Diese Arbeit wurde von NSF gewähren IOB # 0615996 gefördert.

Teil 1: Vorbereiten Nematoden Nährmedien (NGM) Petrischalen Experimentelle Nematoden wie C. elegans und P. pacificus sind in der Regel im Labor auf 6 cm Petrischalen mit Nematode Growth Medium (NGM) 1 kultiviert. Würmer sind bei 20 ° C gehalten, können aber bei unterschiedlichen Temperaturen (zwischen 4 ° C - 25 ° C) bebrütet werden, abhängig von der Nematoden und experimentelles Design. Zur Vorbereitung Platten mit NGM haben Standard sterile Techniken verwendet werden, um Pilz-und Bakterienbefall zu verhindern. Es folgt das Protokoll zur NGM Platten vorbereiten: <ol><li> Wiegen Sie 15 g Agar, 2,4 g NaCl, 2 g Trypton, und 2,72 g KH 2 PO 4 in 2 L-Erlenmeyerkolben, machen Volumen bis zu 1 L mit Wasser, Autoklaven und lassen Sie es bis 60 ° C abkühlen in ein Wasserbad. </li><li> Fügen Sie 0,8 ml je 1 M CaCl 2, Cholesterin (5 mg / ml in Ethanol) und 1 M MgSO 4. Um zu verhindern, Pilz-und Bakterienbefall, 1 ml Streptomycin (100 mg / ml) und 1 ml Nystatin (10 mg / ml) kann auf jeden Liter zugesetzt werden. </li><li> Mit einem Unispense Maschine und Pflege sterilen Bedingungen, gießen Sie die Medien in die gewünschte Platten. Die Platten sollten auf ca. 2 / 3 rd gefüllt sein. Ein Standard-Durchmesser von 60 mm Platte benötigt etwa 10 ml des Mediums. Bewegen Sie sich nicht die Platten, bis der Agar vollständig gelified ist, andernfalls wird es eine unebene Oberfläche von Agar werden, was es schwierig macht Würmer auf dem Stereomikroskop konzentrieren. </li><li> Einmal getrocknet, können die Platten sofort ausgesät werden oder bei 4 ° C gelagert, bis Impfen mit Bakterien. </li></ol> Teil 2: Vorbereiten OP50 Bakterien und Aussaat NGM Petrischalen P. pacificus wird im Labor durch die Fütterung auf der E.coli-Stamm OP50 kultiviert. OP50 verfügt über eine begrenzte Wachstum auf NGM-Platten, wodurch eine dünne Rasen, der die Visualisierung der Würmer 1 erleichtert. Um zu wachsen eine Kultur des OP50 verwenden LB-Brühe: <ol><li> Add 5 g bactotryptone, 2,5 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl in einem 500 ml Schraubverschluss Flasche, dass das Volumen auf 500 ml mit destilliertem Wasser und Autoklaven. </li><li> Inoculate die Brühe mit einer einzigen Kolonie von OP50 von der Kultur Platte unter sterilen Bedingungen und ließ es über Nacht wachsen bei 37 ° C. </li><li> LB-OP50 ist bereit, verwendet werden können und bei 4 ° C für mehrere Monate gelagert werden, wenn die Sterilität eingehalten wird. Wenn Platten ausgesät werden müssen, eine kleine Menge der Brühe in eine kleine sterile Becher und dies wird dazu beitragen, eine Verunreinigung der Stammkultur. </li><li> Um Samen Platten, verzichten 100-120 ul des OP50 auf das 60 mm Durchmesser NGM Petrischale und wirbeln um sie zu verbreiten. </li><li> Inkubieren diese ausgesät Platten über Nacht bei Raumtemperatur für den Rasen zu wachsen. Diese ausgesät Platten können nun bei 4 ° C gelagert werden für bis zu 3 Wochen. Wenn Sie sie in umgekehrter Stellung verhindert eine schnelle Trocknung. </li></ol> Teil 3: Making a holen In diesem Abschnitt werden wir beschreiben, wie ein Pick für Würmer machen. Die Abholung wird verwendet, um Würmer von einem Ort zum anderen zu übertragen. Die Abholung ist von 30 Gauge 90% Platin 10% Iridium-Draht gemacht, obwohl einige Forscher etwas andere Metal-Kompositionen bevorzugen: <ol><li> Cut ca. 3-4 cm aus Draht, Ort, 0,5 cm davon in der Spitze einer Pasteurpipette (dessen Spitze war es, eine geringere Länge gebrochen), und dann verschließen Sie diese in das Glas über einem Bunsenbrenner. Die Länge des Drahtes ragt aus dem Glas ist ca. 3-3,5 cm, kann aber je nach individuellen Vorlieben variieren. </li><li> Glätten Sie das Ende des Drahtes, die vorstehende