Diese Arbeit wurde in Richard M. Schultz &#39;s Labor durchgeführt. Die Autoren möchten auch Michael Lampson für die Konzeption der Zentromer-Counting-Assay und den Zugang zu seinem konfokalen Mikroskop erkennen. Teresa Chiang und Francesca Duncan in die Optimierung der Zentromer-Counting-Test unterstützt. Paula Stein wird von HD022681 unterstützt (RMS) und Karen Schindler wird von HD055822 unterstützt.

1. Maus Eizellenentnahme <ol><li> Zur Maximierung der Anzahl der Antralfollikeln von jeder Maus isoliert injizieren intraperitoneal geschlechtsreifen weiblichen Mäusen (wir verwenden 6-Wochen alten CF-1-Mäuse von Harlan) mit 5 IU von schwangeren Stute Serum Gonadotropin (PMSG). </li><li> Bereiten Sie die Sammlung Medium (MEM / PVP) (3 ml / Maus), indem Milrinon bis 2,5 um und warm bei 37 ° C. Milrinone ist ein Phosphodiesterase-Hemmer, der meiotischen Arrest hält einmal Oozyten aus Follikeln entfernt werden. Alternativ können 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX) (0,2 mM) oder Dibutyryl-zyklisches Adenosinmonophosphat (dbcAMP) (100 pg / ml) verwendet werden. Bereiten Sie das Kulturmedium durch Zugabe von Glutamin (1 mM) und Milrinon (2,5 pM) zu 1 ml CZB und lassen Sie es in den Inkubator für mindestens eine Stunde ausgleichen. Richten Sie die Mikro-Tropfen von jedem in einer Petrischale und Überlagerung mit Mineralöl. Die CZB Gericht ist in den Inkubator gelegt, während die MEM / PVP Schüssel bleibt draußen auf einer Folie wärmer. Andere Sammlung und Kulturmedium, die kommerziell verfügbar sind (M2 und M16 aus Sonstige Medien oder Sigma) werden auch routinemäßig eingesetzt. </li><li> Etwa 48 Stunden nach PMSG Grundierung, Opfer der Maus mit CO 2 Sedierung durch Genickbruch folgte, sezieren die Eierstöcke und legen Sie sie in ein Uhrglas mit vorgewärmten MEM / PVP + Milrinon (MEM / PVP + M). </li><li> Mit einer 1 ml Insulinspritze, Anker der Eierstöcke auf die Schüssel und lassen Sie die Antralfollikeln durch Punktion sie mehrmals mit 27-Gauge-(oder Nähen) Nadeln, die aneinander befestigt sind. </li><li> Während man durch ein Dissektionsmikroskop, sammeln Kumulus-Eizell Komplexe mit einem Mund-betrieben Glaspipette. Es ist hilfreich, ein Mikroskop mit viel Kontrast haben. Alternativ kann das Medium mit dem Gewebe und Zellen auf einem Deckel aus einer Kunststoff-Petrischale pipettiert werden. Nur sammeln großen, Antralfollikeln und nicht kleiner pre-Antralfollikeln oder entblößt Eizellen. Einmal gesammelt, übertragen Sie die Komplexe zu einer microdrop der MEM / PVP + M, die auf der Folie wärmer und unter Öl ist. </li><li> Mit einer kleinen Pipette (etwas größer als der Durchmesser der Eizelle), Pipette nach oben und unten die Komplexe, die Cumulus-Zellen zu lösen. Übertragen Sie die entblößten Eizellen mit einer größeren Pipette in ein microdrop von CZB + Milrinon (CZB + M) und in den Inkubator. </li><li> Lassen Eizellen für mindestens 1 h in den Inkubator vor Manipulation zu erholen. </li></ol> 2. Oocyte Mikroinjektion <ol><li> Machen Injektion Pipetten, indem Borosilikat-Glas-Kapillarröhrchen in einem mechanischen Abzieher. Wir verwenden ein Flaming-Brown Mikropipette Puller (Modell P-97) mit folgenden Einstellungen: P = 500, Heat = 300, Pull = 150, Vel = 100, Time = 150. </li><li> Bereiten Sie die Mikroinjektion Plattform, indem ein 5 pl Tropfen MEM / PVP + M so nah wie möglich an eine 0,5 ul Tropfen Injektion Material der Wahl (zB siRNA, cRNA, Morpholino-Oligonukleotid, etc.) auf einem 1-Kammer auch Folie, hat die Medien Kammer entfernt. Deckel mit Mineralöl und Platz auf dem Mikroskoptisch (Abb. 1). </li><li> Legen Sie Einspritz-und Pipetten in die