr><tr><td> Natriumhydroxid </td><td> Sigma </td><td> S8045 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumhydrogensulfit (Natriumbisulfit) </td><td> Sigma </td><td> 243973 </td><td>; </td></tr><tr><td> Hydrochinon </td><td> Sigma </td><td> H9003 </td><td></td></tr><tr><td> Niedrigen Schmelzpunkt (LMP) Agarose </td><td> Sigma </td><td> A9414 </td><td></td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Sigma </td><td> M8410 </td><td></td></tr><tr><td> M2 Medium </td><td> Sigma </td><td> M7167 </td><td></td></tr><tr><td> GIBCO destilliertes Wasser </td><td> Invitrogen </td><td> 15230-196 </td><td></td></tr><tr><td> Autoklavierten doppelt destilliertes (dd) Wasser </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> PCR </td></tr><tr><td> Illustra Hot Start Mix RTG </td><td> GE Healthcare </td><td> 28-9006-54 </td><td></td></tr><tr><td> 240 ng / ml Hefe-tRNA </td><td> Invitrogen </td><td> 15401-011 </td><td></td></tr><tr><td> 5x Grün GoTaq Reaktionspuffer </td><td> ProfiMega- </td><td> M7911 </td><td></td></tr><tr><td> Innere und äußere verschachtelten Primern </td><td> Sigma </td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ligation </td></tr><tr><td> Promega pGEM-T Easy Vektor </td><td> Fisher Scientific </td><td> A1360 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> TA Cloning </td></tr><tr><td> Kompetente E. coli Zellen </td><td> Zymo Research Corp </td><td> T3009 </td><td></td></tr><tr><td colspan="4"> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Lupen-Mikroskop </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 70 ° C und 90 ° C Hitze-Blöcke </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 37 ° C und 50 ° C Wasserbäder (42 ° C für Transformationen) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocker </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PCR-Maschine </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

single oocyte bisulfite mutagenesis

Epigenetik umfasst alle vererbbar und reversible Modifikationen an Chromatin, die alter-Gen Zugänglichkeit und damit die primären Mechanismen für die Regulierung der Gentranskription 1 sind. DNA-Methylierung ist eine epigenetische Modifikation, die überwiegend fungiert als repressiv-Marke. Durch die kovalente Addition einer Methylgruppe an Cytosin in CpG-Dinukleotide, kann es zu rekrutieren weitere Proteine ​​und repressiven Histon-Modifikationen, um Prozesse in kondensierenden Chromatin und Abschaltung von Genen 2 beteiligt zu initiieren. DNA-Methylierung ist wichtig für die normale Entwicklung, da sie eine entscheidende Rolle in der Entwicklungsbiologie Programmierung, Zelldifferenzierung, Unterdrückung von retroviralen Elementen, X-Chromosom-Inaktivierung und genomische Prägung spielt. Eine der mächtigsten Methoden zur DNA-Methylierungs-Analyse ist Bisulfit-Mutagenese. Natriumbisulfit ist ein DNA-Mutagen, die Cytosine desaminiert in Uracile. Nach PCR-Amplifikation und seque<html> ncing werden diese Umwandlung Ereignisse wie Thymine erkannt. Methylierte Cytosine werden aus Desaminierung geschützt und damit als Cytosine bleiben, welche die Identifizierung von DNA-Methylierung bei der einzelne Nukleotid-Ebene 3. Die Entwicklung des Bisulfit-Mutagenese-Assay wurde von den ursprünglich gemeldeten 4-6 gegen diejenigen, die mehr sensitive und reproduzierbare 7 sind fortgeschritten. Ein wichtiger Fortschritt wurde Einbetten kleiner DNA-Mengen in einem Agarose-Kügelchen, wodurch Schutz der DNA vor der rauen Bisulfit-Behandlung 8. Damit konnte die Methylierungsanalyse auf Pools von Eizellen und Embryonen im Blastozysten-9 durchgeführt werden. Die anspruchsvollste Bisulfit-Mutagenese-Protokoll auf dem neuesten Stand ist für einzelne Blastozyste-Embryonen 10. Da jedoch Blastozysten im Durchschnitt 64 Zellen (mit einem Gehalt von 120 bis 720 pg genomischer DNA) haben, ist diese Methode nicht wirksam für die Methylierung Studien zu einzelnen Eizellen oder Embryonen-Spaltung. Zelt &quot;&gt; Aufnehmen von Hinweisen aus Agarose Einbettung von Minuten DNA-Mengen einschließlich Oozyten 11, hier präsentieren wir eine Methode, bei der Eizellen direkt in einem Agarose-Lyse-Lösung und Wulst unmittelbar nach der Abruf und die Entfernung der Zona pellucida von der Eizelle eingebettet sind. Dies ermöglicht uns, Bypass die beiden wichtigsten Herausforderungen der einzigen Eizelle Bisulfit-Mutagenese:. Schutz einer winzigen Menge von DNA vor dem Abbau und anschließende Verlust während der zahlreichen Schritte Protokoll Wichtig ist, wie Daten aus einzelnen Eizellen gewonnen werden, die Frage der PCR-Bias-Pools innerhalb Außerdem entfällt. , unbeabsichtigte Kontamination Cumulus-Zellen nachweisbar ist, durch diese Methode, da jede Probe mit mehr als einem Methylierungsmuster von der Analyse ausgeschlossen werden kann 12. Dieses Protokoll bietet ein verbessertes Verfahren für eine erfolgreiche und reproduzierbare Analyse der DNA-Methylierung in der Ebene einzelner Zellen und ist ideal geeignet, für die einzelnen Eizellen sowie Embryonen-Spaltung.