mit einem Hammer oder Zange. Dann biegen Sie die Abflachung nach oben, um eine Kugel zu bilden. </li><li> Glätten der scharfen Kanten der Pick mit einem Schleifpapier um eine Beschädigung des Wurms oder Agar. </li></ol> Teil 4: Picking Würmer <ol><li> Um Würmer holen, sterilisieren Platindraht auf einer Flamme und ziehen Sie die abgeflachte Spitze des Pick entlang der Bakterienrasen zur Beschichtung der Spitze mit dicken klebrigen Bakterien, dabei nicht zu durchstechen oder Beschädigung der Agar-Oberfläche. </li><li> Mit dem Stereomikroskop, sehr leicht Pinsel der klebrigen Spitze gegen den Wurm / Würmer abgeholt, bis der Wurm-Sticks an die Bakterien auf der Pick werden. </li><li> Sobald der Wurm an der Spitze des Pick, übertragen sie sofort auf die neue Platte durch Berühren oder Gleiten der Spitze des Pick gegen den Bakterienrasen der neuen Platte, und der Wurm sollte kriechen. Es ist darauf zu achten, dass die Oberfläche des Agar auf der Platte beschädigt werden, da sonst die Würmer in die Löcher so dass es schwierig ist, sie abzurufen, zu kriechen. Wenn der Wurm bleibt auf dem Pick zu lange, kann es austrocknen. </li></ol> Teil 5: EMS Mutagenese Ethylmethansulfonat (EMS) induziert ein breites Spektrum von Mutationen in dem in das Genom 2. Mutanten können durch Defekte wie Eiablage, Muskel-Defekt identifiziert werdens, Geschlechtsbestimmung, dauer Bildung, Verhalten und Gonade Bildung. Das Protokoll für EMS-Mutagenese ist ähnlich wie bei C beschrieben elegans 1. <ol><li> Bereiten Sie 500 ml (oder mehr) 1 N NaOH. </li><li> Nehmen Sie 4-5, 6 cm Durchmesser Petrischalen voller Würmer, mit ein paar hundert Würmer auf dem dritten Larvenstadium juvenile (J3) Bühne und waschen Sie die Würmer weg mit 2-3 ml sterilem M9 pro Platte. </li><li> Sammeln Sie alle Würmer in einer sterilen Einweg-15 ml-Zentrifugenröhrchen. Zentrifuge bei 1500 xg für 5-7 Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden. </li><li> Saugen Sie die Flüssigkeit und die Verwendung von 2 ml M9 zu resuspendieren die Würmer. Fügen Sie 20 ul EMS in ein Röhrchen mit 2 ml M9 und schütteln, um es aufzulösen. Dann stell &#39;das EMS-Lösung, die 2 ml-Wurm Federung und vorsichtig schwenken. Die Endkonzentration der EMS wird 47 mm sein. Achtung: EMS ist ein sehr starkes Mutagen und sollte in einem Abzug gehandhabt werden. Alle Materialien (Handschuhe, Pipetten, Spitzen), die in Kontakt mit diesem mutagen zu kommen, sollte mit 1N NaOH zur Inaktivierung des EMS behandelt werden. Tragen Sie doppelte Handschuhe während des gesamten EMS-Mutagenese Prozedur. Entsorgen Sie den gefährlichen Abfällen gemäß Ihrer Institution Richtlinien. </li><li> Legen Sie die Zentrifugenröhrchen und decken Sie die Kappe mit Parafilm, legen Sie es waagerecht in den Dunstabzug und lassen die Würmer für 3,5 Stunden inkubiert. Der Schlauch kann auch bei niedriger Geschwindigkeit Wippe platziert werden. </li><li> Drehen Sie den Schlauch und Mantel der Kappe mit Parafilm, in vertikaler Position und inkubieren, bis die Würmer zu versenken. </li><li> Den Überstand aspirieren und verwerfen sie in ein Becherglas / Kolben mit 1N NaOH. Dies wird Inaktivierung der EMS. </li><li> 5 ml M9, die Würmer, das Röhrchen 25-30 mal die Würmer, Zentrifuge bei 1500 xg waschen für 5-7 Minuten oder bis die Würmer ein Pellet bilden. Den Überstand aspirieren und verwerfen in die 1N NaOH Becher. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang mindestens 3-mal. </li><li> Nach dem letzten Waschen, resuspendieren der Wurm Pellet in minimaler Menge (~ 500 ul) M9 und Pipette sie hinaus auf NGM-Platten mit einem Rasen von OP50 Bakterien. An dieser Stelle müssen Sie nicht mehr in der chemischen Haube arbeiten. </li><li> Lassen Sie die Flüssigkeit trocknen für ein paar Minuten und dann abholen und Transfer gesund aussehende J4 Larven an die frische ausgesät Platten. Entsorgen Sie die Original-Platte nach Ihrer Institution gefährlicher Abfall-Richtlinien. </li><li> Lassen Sie die mutagenisierten Würmer selbst zu befruchten. Mit einem Stereomikroskop, Bildschirm der F2-Generation Phänotypen für rezessive Mutanten von Interesse. </li></ol> Teil 6: Psoralen Mutagenese In diesem Abschnitt beschreiben wir das Verfahren für die Mutagenese mit TMP in Verbindung mit langwelligem ultravioletten (UV). TMP / UV-Methode der Mutagenese wird häufig verwendet, um Deletionsmutationen innerhalb eines Genoms 3 induzieren. <ol><li> Sammeln von Würmern 4-5, 6 cm Durchmesser Petrischalen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen, wie im vorherigen Verfahren beschrieben. </li><li> 10 ml M9, 20 Mal kippen, um die Würmer und Zentrifuge bei 1500 xg waschen für 5 Minuten. Überstand verwerfen und wiederholen Sie die Wäsche für insgesamt 3-mal. Absaugen der Flüssigkeit und resuspendieren die Würmer in ca. 10-fache ihres Volumens der M9 mit 30 ug / ml TMP. Je 20 ul von TMP (3 mg / ml) in 2 ml M9. Wie EMS, ist TMP ein starkes Karzinogen und muss behandelt unter richtigen Sicherheitsmaßnahmen werden. Um zu verhindern, vor möglichen Risiken des UV-Lichts richtige Auge trägt verwendet werden sollte. Das Verbrauchsmaterial muss in der richtigen biohazard Säcke entsorgt werden. </li><li> Inkubieren Sie die Röhrchen im Dunkeln für 15 Minuten bei Raumtemperatur auf einem niedrigen Drehzahlen Wippe (40 UPM). Setzen Sie den überdachten vertikal für 10 Minuten bis alle Würmer sinken lassen. </li><li> Entfernen Sie die Würmer aus dem Boden des Röhrchens mit einer Pasteurpipette und übertragen Sie sie auf eine ungesetzte NGM Platte. Verwerfen Sie den Überstand nach Ihrer Institution gefährlichen chemischen Richtlinien. </li><li> Halten Sie die Platte in dunklen, bis das überschüssige TMP in die Platte absorbiert wird. </li><li> Mit Hilfe eines UV-Intensität Meter, stellen Sie den Abstand zwischen den langwelligen UV-Quelle und die Platte so, dass die Intensität auf der Platte 500 mW / cm 2 4 ist. Entfernen Sie die Aluminium-Deckel und Deckel und Abdeckung und setzen die Platte mit den TMP behandelt Würmer, die langwellige UV-Strahlung für 50 Sekunden. </li><li> Zugedeckt die Würmer in der Dunkelheit für 5 Stunden bei Raumtemperatur. </li><li> Pick and Transfer gesund aussehende J4 Larven an die frische ausgesät Platten. Entsorgen Sie die Original-Platte nach Ihrer Institution gefährlichen chemischen Richtlinien. </li><li> Mit einem Stereomikroskop, Bildschirm der F2-Generation Phänotypen für die Mutation von Interesse. </li></ol> Teil 7: Repräsentative Ergebnisse Einige der P. pacificus mutanten Phänotypen, die aus der Mutagenese (entweder durch EMS oder TMP / UV) sind in Abbildung 1 dargestellt. Jede Mutante besitzt einen charakteristischen Phänotyp, die leicht zu unterscheiden von der Wildtyp-Tier ist. Von den Würmerndass waren mit dem Mutagen, 30 J3/J4 Larven aus der elterlichen Generation (P0) wurden in getrennten Platten gelegt und dürfen Eier, die der F1-Generation sind Laien behandelt. Von den Platten, die gesunde F1-Nachkommen zeigten, wurden insgesamt 1000 F1 auf die einzelnen Platten übertragen und die F2-Nachkommen wurde Phänotypen gescreent. Tiere mit Dumpy 5,6, unkoordinierte 6 und Transformator 7 Phänotypen gefunden. <img src="/files/ftp_upload/2293/2293fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Pristionchus pacificus Wildtyp und Mutante Tiere. A. wt Hermaphrodit B. wt männlichen C dpy mutierten D. unc mutierten E. tra-Mutante. Top zwei Tafeln zeigen Wildtyp Hermaphrodit (links) und Männchen (rechts) Tiere mit den verschiedenen Mutanten in den restlichen Platten zu vergleichen.