Halter und die Position in den Tropfen MEM / PVP + M. Schalten Sie den Stickstofftanks, dass die picoinjector und Anti-Vibrations-Tabelle verbunden sind. Öffnen Sie die Spitze des Injektionspipette durch leichtes Antippen es gegen die Haltepipette beim Befüllen mit Medium. Wenn die Öffnung zu groß ist, wird das Medium in die und aus bewegen sich schnell, und die Nadel wird die Zelle zu töten. Pipetten mit zu klein für eine Öffnung oft leicht verstopfen. </li><li> Transfer-Oozyten (5-10) aus dem Inkubator auf die MEM / PVP + M Drop auf die Plattform. Vor der Injektion, Setup der picoinjector. Wir verwenden die folgenden Parameter auf unserer picoinjector (Model PLI-100 von Harvard Apparatus): PBal = 2,5-3,5 psi, PInj = 7,8 psi, PClear = 10-12 psi, Zeit = 3s. Dies resultiert in einem Injektionsvolumen von 5-10 pL. </li><li> Halten Sie die Taste CLEAR, bewegen Sie die Injektionsnadel, um das Material fallen zu lassen und zu füllen. Bringen Sie es zu dem Medium fallen. </li><li> Verwenden Sie die Haltepipette eine Eizelle zu erfassen und richten Sie die Injektionsnadel, Eizelle und Haltepipette entlang der x-Achse. </li><li> Unter höherer Vergrößerung Voraus Injektionspipette durch die Eizelle darauf achten, den Kern zu vermeiden. Sobald die Plasmamembran ist durchbohrt, drücken Sie injizieren. Nach der Injektion ziehen Sie die Nadel. Lassen Sie die Eizelle und zu wiederholen. Nachdem alle Eizellen injiziert werden, kehren sie in den Inkubator. Halten Sie in CZB + M für die gewünschte Menge an Zeit, diese Zeit ist abhängig von der experimentellen Ziel (dh siRNA und Morpholino Knockdown (bis zu 24 h), Überexpression (3-12 h)). Bitte beachten Sie, dass Inkubationen länger als 24 h wird meiotischen Reifung Kompromiss. </li></ol> 3. Eizellreifung <ol><li> Nach Inkubation der Eizellen durch mehrere Tropfen CZB (Reifung Medium) und Transfer zu einem microdrop der Reifung Medium unter Öl und in den Inkubator. </li><li> Lassen Sie 16 h für die vollständige Reifung t<html> o Metaphase der Meiose II. </li></ol> 4. Ploidie Analyse <ol><li> Bereiten CZB + Monastrol (100 uM) und Platz 750 ul in den Brunnen eines Organs Kulturschale, dass Wasser in den äußeren Ring. </li><li> Wash Eier durch mehrere Tropfen CZB + Monastrol und übertragen Sie sie in das Organ Kulturschale. Legen Sie in den Inkubator für 1 h. </li><li> Fix die Eier durch Überführung in ein Uhrglas mit 2% Paraformaldehyd in PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Transfer in ein anderes Uhrglas mit Blocking-Lösung. Dieses Gericht kann bei 4 ° C gelagert werden bis zur Verarbeitung. </li><li> Transfer zum Permeabilisierung Lösung (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN 3) in einem Uhrglas für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Spülen Sie durch mehrere große Mengen von Blockierungslösung (PBS + 0,3% BSA + 0,01 Tween-20 + 0,02% NaN 3). </li><li> Der Rest des Verfahrens ist auf dem Deckel einer 96-Well-Platte in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur, die vor Licht geschützt wird durchgeführt. Die Tropfen (~ 25 ul) sind innerhalb der kreisförmigen Vertiefungen platziert. Transfer-Eier Blockierungslösung für 15 Minuten. </li><li> Zur Beschriftung Zentromere, Transfer Eier zu einem Rückgang der Sperrung Lösung mit CREST Anti-Serum bei 1:40. Inkubieren für mindestens 1 h Wash bis 3 Tropfen Blockierungslösung, Inkubation 15 Minuten in jedem. </li><li> Transfer-Eier zu einem Rückgang der Sperrung Lösung mit Cy5-oder Alexa-Fluor-594-konjugierte anti-human IgG (1:200) und Inkubation für 1 Stunde. Wiederholen Sie die Waschschritte wie oben, außer für den letzten Schritt, gehören