We thank all the authors of the original ERRBS report. We thank Mame Fall for technical assistance. We acknowledge the Weill Cornell Medical College Epigenomics Core for technical services and assistance. The work was supported by a Sass Foundation Judah Folkman Fellowship, an NCI K08CA169055 and ASH-AMFDP12005 to FGB, NIH R01HG006798 and R01NS076465, funding from the Irma T. Hirschl and Monique Weill-Caulier Charitable Trusts and STARR Consortium (I7-A765) to CEM, and an LLS SCORE grant (7006-13) to AMM.

Alle Geschäfte durchgeführt werden von der Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und befolgt, National Institute of Health Richtlinien. 1. Operationstechnik <ol><li> Pflegen aseptische Technik bei diesem Verfahren, indem sie sterile Handschuhe, Instrumente, und ein steriles Operationsfeld nach NIH-Richtlinien 25. Sterilisieren Instrumente vor Beginn der Operation durch Autoklavieren ihnen (siehe Tabelle der spezifischen Reagenzien / Ausrüstung für die komplette Liste). Verwenden Sie eine Glasperlen Sterilisator Werkzeuge während der Operation zu sterilisieren. </li></ol> 2. Anästhesie und Vorbereitung <ol><li> Anesthetize die Maus in einem Anästhesie-Box mit einer Mischung aus 0,9 l / min Sauerstoff und 2,5% Isofluran mit einem veterinär Isofluran Verdampfersystem. Stellen Sie sicher, dass die Maus nicht zu Veränderungen in der Körperposition, bevor es dem Auspacken zu reagieren. </li><li> Bewerben Augensalbe auf die mouse in die Augen, um sie vor dem Austrocknen zu schützen. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom aus der Box an den Nasenkegel. Platzieren Sie die Maus direkt auf seiner linken Seite auf einer erhitzten Unterlage mit einem Operationsfeld und absorbierende Papierbank mit der Nase und den Mund innerhalb des Kegels bedeckt. Die Maus Atemrhythmus und bewerten fortlaufend zu überwachen und anzupassen Isofluran Ebenen nach Bedarf (zwischen 2,5 bis 3% Isofluran), ein angemessenes Niveau der Narkose zu halten und verwenden die Zehe Prise Reflex auf insgesamt Sedierung bestätigen. </li></ol> 3. Chirurgische Vorgehensweise <ol><li> Ausrichten und konzentrieren das Stereoskop mit dem OP-Feld. Passen Sie den Nasenkegel und kleben Sie es nach unten, so dass es am Rand des Gesichtsfeldes positioniert ist. </li><li> Mit der Maus, der auf der linken Seite, kleben Sie den Rand des rechten Ohr auf die Bugnase, Freilegung der Bereich hinter dem Ohr, wo der Schnitt gemacht werden. Stellen Sie sicher, dass die hintere Ohrvene fährt horizontal über das Ohr. Man beachte, dass die korrekte Platzierung ter Tier- und Taping des Ohres sind von entscheidender Bedeutung, um die Gesichtsnerven schnell zu finden. </li><li> Befeuchten Sie das Fell auf und hinter dem Ohr mit 70% Ethanol und rasieren die Operationsstelle mit einer Rasierklinge oder Skalpell. Vorbenetzung das Fell macht Rasieren leichter in dieser anatomischen Lage. </li><li> Reinigen der Haut mit einer Jodlösung, wie Betadine chirurgischen Scheuer (7,5% Povidon-Iod), gefolgt von 70% Ethanol. Wiederholen Sie diese Reinigung noch zweimal, um den Bereich gründlich zu desinfizieren. </li><li> Um festzustellen, wo der Schnitt zu machen, verfolgen Sie die hinteren Ohrvene aus dem Ohr nach kaudal auf den Bereich hinter dem Ohr Vorsprung. Mit Federschere, einen 4 mm Schnitt 2-3 mm