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	<li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetics. 77 (1), 71-71 (1974).</li><li>Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Methods Cell Biol. 48, 31-31 (1995).</li><li>Yandell, M. D., Edgar, L. G., Wood, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (4), 1381-1381 (1994).</li><li>Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , 1-1 (2005).</li><li>Kenning, C., Kipping, I., Sommer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Genesis. 40 (3), 176-176 (2004).</li><li>Sommer, R. J., Carta, L. K., Kim, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fundamental and Applied Nematology. 19 (6), 511-511 (1996).</li><li>Pires-daSilva, A., Sommer, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genes &#38; development. 18 (10), 1198-1198 (2004).</li><li>Wei, A., Yuan, A., Fawcett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic acids research. 30 (20), 110-110 (2002).</li><li>Jorgensen, E. M., Mango, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nat Rev Genet. 3 (5), 356-356 (2002).</li></ol>

Mutagenese ist eine weithin angewandte Technik für genetische Studien in verschiedenen experimentellen Modell-Organismen. Mutagenese-Experimente werden häufig verwendet, um die Funktion eines Gens 2 zu identifizieren. Die Mutagenese hier beschriebenen Verfahren können nicht nur für P. verwendet werden pacificus, sondern auch für C. elegans und anderen verwandten Nematoden. Hier beschreiben wir zwei Methoden, EMS und TMP / UV-Mutagenese. EMS ist eine...

an introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis

Dieses Protokoll beschreibt Verfahren, die Nematoden im Labor und wie man sie mutagenisieren mit zwei alternative Methoden zu halten: Ethylmethansulfonat (EMS) und 4, 5 &#39;, 8-Trimethylpsoralen mit ultraviolettem Licht (TMP / UV) kombiniert. Nematoden sind leistungsfähige biologische Systeme für genetische Studien wegen ihrer einfachen Körperbau und der Paarung, das aus sich selbst befruchtende Zwitter und Männchen, die hunderte von Nachkommen pro Tier erzeugen kann zusammengesetzt ist. Nematoden sind in Agarplatten mit einem Rasen von Bakterien erhalten und kann leicht von einer Platte zur anderen mit einem Pick übertragen werden. EMS ist ein Alkylierungsmittel häufig verwendet, um Punktmutationen und kleine Deletionen induzieren, während TMP / UV hauptsächlich induziert Löschungen. Je nach Art der Nematoden eingesetzt werden Konzentrationen von EMS und TMP müssen optimiert werden. Zur Isolierung rezessive Mutationen des Nematoden Pristionchus pacificus wurden die Tiere der F2-Generation visuell auf Phänotypen gescreent. Zur Veranschaulichung dieser Methoden, mutagenisierten wir Würmer und suchte Unkoordinierte (UNC), Dumpy (dpy) und Trafo (Tra) Mutanten.