Sytox Green (1:5000) in Blocking-Lösung, um Chromosomen zu erkennen. Montieren Sie in 5 ul Vectashield. Um zu verhindern, Quetschen der Eier, legte 4 kleine Flecken von Vaseline an den Ecken, wo das Deckglas wird. Legen Sie ein Deckglas auf und Dichtung mit Nagellack. An einem schiebeschachtel bei 4 ° C bis zur Verarbeitung über die konfokale Mikroskopie. </li><li> Während Bildgebung mit einer 100X Objektiv, Capture 0,4 pm Schritte in der Z-Ebene und Image der gesamten Region des Metaphase-Spindel. Graf Zentromere mit Bildbearbeitungssoftware wie Image J (NIH). </li></ol> 5. Repräsentative Ergebnisse: Abbildung 2 ist ein Z-Projektion von einem euploiden Ei. In der Metaphase der MII enthalten euploiden Maus Eier 20 Chromosomenpaare und daher haben 40 Zentromere. Gelegentlich Chromosomen nicht, trotz Monastrol Behandlung zu verbreiten. Diese Situation macht es schwierig, zuverlässig zählen Zentromere und wir daher nicht enthalten diese Eier in unsere Analysen. Gelegentlich kann es schwierig sein, festzustellen, ob ein CREST-immunreaktive &quot;spot&quot; 1 oder 2 Zentromere ist. Mit Programmen wie Image J ist nützlich, weil man jeden Z-Abschnitt kann analysieren, während sorgfältig unter Hinweis auf die Orientierung der Chromosomen, die Zahl der Abschnitte, in denen ein &quot;Ort&quot; erkannt wird und die Pixel-Intensität der &quot;Flecken&quot;. Je nachdem, wo der meiotischen Spindel relativ zu den Polkörper positioniert ist, kann die DNA-Regionen überschneiden und diese Proben sollten nicht in die Analyse einbezogen werden. Unmanipulierten, in vivo ovulated Eier aus reproduktiv jungen Mäusen haben niedrige Aneuploidie (~ 1-2%). Jedoch aus Gründen nicht verstanden, Mikroinjektion und in-vitro-Maturation Verfahren erhöhen diese Rate nach oben von 10%. Deshalb ist es entscheidend, dass die Kontrolle injizierten Oozyten in jeder Mikroinjektion Studie enthalten sind. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig1.jpg" alt="Abbildung 1"/> Abbildung 1. Mikroinjektion Gericht eingerichtet. Eine Kammer slide mit 5 ul Tropfen MEM / PVP + M oberhalb 0.5μl Tropfen Injektionslösung. Deckel mit Mineralöl. In diesem Beispiel gibt es 3 Tropfen für 3 verschiedene Injektionslösungen und die Folie ist auf der Bühne eines Mikroskops sitzen. Auf der linken Seite ist die Mikroinjektionsnadel und auf der rechten Seite ist die Holding-Pipette. Beachten Sie, dass es ein Spiegelbild der Nadelhalter. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Ploidie Ergebnisse. Ein Z-Projektion eines euploiden Metaphase II Ei. DNA ist in grün gefärbt und Kinetochoren sind rot gefärbt. Die Pfeile zeigen auf 2 verschiedene Chromatid Arme darauf hinweist, dass Kinetochoren (# 17 und # 18) überlappen. Euploiden Mäuse-Eizellen enthalten 20 Kinetochor Paare (40 total &quot;spots&quot;). Ein aneuploid Ei enthalten würde jede Veränderung unter dieser Nummer. Wenn dieses Verfahren auf Metaphase MI-Oozyten durchgeführt wurden, befinden sich 40 Kinetochor Paare (80 total &quot;spots&quot;) werden. <img src="/files/ftp_upload/2851/2851table1.jpg" alt="Tabelle 1"/> Tabelle 1. Rezept für die Sammlung und Mikroinjektion Medium (MEM / PVP + M). Alle Materialien sind embryo-culture grade und von Sigma-Aldrich. Filter durch 0,22 &amp;mgr; m PVDF-Filter (wir verwenden Milipore Stericups) und lagern bei 4 ° C sterilisieren iles/ftp_upload/2851/2851table2.jpg &quot;alt =&quot; Tabelle 2 &quot;/&gt; Tabelle 2. Rezept für CZB Medium. Alle Materialien sind embryo-culture grade und von Sigma-Aldrich. Filter durch 0,22 &amp;mgr; m PVDF-Filter (wir verwenden Milipore Stericups) und lagern bei 4 ° C sterilisieren

