Die Transkriptomanalyse an einzelnen Zellen oder Zelltypen kann den feinen Unterschied der Genexpression erkennen, der durch Heterogenität maskiert wird, was ein leistungsfähiges Werkzeug ist, um die ausgeklügelten intrazellulären Regulationsmechanismen aufzudecken. Die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit anschließender RN-seq-Analyse kann entweder im Einzelzell- oder Massenzellmodus mit hoher Transkriptdetektionsempfindlichkeit und Kompatibilität mit anderen Multi-Omik-Ansätzen durchgeführt werden. Erstanwender dieses Protokolls müssen auf einige Schritte bei der Protoplastensortierung und der Vorbereitung der RNA-seq-Bibliothek achten.
Zusammen mit Jun Zhang wird Dr. Rongrong Xie, ein Postdoktorand in unserem Labor, bei der Demonstration des Verfahrens helfen. Geben Sie zunächst die Samen des Wildtyps Arabidopsis thaliana und der fluoreszierenden Markierungslinie in 20%iges Bleichmittel und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang mit einem rotierenden Inkubator bei Raumtemperatur, um die Samen zu sterilisieren. Während Sie auf einer sterilen Werkbank arbeiten, spülen Sie die Samen drei- bis fünfmal in doppelt destilliertem Wasser ab.
Die Samen des Wildtyps und der Reporterlinie werden auf halbstarkem MS-Medium mit 0,8 Gew.-% pro Volumen-Agar angerichtet. Stratieren Sie die Pflanzen zwei Tage lang bei vier Grad Celsius. Dann züchten Sie sie fünf Tage lang vertikal bei 23 Grad Celsius unter 16-stündigen Licht- und 18-stündigen Dunkelzyklen.
Tauen Sie die protoplasting Lösungen, die als Lösung A und Lösung B bezeichnet werden, vor dem Experiment vorsichtig auf Eis auf. Schneiden Sie die Wurzeln mit einer sauberen Klinge oder Schere von den Pflanzen ab und hacken Sie die Wurzeln in ca. 0,5 Zentimeter große Stücke. Tauchen Sie die gehackten Wurzeln in 1,5 Milliliter Lösung B und drehen Sie sie anschließend 1,5 bis 2 Stunden lang vorsichtig bei Raumtemperatur.
Filtern Sie die resultierenden Wurzelprotoplasten durch ein 40-Mikron-Siebgewebe und spülen Sie das Gewebe mit ein bis zwei Millilitern Lösung A. Zentrifugieren Sie die kombinierten Filtrate bei 300 G fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette, resuspendieren Sie das Zellpellet in 500 bis 600 Mikrolitern Lösung A und legen Sie es sofort auf Eis. Zur Zellsortierung wird die resuspendierte Zelllösung in ein neues Fünf-Milliliter-Reagenzglas überführt.
Füllen Sie den Mantelflüssigkeitstank und überprüfen Sie den Fäkalientank. Schalten Sie dann die fluoreszenzaktivierte Zellsortier- oder FACS-Maschine ein. Führen Sie die Schritte zum Einrichten des Geräts und zur automatischen Kalibrierung am Sortierer durch.
Wählen Sie die Fluoreszenzkanäle aus und verwenden Sie eine Wildtyppflanze ohne Fluoreszenz als Basiskontrolle. Passen Sie den Sortierschieber basierend auf der Fluoreszenzintensität und den Singuletts der Vorwärtsstreuung und der Seitenstreuung an. Nachdem Sie 500 Mikroliter Lösung A in ein 1,5-Milliliter-Sammelröhrchen gegeben haben, beginnen Sie mit der Sortierung und sammeln Sie 2.000 bis 3.000 Zellen pro Röhrchen.
Legen Sie die Proben nach dem Sortieren sofort auf Eis. Zentrifugieren Sie das Sammelröhrchen mit den Zellen bei 300 G und vier Grad Celsius für fünf Minuten und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Nehmen Sie zwei Mikroliter sortierte Zellen und prüfen Sie sie mit einem Fluoreszenzmikroskop auf Fluoreszenz.
Lagern Sie die sortierten Zellen bei minus 80 Grad Celsius, wenn sie nicht sofort verwendet werden. Für die Sortierung des Einzelzellindex setzen Sie die 96-Well-Platte mit Membran in den Adapter ein. Kalibrieren Sie die Position der Platte so, dass der Tropfen in das mittlere Loch der Platte fällt.
Entfernen Sie die Membran von der 96-Well-Platte und setzen Sie die 96-Well-Platte in den Adapter ein. Wählen Sie beim Sortieren den Sortiermodus für einzelne Zellen aus. Geben Sie die Zielanzahl der sortierten Zellen als eine ein und beginnen Sie mit der Sortierung.
Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, reinigen Sie die Bank mit einem Oberflächendekontaminationsmittel und 75%igem Ethanol. Verwenden Sie alle Geräte nur für die Vorbereitung der Sequenzierungsbibliothek. Nachdem Sie einen Mikroliter der frisch zubereiteten Mischung A in die sortierte Probe gegeben haben, mahlen Sie sie mit einem sterilen Stößel.
Mit RNAse-freiem Wasser wird das Volumen auf 14 Mikroliter erhöht. Anschließend wird jede Probe in ein dünnwandiges 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen überführt. Bereiten Sie dann die Mischung B vor.Geben Sie 4,4 Mikroliter in Mischung B in jedes PCR-Röhrchen mit den Proben und mischen Sie es durch sanftes Pipettieren.
Inkubieren Sie die Proben drei Minuten lang bei 72 Grad Celsius. Nach der Inkubation werden die Proben sofort auf Eis gelegt, um das Oligo dT mit dem Poly-A-Schwanz zu hybridisieren. Bereiten Sie das Reverse-Transkriptions-Reaktionsgemisch oder das Gemisch C in 21,6 Mikrolitern davon in jedem Röhrchen vor, das die Proben enthält.
Die Proben werden einer reversen Transkriptionsreaktion in einem gängigen PCR-Gerät gemäß dem reversen Transkriptionsprogramm unterzogen. Fügen Sie dem Produkt der reversen Transkriptionsreaktion 40,8 Mikroliter der frisch zubereiteten Voramplifikationsreaktionsmischung oder des Gemisches D hinzu und führen Sie das Voramplifikationsprogramm aus. Der Amplifikationszyklus kann durch quantitative PCR bestimmt werden, wenn die Reaktion gerade in die exponentielle Phase eintritt.
Um die Produkte der Voramplifikationsreaktion aufzureinigen, werden die voramplifizierten Produkte aus einem PCR-Röhrchen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt. Geben Sie 48 Mikroliter AMPure XP-Beads in jede Probe und mischen Sie sie vor der Inkubation vorsichtig durch Pipettieren. Legen Sie die 1,5-Milliliter-Röhrchen mit den Proben und Kügelchen für fünf Minuten auf einen magnetischen Trennständer.
Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig aus den Proben, ohne die Kügelchen zu stören. Nachdem Sie sie in 200 Mikrolitern 80%igem Ethanol resuspendiert haben, legen Sie sie für weitere drei Minuten auf den Magnetabscheideständer. Nachdem Sie den Ethanolüberstand verworfen haben, trocknen Sie die Proben 10 Minuten lang in einem Röhrchen an der Luft.
Resuspendieren Sie die Kügelchen in 20 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser und inkubieren Sie sie fünf Minuten lang bei Raumtemperatur. Legen Sie sie dann für fünf Minuten auf den magnetischen Trennständer. Übertragen Sie mit einer Pipette 18 Mikroliter des Überstands aus jedem Röhrchen in ein neues 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Befolgen Sie schließlich die im Text beschriebenen Schritte, um die Vorbibliothek zu charakterisieren, gefolgt von der Erstellung, Reinigung und Quantifizierung der Bibliothek. Die fluoreszierenden Arabidopsis thaliana-Markerlinien wurden durch die Fusion von fluoreszierenden Proteinen mit Genen, die spezifisch in Zielzelltypen exprimiert werden, oder durch die Verwendung von Enhancer-Trap-Linien entwickelt. Die fluoreszenzspezifisch markierten Protoplasten wurden erfolgreich anhand der Fluoreszenzintensität und der Vorwärtsstreuung und der seitlichen Streuung von Singuletts sortiert.
Die sortierten Zellen wurden mittels Hellfeld- und Fluoreszenzbildgebung visualisiert. Die repräsentativen Ergebnisse der RNA-Sequenzierungsbibliothek von etwa 2.000 Xylempol-Pericycluszellen, lateralen Wurzelprimordialzellen, Endodermis- oder Cortexzellen und lateralen Wurzelkappenzellen werden gezeigt. Eine kleine Bibliothek mit Primer- oder Adapter-Dimer-Peaks konnte nach der Größenauswahl noch sequenziert werden.
Eine Bibliothek mit einer abnormalen Größenverteilung deutete auf eine nicht erfolgreiche Bibliotheksvorbereitung hin. Die Genexpressionsmuster wurden analysiert. Die Gene, die in einem der vier Wurzelzelltypen angereichert waren, wurden geclustert und in einer Heatmap dargestellt, die die Spezifität der Genexpression zwischen verschiedenen Zelltypen zeigt.
Hohe Qualität und Reinheit der Zielzellen durch korrektes Gating und Sortieren sowie die Verhinderung des RNA-Abbaus sind der Schlüssel zum erfolgreichen Bibliotheksaufbau. Für RNA-seq im Einzelzellmodus wurden kürzlich mehrere Methoden beschrieben, die mit dem eindeutigen molekularen Identifikator integriert sind und die Leistung signifikant verbessert haben.