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An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Das Screening nach Mutanten mit phänotypischen Defekte ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Genen, die in einem bestimmten biologischen Prozess funktionieren. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Kultur frei lebenden Würmer (z. B.<em&gt; Pristionchus pacificus</em&gt;) Im Labor und zeigen zwei verschiedene Mutagenese-Verfahren, EMS und TMP / UV.

An Introduction to Worm Lab: von Kultivierung Worms zu Mutagenese

This protocol describes procedures to maintain nematodes in the laboratory and how to mutagenize them using two alternative methods: ethyl methane ...

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Research

JoVE Journal

Biology

34.3K Aufrufe.  University of Texas at Arlington. Das Screening nach Mutanten mit phänotypischen Defekte ist eine einfache Methode zur Identifizierung von Genen, die in einem bestimmten biologischen Prozess funktionieren. In diesem Artikel beschreiben wir, wie die Kultur frei lebenden Würmer (z. B. Pristionchus pacificus) Im Labor und zeigen zwei verschiedene Mutagenese-Verfahren, EMS und TMP / UV.

Serie: An Introduction to Worm Lab: from Culturing Worms to Mutagenesis

Homemade Site Directed Mutagenesis of Whole Plasmids

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned target gene can be altered by substitution, deletion or insertion of a few bases directly into a plasmid. It works by simply amplifying the whole plasmid, in a non PCR-based thermocycling reaction. During the reaction mutagenic primers, carrying the desired mutation, are integrated into the newly synthesized plasmid. In this video tutorial we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid. The protocol works with standard reagents and is independent from commercial kits, which often are very expensive. Applying this protocol can reduce the total cost of a reaction to an eighth of what it costs using some of the commercial kits. In this video we also comment on critical steps during the process and give detailed instructions on how to design the mutagenic primers.

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. Here we demonstrate an easy and cost effective way to introduce base substitutions into a plasmid using standard reagents.

Hausgemachte Mutagenese von Whole Plasmide

Site directed mutagenesis of whole plasmids is a simple way to create slightly different variations of an original plasmid. With this method the cloned ...

Forschung

Biologie

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

Introduction to Solid Supported Membrane Based Electrophysiology

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated sensor chip and a phosphatidylcholine monolayer on top. This assembly is mounted into a cuvette system containing the reference electrode, a chlorinated silver wire.
After adsorption of membrane fragments or proteoliposomes containing the membrane protein of interest, a fast solution exchange is used to induce the transport activity of the membrane protein. In the single solution exchange protocol two solutions, one non-activating and one activating solution, are needed. The flow is controlled by pressurized air and a valve and tubing system within a faraday cage.
The kinetics of the electrogenic transport activity is obtained via capacitive coupling between the SSM and the proteoliposomes or membrane fragments. The method, therefore, yields only transient currents. The peak current represents the stationary transport activity. The time dependent transporter currents can be reconstructed by circuit analysis.
This method is especially suited for prokaryotic transporters or eukaryotic transporters from intracellular membranes, which cannot be investigated by patch clamp or voltage clamp methods.

Here we present an electrophysiological method based on solid supported membranes with focus on its applications for the characterization of electrogenic membrane transporters.

Einführung in die Festkörperphysik Unterstützte Membrane Basierend Elektrophysiologie

The electrophysiological method we present is based on a solid supported membrane (SSM) composed of an octadecanethiol layer chemisorbed on a gold coated ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to assemble. Therefore, to identify these functional protein complexes, it is important to stabilize them in vivo before cell lysis and subsequent purification. Here we describe a method used to isolate large bona fide protein complexes from Drosophila embryos. This method is based on embryo permeabilization and stabilization of the complexes inside the embryos by in vivo crosslinking using a low concentration of formaldehyde, which can easily cross the cell membrane. Subsequently, the protein complex of interest is immunopurified followed by gel purification and analyzed by mass spectrometry. We illustrate this method using purification of a Tudor protein complex, which is essential for germline development. Tudor is a large protein, which contains multiple Tudor domains - small modules that interact with methylated arginines or lysines of target proteins. This method can be adapted for isolation of native protein complexes from different organisms and tissues.