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Mikroinjektion von Eizellen ist eine leistungsfähige Methode, um Mechanismen, die meiotischen Reifung 10,11, 12, 13 regulieren zu studieren. Diese Methode bietet eine kostengünstige Möglichkeit, Hypothesen testen, bevor was eine große Investition in die Entwicklung transgener und gezielte Mausmodellen. Eizellenentnahme und Mikroinjektion Techniken erfordern mehr Zeit als typische Zellbiologie Verfahren beherrschen. Spezifische Hindernisse mit der Sammlung enthalten oft die Steuerung der Mund pipettieren, Ziehen der richtigen Größe Glaspipette für die Sammlung und Strippen der Körperzellen und wachsende Sammlung Geschwindigkeit, um die Zeit, in der Eizellen außerhalb des Inkubators zu minimieren. Wir empfehlen praktizieren viele Male vor der Durchführung von Experimenten. Übertragen Eizellen zwischen Mikro unter Beibehaltung der gleichen Anzahl von Zellen ist ein guter Weg, um sich mit dieser Methode. Der Zelltod tritt häufig beim Lernen Mikroinjektion. Dies könnte für eine Reihe von Gründen, einschließlich Injektion zu groß mit einem Volumen von Material (dh die Injektionsnadel Öffnung zu groß ist), trifft den Kern mit der Injektionsnadel, Durchstechen der gegenüberliegenden Seite der Eizelle oder die auftreten können, das Material injiziert ist giftig für die Eizelle. Das Üben mit Injektion von Puffer in Oozyten, bis Ihre Überlebensrate liegt bei mindestens 50% ist der Schlüssel zur Beherrschung dieser Technik. Wenn Eizellen reifen nicht es ist wahrscheinlich, dass die Milrinon nicht verdünnt genug. Wir empfehlen Spülen der Eizellen durch viele große Tropfen Milrinon-free CZB vor der Reifung. Die Ploidie Analyse folgende Mikroinjektion ist eine von vielen Assays zur meiotischen Reifung zu beurteilen. Andere Routineanalysen wir den Einsatz im Labor gehören die Überwachung der Kinetik, mit dem die Eizellen Fortschritt durch Meiose, Immunfluoreszenz zur Spindel Bildung und Chromosomen-Ausrichtung und Ei-Aktivierung zu analysieren oder in-vitro-Fertilisation mit den Entwicklungs Folgen der Eizelle Manipulation 14,15, 16 zu bewerten, 17.