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Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K Aufrufe.  Schulich School of Medicine and Dentistry, University of Western Ontario. Bisulfit-Mutagenese ist der Goldstandard für die Analyse von DNA-Methylierung. Unsere modifizierte Protokoll ermöglicht DNA-Methylierungs-Analyse auf der Ebene einzelner Zellen und wurde speziell für die einzelnen Eizellen entwickelt. Es kann auch für die Spaltung-Embryonen verwendet werden.

Serie: Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Forschung

Biologie

An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane sulfonate (EMS) and 4, 5', 8-trimethylpsoralen combined with ultraviolet light (TMP/UV). Nematodes are powerful biological systems for genetics studies because of their simple body plan and mating system, which is composed of self-fertilizing hermaphrodites and males that can generate hundreds of progeny per animal. Nematodes are maintained in agar plates containing a lawn of bacteria and can be easily transferred from one plate to another using a pick. EMS is an alkylating agent commonly used to induce point mutations and small deletions, while TMP/UV mainly induces deletions. Depending on the species of nematode being used, concentrations of EMS and TMP will have to be optimized. To isolate recessive mutations of the nematode Pristionchus pacificus, animals of the F2 generation were visually screened for phenotypes. To illustrate these methods, we mutagenized worms and looked for Uncoordinated (Unc), Dumpy (Dpy) and Transformer (Tra) mutants.

Screening for mutants with phenotypic defects is a straightforward method for identifying genes that function in a given biological process. In this article we describe how to culture free living worms (e.g., Pristionchus pacificus) in the laboratory and show two different mutagenesis methods, EMS and TMP/UV.

An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagenese und Functional Selection Protocols for Directed Evolution von Proteinen in E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion channels in oocytes. Recordings from the cut-open setup are particularly useful for resolving low magnitude gating currents, rapid ionic current activation, and deactivation. The main benefits over the two-electrode voltage clamp (TEVC) technique include increased clamp speed, improved signal-to-noise ratio, and the ability to modulate the intracellular and extracellular milieu.
Here, we employ the human cardiac sodium channel (hNaV1.5), expressed in Xenopus oocytes, to demonstrate the cut-open setup and protocol as well as modifications that are required to add voltage clamp fluorometry capability.
The properties of fast activating ion channels, such as hNaV1.5, cannot be fully resolved near room temperature using TEVC, in which the entirety of the oocyte membrane is clamped, making voltage control difficult. However, in the cut-open technique, isolation of only a small portion of the cell membrane allows for the rapid clamping required to accurately record fast kinetics while preventing channel run-down associated with patch clamp techniques.
In conjunction with the COVG technique, ion channel kinetics and electrophysiological properties can be further assayed by using voltage clamp fluorometry, where protein motion is tracked via cysteine conjugation of extracellularly applied fluorophores, insertion of genetically encoded fluorescent proteins, or the incorporation of unnatural amino acids into the region of interest1. This additional data yields kinetic information about voltage-dependent conformational rearrangements of the protein via changes in the microenvironment surrounding the fluorescent molecule.