An in vivo Crosslinking Approach to Isolate Protein Complexes From Drosophila Embryos

Multi-component protein complexes play crucial roles during cellular function and development. Here we describe a method used to isolate native protein complexes from Drosophila embryos after in vivo crosslinking followed by purification of the crosslinked complexes for subsequent structure-function analysis.

Ein In vivo Vernetzung Ansatz zur Proteinkomplexe Von Isolieren Drosophila Embryonen

Many cellular processes are controlled by multisubunit protein complexes. Frequently these complexes form transiently and require native environment to ...

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media (mCeHR). Additionally, the steps for exposing and acclimatizing C. elegans grown on E. coli to axenic liquid media are described. Finally, downstream experiments that utilize axenic C. elegans illustrate the benefits of this procedure. The ability to analyze and determine C. elegans&#160;nutrient requirement was illustrated by growing N2 wild type worms in axenic liquid media with varying heme concentrations. This procedure can be replicated with other nutrients to determine the optimal concentration for worm growth and development or, to determine the toxicological effects of drug treatments. The effects of varied heme concentrations on the growth of wild type worms were determined through qualitative microscopic observation and by quantitating the number of worms that grew in each heme concentration. In addition, the effect of varied nutrient concentrations can be assayed by utilizing worms that express fluorescent sensors that respond to changes in the nutrient of interest. Furthermore, a large number of worms were easily produced for the generation of transgenic C. elegans using microparticle bombardment.

Culturing Caenorhabditis elegans in Axenic Liquid Media and Creation of Transgenic Worms by Microparticle Bombardment

C. elegans is usually grown on solid agar plates or in liquid cultures seeded with E. coli. To prevent bacterial byproducts from confounding toxicological and nutritional studies, we utilized an axenic liquid medium, CeHR, to grow and synchronize a large number of worms for a range of downstream applications.

Die Züchtung<em&gt; Caenorhabditis elegans</em &gt; In Axenic Flüssige Medien und Erstellung von transgenen Worms durch Mikropartikelbeschuss

In this protocol, we present the required materials, and the procedure for making modified&#160;C. elegans&#160;Habituation and Reproduction media ...

Using Mouse Mammary Tumor Cells to Teach Core Biology Concepts: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Verwenden von Maus-Brusttumorzellen Kern Biology Concepts Lehren: A Simple Lab Module

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and biomedical sciences. This easy to follow protocol was developed for first year undergraduate pharmacy students and provides an entry-level introduction to enzyme reactions and analytical procedures for enzyme analysis. The enzyme of choice is lactase, as this represents an example of a commercially available enzyme relevant to human disease/pharmaceutical practice. Lactase is extracted from dietary supplement tablets, and assessed using a colorimetric assay based upon hydrolysis of an artificial substrate for lactase (ortho-nitrophenol-beta-D-galactopyranoside, ONPG). Release of ortho-nitrophenol following the hydrolytic cleavage of ONPG by lactase is measured by a change in absorbance at 420 nm, and the effect of the temperature on the enzymatic reaction is evaluated by carrying out the reaction on ice, at room temperature and at 37 &#176;C. More advanced analysis can be implemented using this protocol by assessing the enzyme activity under different conditions and using different reagents.

The enzymatic activity of lactase is essential for the catabolic processing of the disaccharide lactose. Here, the activity of lactase found in dietary supplements is assayed using a colorimetric assay. This provides students with an experimental platform for understanding the activity of lactase and enzyme kinetics.

Messung der Laktase enzymatische Aktivität in das Lehrlabor

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for cartilage tissue engineering. MSCs from synovial fluid (SF-MSCs) have been considered promising candidates for articular regeneration, and their potential therapeutic benefit has made them an important research topic of late. SF-MSCs from the knee cavity of the New Zealand white rabbit can be employed as an optimized translational model to assess human regenerative medicine. By means of CD90-based magnetic activated cell sorting (MACS) technologies, this protocol successfully obtains rabbit SF-MSCs (rbSF-MSCs) from this rabbit model and further fully demonstrates the MSC phenotype of these cells by inducing them to differentiate to osteoblasts, adipocytes, and chondrocytes. Therefore, this approach can be applied in cell biology research and tissue engineering using simple equipment and procedures.

This article presents a simple and economic protocol for the straightforward isolation and purification of mesenchymal stem cells from New Zealand white rabbit synovial fluid.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...