Tabelle der spezifischen Reagenzien: <table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenz </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Milrinone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4659 </td><td> Resuspendieren in DMSO bei 2,5 mm </td></tr><tr><td> Mineralöl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M5310 </td><td> Nur Embryo-geprüft, sterilfiltriert verwenden </td></tr><tr><td> CREST Eigenserum </td><td> Immunovision </td><td> HCT-0100 </td><td></td></tr><tr><td> Sytox Grün </td><td> Invitrogen </td><td> 57020 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-human Alexa 594 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11014 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> Vector Laboratories </td><td> H-100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Polysciences </td><td> 577773 </td><td></td></tr><tr><td> Albumin aus Rinderserum </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A3294 </td><td></td></tr><tr><td> PMSG </td><td> Calbiochem </td><td> 367222 </td><td></td></tr><tr><td> Monastrol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8515 </td><td> Resuspendieren in DMSO bei 100mm </td></tr><tr><td> Tween-20 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 274348 </td><td></td></tr><tr><td> TritonX-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td></td></tr></tbody></table> Tabelle der spezifischen Ausstattung: <table border="1"><tbody><tr><th> Name der Ausrüstung </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare </th></tr><tr><td> Mundstück </td><td> Biodiseno </td><td> MP-001-Y </td><td></td></tr><tr><td> UhrglasnÃ </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 70543-30 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze </td><td> BD </td><td> 309623 </td><td> 1ml, 27G 1 / 2 </td></tr><tr><td> 60 mm Petrischale </td><td> Falke </td><td> 351007 </td><td></td></tr><tr><td> Glas Pasteur Pipetten </td><td> Fisher Scientific </td><td> 13-678-200 </td><td></td></tr><tr><td> Side wärmer </td><td> Fisher Scientific </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Dissektionsmikroskop </td><td></td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Chamber Slide </td><td> Nunc </td><td> 177372 </td><td></td></tr><tr><td> Kapillarrohr </td><td> Drummond </td><td> 1-000-0500 </td><td> microcaps </td></tr><tr><td> Pipette Puller </td><td> Flaming-Brown Mikropipette puller </td><td></td><td> Modell P-97 </td></tr><tr><td> Inversen Mikroskop </td><td> Nikon </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Mikromanipulatoren </td><td> Eppendorf </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Picoinjector </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modell PLI-100 </td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> CO 2-Panzer </td><td></td><td></td><td> Für Inkubator </td></tr><tr><td> N2-Tank </td><td></td><td></td><td> Für Tisch und Injektor </td></tr><tr><td> Anti-Vibrations-Tabelle </td><td> Technische Herstellung </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Inkubator </td><td></td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Halten Pipetten </td><td> Eppendorf </td><td> 930001015 </td><td> Vacutip </td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop </td><td> Leica </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Dissection-Tools </td><td> Feine Science-Tools </td><td></td><td> Jede Standard-Modell </td></tr><tr><td> Feuchtekammer </td><td></td><td></td><td> Wir verwenden tupperware </td></tr><tr><td> Deckel von 96-Well-Platte </td><td> Nunc </td><td> 263339 </td><td></td></tr><tr><td> Objektträger </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544-3 </td><td></td></tr><tr><td> Deckgläser </td><td> Thomas wissenschaftlichen </td><td> 6663-F10 </td><td> Dicke wird für bestimmte Mikroskope variieren </td></tr><tr><td> Zentrum und Orgel Kulturschale </td><td> Fisher Scientific </td><td> 353037 </td><td> 60 X 15mm </td></tr></tbody></table>

mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment

Fehler in Chromosomensegregation zu aneuploiden Zellen führen. In somatischen Zellen ist Aneuploidie mit Krebs in Verbindung gebracht, aber in Gameten führt Aneuploidie zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Haploide Gameten Form durch artspezifische Entwicklungsprogramme, die Meiose gekoppelt sind. Die ersten Reifeteilung (MI) ist einzigartig auf der Meiose, weil Schwesterchromatiden verbunden bleiben, während homologen Chromosomen getrennt sind. Aus Gründen noch nicht vollständig verstanden ist dies reductional Division fehleranfällig und wird häufiger die Quelle der Aneuploidie als Fehler in der Meiose II (MII) oder als Fehler in der männlichen Meiose 1,2. In Säugetieren, Eizellen Verhaftung Prophase der MI mit einem großen, intakten Keimbläschen (GV; Kern) und erst wieder Meiose, wenn sie ovulatorischen Hinweise erhalten. Nach der Meiose wieder aufgenommen wird, Eizellen komplette MI und unterliegen einer asymmetrischen Zellteilung, verhaften wieder in der Metaphase der MII. Eier werden nicht komplette MII, bis sie durch Spermien befruchtet werden. Eizellen können auch unterziehen meiotischen Reifung mit in-vitro-Kultur Bedingungen 3 etabliert. Da Generation von transgenen und Gen-gezielte Mausmutanten ist kostspielig und kann längere Zeit dauern, ist die Manipulation der weiblichen Gameten in vitro eine wirtschaftlichere und zeitsparende Strategie. Hier beschreiben wir Methoden zur Prophase verhaftet Eizellen von Mäusen und für die Mikroinjektion zu isolieren. Jegliches Material der Wahl kann in die Eizelle eingebracht werden, sondern weil meiotisch-kompetenten Oozyten transkriptionell stillen sind 4,5 cRNA und nicht DNA, muss für ektopische Expression Studien injiziert werden. Um zu beurteilen, Ploidie, beschreiben wir unsere Bedingungen für in-vitro-Maturation von Eizellen zu MII Eier. Historisch gesehen sind Chromosom-Verbreitung Techniken zum Zählen Chromosom Nummer 6 verwendet. Diese Methode ist technisch anspruchsvoll und ist limitiert auf nur identifizieren hyperploidies. Hier beschreiben wir eine Methode, um Hypo-und hyperploidies mit intakten Eiern 7-8 zu bestimmen. Diese Methode verwendet Monastrol, ein Kinesin-5-Hemmer, dass die bipolare Spindel fällt in eine monopolare Spindel 9 so trennt Chromosomen so dass die einzelnen Kinetochoren leicht erkannt und mit Hilfe eines anti-CREST autoimmune Serum gezählt werden. Da diese Methode in intakten Eiern durchgeführt wird, sind die Chromosomen nicht verloren wegen Bedienfehler.

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Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

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Research

JoVE Journal

Biology

29.7K Aufrufe.  University of Pennsylvania. Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Serie: Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Microinjection of A. aegypti Embryos to Obtain Transgenic Mosquitoes

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever.  The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue fever. The techniques for correctly preparing microinjection needles, dessicating embryos, and performing microinjection are demonstrated.

Mikroinjektion von A. aegypti Embryonen, um transgene Moskitos erhalten

In this video, Nijole Jasinskiene demonstrates the methodology employed to generate transgenic Aedes aegypti mosquitoes, which are vectors for dengue ...

Forschung

Biologie

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Generierung von stabilen transgenen C. elegans mit Mikroinjektion

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Single Oocyte Bisulfite Mutagenesis