The Xenopus Oocyte Cut-open Vaseline Gap Voltage-clamp Technique With Fluorometry

The cut-open Vaseline gap approach is used to obtain low noise recordings of ionic and gating currents from voltage-dependent ion channels expressed in Xenopus oocytes with high resolution of fast channel kinetics. With minor modification, voltage clamp fluorometry can be coupled to the cut-open oocyte protocol.

Die<em&gt; Xenopus</em&gt; Eizelle Cut-open Vaseline Gap Voltage-Clamp-Technik Mit Fluorometrie

The cut-open oocyte Vaseline gap (COVG) voltage clamp technique allows for analysis of electrophysiological and kinetic properties of heterologous ion ...

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can be generated using a transposome. The commercially available, Tn5-derived transposome used in this protocol consists of a linear segment of DNA containing an R6K&#947; replication origin, a gene for kanamycin resistance and two mosaic sequence ends, which serve as transposase binding sites. The transposome, provided as a DNA/transposase protein complex, is introduced by electroporation into the prototrophic strain, Enterobacter sp. YSU, and randomly incorporates itself into this host&#8217;s genome. Transformants are replica plated onto Luria-Bertani agar plates containing kanamycin, (LB-kan) and onto M-9 medium agar plates containing kanamycin (M-9-kan). The transformants that grow on LB-kan plates but not on M-9-kan plates are considered to be auxotrophs. Purified genomic DNA from an auxotroph is partially digested, ligated and transformed into a pir+ Escherichia coli (E. coli) strain. The R6K&#947; replication origin allows the plasmid to replicate in pir+ E. coli strains, and the kanamycin resistance marker allows for plasmid selection. Each transformant possesses a new plasmid containing the transposon flanked by the interrupted chromosomal region. Sanger sequencing and the Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) suggest a putative identity of the interrupted gene. There are three advantages to using this transposome mutagenesis strategy. First, it does not rely on the expression of a transposase gene by the host. Second, the transposome is introduced into the target host by electroporation, rather than by conjugation or by transduction and therefore is more efficient. Third, the R6K&#947; replication origin makes it easy to identify the mutated gene which is partially recovered in a recombinant plasmid. This technique can be used to investigate the genes involved in other characteristics of Enterobacter sp. YSU or of a wider variety of bacterial strains.

Generation of Enterobacter sp. YSU Auxotrophs Using Transposon Mutagenesis

Enterobacter sp. YSU grows in glucose minimal salts medium. Auxotrophs are generated by transforming it with a transposome which randomly inserts itself into the host genome. Mutants are found by replica plating from complex medium to minimal medium. Interrupted genes are identified by gene rescue and sequencing.

Erzeugung<em&gt; Enterobacter</em&gt; Sp. Ysu Auxotrophe Mit Transposon-Mutagenese

Prototrophic bacteria grow on M-9 minimal salts medium supplemented with glucose (M-9 medium), which is used as a carbon and energy source. Auxotrophs can ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

Proteolytically Degraded Alginate Hydrogels and Hydrophobic Microbioreactors for Porcine Oocyte Encapsulation