hinter dem Vorsprung. </li><li> Präparieren durch das subkutane Fett und Bindegewebe mit stumpf. Vermeiden Sie direkte Schneiden mit der Schere, weil die Blutgefäße oder Muskelgewebe leicht beschädigt werden könnte. </li><li> Wenn die Blutung auf, Druck auf die Operationsstelle mit einem sterilen Wattestäbchenfür mindestens 30 sec. Wenn bedeutende Flüssigkeitsverlust auftritt, injizieren die Maus intraperitoneal mit bis zu 0,5 ml steriler 0,9% iger Kochsalzlösung unter Verwendung einer 25 oder 27 G-Nadel. </li><li> Verwenden Sie mehrere wichtige Sehenswürdigkeiten, die N. accessorius, Gehörgang, und vorderen M. digastricus (siehe unten), um die Gesichtsnerven zu lokalisieren. Sezieren um diese Landmarken, bis die Zweige des Gesichtsnervs visualisiert werden. Der Nerv wird als bedeutender solid weiß Struktur angezeigt, wenn es aufgedeckt wird und eine Schicht aus Faszie haftet sie an die zugrunde liegenden Strukturen. <ol><li> Finden Sie die N. accessorius, die aus dem kaudalen Teil des Schädels reist, um die Trapezmuskel innervieren, sobald das subkutane Fett und Bindegewebe wurden seziert. Der Gesichtsnerv ist tief mit dem N. accessorius. </li><li> Finden Sie die knorpeligen Gehörgang, die strahlend weißen aussieht und rostral des Gesichtsnerven zu sehen. </li><li> Finden Sie die Muskelbauch des vorderen M. digastricus, der oben auf und c liegtaudal des Gesichtsnervs. </li></ol></li><li> Wenn die Hauptzweige des Gesichtsnervs visualisiert, Spuren sie dorsal ihrer Herkunft aus den Foramen stylomastoideum finden. Mit feiner Spitze Dumont Pinzetten # 5/45 um die Operationsstelle offen zu halten, zu fördern die Federscherenspitzen nach dem Pfad des Nervs, und bewegen Sie die Zange dorsal um den neu erweiterten Bereich offen zu halten. </li><li> Visualisieren Sie die Stamm des Facialis mit dem Jochbein, bukkale, und Randkieferzweige an dieser Stelle. HINWEIS: Die zeitliche Niederlassung wird näher an das Foramen finden. Die Randkiefernervenäste in die oberen und unteren Teil näher an der Backe, damit diese Nervenäste nicht auf dieser Ebene sichtbar sein. <ol><li> Bei Durchführung einer Nervendurchtrennung, Stabilisierung des Nerven vorsichtig mit der feinen Spitze Pinzette und schneiden Sie die Nerven mit den Feder Schere. Vermeiden Sie die Anwendung zu viel Traktion auf die Nerven mit der Zange avulsing den Nerv aus dem Hirnstamm zu verhindern. Drückendie Stümpfe voneinander entfernt oder ausgeschnitten und ein Abschnitt des distalen Nerv zu entfernen, um sicherzustellen, dass keine Wiederverbindung auftreten kann. </li><li> Bei Durchführung einer Quetschverletzungen, verwenden Dumont # 5/45 Pinzette, um den Nerv für 30 Sekunden mit konstantem Druck, alle Axone trennen, wiederholen Sie diesen Andrang in einem zweiten Winkel senkrecht zur ersten Quetschstelle zu komprimieren. Vermeiden Sie die Anwendung unterschiedliche Mengen an Druck während der 30 Sekunden zu vernichten, da sonst die Verletzung inkonsistent zwischen den Tieren sein. </li></ol></li></ol> 4. Schließen und Wiederherstellung <ol><li> Positionieren Sie das Fett und die Muskeln in den darunterliegenden Strukturen. </li><li> Näherungsweise die Kanten des Einschnitts und schließen Sie die Wunde mit einem 7,5 mm Wundklammer. Nahtmaterial oder Klebstoff sind auch für den Wundverschluss