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for regulating gene transcription1. DNA methylation is an epigenetic modification that acts predominantly as a repressive mark. Through the covalent addition of a methyl group onto cytosines in CpG dinucleotides, it can recruit additional repressive proteins and histone modifications to initiate processes involved in condensing chromatin and silencing genes2. DNA methylation is essential for normal development as it plays a critical role in developmental programming, cell differentiation, repression of retroviral elements, X-chromosome inactivation and genomic imprinting.
One of the most powerful methods for DNA methylation analysis is bisulfite mutagenesis. Sodium bisulfite is a DNA mutagen that deaminates cytosines into uracils. Following PCR amplification and sequencing, these conversion events are detected as thymines. Methylated cytosines are protected from deamination and thus remain as cytosines, enabling identification of DNA methylation at the individual nucleotide level3. Development of the bisulfite mutagenesis assay has advanced from those originally reported4-6 towards ones that are more sensitive and reproducible7. One key advancement was embedding smaller amounts of DNA in an agarose bead, thereby protecting DNA from the harsh bisulfite treatment8. This enabled methylation analysis to be performed on pools of oocytes and blastocyst-stage embryos9. The most sophisticated bisulfite mutagenesis protocol to date is for individual blastocyst-stage embryos10. However, since blastocysts have on average 64 cells (containing 120-720 pg of genomic DNA), this method is not efficacious for methylation studies on individual oocytes or cleavage-stage embryos.
Taking clues from agarose embedding of minute DNA amounts including oocytes11, here we present a method whereby oocytes are directly embedded in an agarose and lysis solution bead immediately following retrieval and removal of the zona pellucida from the oocyte. This enables us to bypass the two main challenges of single oocyte bisulfite mutagenesis: protecting a minute amount of DNA from degradation, and subsequent loss during the numerous protocol steps. Importantly, as data are obtained from single oocytes, the issue of PCR bias within pools is eliminated. Furthermore, inadvertent cumulus cell contamination is detectable by this method since any sample with more than one methylation pattern may be excluded from analysis12. This protocol provides an improved method for successful and reproducible analyses of DNA methylation at the single-cell level and is ideally suited for individual oocytes as well as cleavage-stage embryos.

Bisulfite mutagenesis is the gold standard for analyzing DNA methylation. Our modified protocol allows for DNA methylation analysis at the single-cell level and was specifically designed for individual oocytes. It can also be used for cleavage-stage embryos.

Einzel Oocyte Bisulfit-Mutagenese

Epigenetics encompasses all heritable and reversible modifications to chromatin that alter gene accessibility, and thus are the primary mechanisms for ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

In-vivo-Mikroinjektion und Elektroporation von Maus-Hoden

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

Erzeugung transgener<em&gt; Hydra</em&gt; Durch Mikroinjektion Embryo

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Ein Protokoll für die Verwendung von Gen Set Anreicherung Analyse zur Ermittlung von geeigneten Tiermodell für die translationale Forschung

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

Trans-innere Zelle Masse Injektion von embryonalen Stammzellen führt zu höheren Chimerism Raten

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Cardiomyocytes from Fixed Hearts for Immunocytochemistry and Ploidy Analysis

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably identify nuclei of cardiomyocytes on histological sections, many groups rely on isolating viable cardiomyocytes prior to fixation to perform immunostaining. However, these live cardiomyocyte isolation techniques require optimization to maximize the yield, viability and quality of the samples, with inherent fluctuations from sample to sample despite maximum optimization. Here, we report a reproducible protocol, involving fixation prior to enzymatic digestion of the heart, which leads to maximum yield while preserving the in vivo morphology of individual cardiomyocytes. We further developed an automated analysis platform to determine the number of nuclei and DNA content per nucleus for individual cardiomyocytes. After exposing the chest cavity, the heart was arrested in diastole by perfusion with 60 mM KCl in PBS. Next, the heart was fixed in 4% paraformaldehyde (PFA) solution, and then digested with 60 mg/mL collagenase solution. After digestions, cells were singularized by trituration, and the cardiomyocyte fraction was enriched via differential centrifugation. Isolated cardiomyocytes were stained for Troponin T and &#945;-actinin to assess purity of the obtained population. Furthermore, we developed an image analysis platform to determine cardiomyocyte nucleation and ploidy status following DAPI staining. Image based ploidy assessments led to consistent and reproducible results. Thus, with this protocol, it is possible to preserve native morphology of individual cardiomyocytes to allow immunocytochemistry and DNA content analysis while achieving maximum yield.

The goal of this work is to develop a method to reproducibly isolate cardiomyocytes from the adult heart and measure DNA content and nucleation.

Isolierung von Kardiomyozyten aus festen Herzen für die Immunzytochemie und Ploidie-Analyse

The adult mammalian heart is composed of various cell types including cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts. Since it is difficult to reliably ...