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of assisted reproduction techniques such as oocyte in vitro maturation (IVM), in vitro fertilization (IVF) and cloning of domestic animals by nuclear transfer from somatic cell. IVM is the method particularly of significance. It is the platform technology for the supply of mature, good quality oocytes for applications such as reduction of the generation interval in commercially important or endangered species, research concerning in vitro human reproduction, and production of transgenic animals for cell therapies. The term oocyte quality includes its competence to complete maturation, be fertilized, thereby resulting in healthy offspring. This means that oocytes of good quality are paramount for successful fertilization including IVF procedures. This poses many difficulties to develop a reliable culture method that would support growth not only of human oocytes but also of other large mammalian species. The first step in IVM is the in vitro culture of oocytes. This work describes two protocols for the 3D culture of porcine oocytes. In the first, 3D model cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in a fibrin-alginate bead interpenetrating network, in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. In the second one, COCs are suspended in a drop of medium and encapsulated with fluorinated ethylene propylene (FEP; a copolymer of hexafluoropropylene and tetrafluoroethylene) powder particles to form microbioreactors defined as Liquid Marbles (LM). Both 3D systems maintain the gaseous in vitro culture environment. They also maintain COCs 3D organization by preventing their flattening and consequent disruption of gap junctions, thereby preserving the functional relationship between the oocyte, and surrounding follicular cells.

Presented here are two protocols for the encapsulation of porcine oocytes in 3D culture conditions. In the first, cumulus-oocyte complexes (COCs) are encapsulated in fibrin-alginate beads. In the second, they are enclosed with fluorinated ethylene propylene powder particles (microbioreactors). Both systems ensure optimal conditions to maintain their 3D organization.

Proteolytisch abgebaute Alginat-Hydrogele und hydrophobe Mikrobioreaktoren zur Poren-Oozyten-Verkapselung

In reproductive biology, the biotechnology revolution that began with artificial insemination and embryo transfer technology led to the development of ...

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops worldwide. Since adult fruit flies have great flight capacity and females lay their eggs under the skins of fruit, insecticides requiring direct contact with the pest usually perform poorly in the field. With the development of molecular biological tools and high-throughput sequencing technology, many scientists are attempting to develop environmentally friendly pest management strategies. These include RNAi or gene editing-based pesticides that downregulate or silence genes (molecular targets), such as olfactory genes involved in searching behavior, in various insect pests. To adapt these strategies for Oriental fruit fly control, effective methods for functional gene research are needed. Genes with critical functions in the survival and reproduction of B. dorsalis serve as good molecular targets for gene knockdown and/or silencing. The CRISPR/Cas9 system is a reliable technique used for gene editing, especially in insects. This paper presents a systematic method for CRISPR/Cas9 mutagenesis of B. dorsalis, including the design and synthesis of guide RNAs, collecting embryos, embryo injection, insect rearing, and mutant screening. These protocols will serve as a useful guide for generating mutant flies for researchers interested in functional gene studies in B. dorsalis.

Protocols for CRISPR/Cas9 Mutagenesis of the Oriental Fruit Fly Bactrocera dorsalis

This paper presents the step-by-step protocols for CRISPR/Cas9 mutagenesis of the Oriental fruit fly Bactrocera dorsalis. Detailed steps provided by this standardized protocol will serve as a useful guide for generating mutant flies for functional gene studies in B. dorsalis.

Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

The Oriental fruit fly, Bactrocera dorsalis, is a highly invasive and adaptive pest species that causes damage to citrus and over 150 other fruit crops ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, which is known as cellular heterogeneity. In recent years, single-cell and cell-type isolation combined with next-generation sequencing (NGS) techniques have become important tools for studying biological processes at single-cell resolution. However, isolating plant cells is relatively more difficult due to the presence of plant cell walls, which limits the application of single-cell approaches in plants. This protocol describes a robust procedure for fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based single-cell and cell-type isolation with plant cells, which is suitable for downstream multi-omics analysis and other studies. Using Arabidopsis root fluorescent marker lines, we demonstrate how particular cell types, such as xylem-pole pericycle cells, lateral root initial cells, lateral root cap cells, cortex cells, and endodermal cells, are isolated. Furthermore, an effective downstream transcriptome analysis method using Smart-seq2 is also provided. The cell isolation method and transcriptome analysis techniques can be adapted to other cell types and plant species and have broad application potential in plant science.

The feasibility and effectiveness of high-throughput scRNA-seq methods herald a single-cell era in plant research. Presented here is a robust and complete procedure for isolating specific Arabidopsis thaliana root cell types and subsequent transcriptome library construction and analysis.

Isolierung und Transkriptomanalyse pflanzlicher Zelltypen

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...