akzeptabel. Postoperative Schmerz kann zu diesem Zeitpunkt zur Verfügung gestellt werden. </li><li> Entfernen Sie das Band von Ohr die Maus. Schalten Sie die Isofluran Fluss und damit die Maus, um reinen Sauerstoff für 30 Sekunden zu atmen, um 1 Min. PlAss der Maus in einem leeren Käfig ohne Einstreu aus der Narkose zu erholen. </li><li> Wenn die Maus wieder, verfolgen Sie sein Verhalten für bestätigende Anzeichen von Gesichtslähmung. Die Schnurrhaare werden gelähmt und abgewinkelt zurück in Richtung der Wange sein, wird die Nase abgewichen werden, und das Auge wird nicht als Reaktion auf einen Luftstoß blinken. </li><li> Haustieren gemeinsam nach der Operation, wenn sie weiblich sind. Vermeiden männlichen Mäusen gemeinsam, weil sie sind aggressiver und neigen dazu, Gewalt zu entfernen Wundklammern ihres cagemate, die Infektion führt. Bereitzustellen postoperativen Schmerz zu dieser Zeit, falls erforderlich. </li><li> Überwachen die Mäuse einmal am Tag über mehrere Tage nach der Operation, um sicherzustellen, dass keine Infektion oder andere Komplikation tritt postoperativ. Entfernen Wundklammern 7-10 Tage nach der Operation, wenn sie nicht auf eigene Faust zurückgegangen. </li><li> Bewerben Schmieraugensalbe in das betroffene Auge täglich Hornhautkomplikationen zu vermeiden, sei es, bis das Auge Blinkreflex ist neuabgedeckt oder bis Euthanasie. </li></ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen.

Die vorgestellten Protokoll Erträge Basenpaar-Feindaten von Cytosin-Methylierung in biologisch relevanten genomischen Regionen. Das Protokoll geschrieben wird 50 ng des Ausgangsmaterials optimiert, kann es jedoch geeignet ist, einen Bereich von Eingangsmaterial (5 ng oder mehr) 26 handhaben. Dies wird Anpassungen einiger der Protokollschritte erforderlich, wie in Tabelle 6 zu sehen. Die ERRBS Bibliotheken zugänglich sind gepaart Ende Sequenzierung und weitere genomische Abdeckung kann auch durch Sequenzierung durchgeführt werden liest mehr als 51 Zyklen. Multiplex-Sequenzierung wird eine kostengünstigere Protokoll pro Probe anbieten, dies jedoch zu einer verringerten Verbrauch pro CpG-in den Daten (Abbildung 5 und Tabelle 8) vertreten führen und ausreichend Tiefe der Berichterstattung, um Analysen, die hohe Reichweite pro erfordern führen nicht nachgeben CpG-Stelle (zB durch Landan et al. 33 beschrieben). Schließlich dieses Protokoll (oder ein Bisulfit-basierten Protokolls inl) kann nicht zwischen Methyl-Cytosin und Hydroxymethyl-Cytosin 46,47 unterscheiden. Jedoch sind die erzeugten mit anderen Protokoll integriert werden Daten ergibt 48,49, um die verschiedenen Modifikationen zu beschreiben, und andere Modifikationen Cytosin kürzlich berichtet 50, sollten sie von Interesse sein. Hochwertige Bibliotheken wird angezeigt, wie in 3A-C gezeigt, und einmal für die Sequenzierung zusammengefasst ergibt sich eine Spur wie in 3G (rote Linie), die gleiche molare Beiträge von beiden Bankfraktionen gezeigt. Bibliothek Vorbereitung Ausfall kann von jedem Schritt während des Verfahrens führen. Wenn degradierte DNA verarbeitet sie in Bibliotheken, die nicht in MspI Fragmente in niedrigen CpG Berichterstattung über die in diesem Protokoll beschriebenen Sequenzierung Parameter angereichert sind und somit zur Folge haben. Wenn ein Enzym nicht-funktionell ist oder unbeabsichtigt von einer der Reaktionen auszuschließen, wird das Protokoll nicht zu den gewünschten Bibliothek. Wenn der Ligation reaRésol ineffizient sind Adapter in einer höheren Konzentration als erwartet, und / oder die Primer-Konzentration verwendet wird, eine begrenzende Reagenz für die Endverstärkung Schritten können Bibliotheksfehler auftreten. Überschüssiges Adaptern (als Peaks bei ~ 150 bp Bioanalyzer Ergebnissen gesehen; Figur 3D-F) in der Bibliothek werden auch mit Sequenzierung stören aufgrund des wahllosen Clustering von der Bibliothek und überschüssiges Adapter. Während eine solche Bibliothek kann offensichtlich normal Sequenz, einen signifikanten Teil der Leseoperationen lediglich Adaptersequenzen sein. Wenn überschüssige Adapter werden in einer Bibliothek zu beobachten, ist es am besten, wiederholen Sie die Bibliothek, wenn Vorbereitung Material ist mit optimalen Ausgangsmaterial, um Mengenverhältnisse Adapter. Schließlich, um eine effiziente PCR-Amplifikation der Bibliotheken zu gewährleisten, werden die niedrigeren und höheren Bankfraktionen als getrennte Proben der gesamten Bisulfitumwandlung und PCR Anreicherungsschritten aufrechterhalten. Andernfalls ergibt Differential Effizienz der Amplifikation in der PCR-Reaktion von höheren und niederen Fraktionen (wie in 3G-blaue Spur zu sehen) und das Potential für ungleiche Repräsentation der jeweiligen genomischen Loci in jeder Bibliothek Anteil während der Sequenzierung bedeckt. Der Benutzer kann entscheiden, eine quantitative PCR-Schritt unmittelbar nach der Bisulfit-Konvertierung für die weitere Titration optimale PCR-Zyklen notwendig, um verstärkt die Bibliotheken erzeugt sind. ERRBS Bibliothek Vorbereitung Protokoll hat mehrere Schritte, in denen spezifische Reagenzien empfohlen. Am Ende Reparaturschritt ermöglicht End-Reparatur aller Produkte der CG Überhang, wie die von MspI enzymatische Sterne-Aktivität und geschert DNA in der ursprünglichen DNA-Probe vorhandenen Fragmente ergibt, nicht enthalten, die Verwendung eines Vier-Nucleotid-dNTP-Mix. Dies führt zu einer verbesserten CpG Darstellung der Ergebnisse. An der Ligationsschritt ist es wichtig, eine hohe Konzentration Ligase (2.000.000 Einheiten / ml) und methylierten Adapter, um sicherzustellen, daß die Ligations Reactiauf effiziente und dass die Bisulfitumwandlung nicht den Adapter Voraussetzung für eine genaue Datenabgleich Sequenzen beeinflussen. Bei der PCR-Schritt unter Verwendung einer Polymerase zur Amplifikation Bisulphit-behandelten GC-reichen DNA-Fragmente ist für hohe Spezifität notwendig. Schließlich, um die Beseitigung von überschüssigem Adapter und Primer zu gewährleisten, SPRI Wulst Reinigung (zum Beispiel: Agen AMPure XP) wird vielmehr empfohlen, als Säule basierte Assays für Ligation und PCR Produkt Isolierungen. Um Daten hoher Qualität zu erzeugen, ist es wichtig, um eine effiziente Bisulfitumwandlung gewährleisten. Das vorgestellte Regel bietet dem Benutzer die Möglichkeit, Umwandlungseffizienz vor der Sequenzierung zu bestimmen. Als Alternative kann eine nicht-menschliche DNA wie Lambda DNA als eine interne Kontrolle (Spike-in) verwendet werden. Aufgrund der Unterschiede in der Art, kann diese Art einer Steuerung direkt in Downstream-Sequenzierung enthalten sein (zB wie beschrieben von Yu verwendet, et al. 34). Allerdings, wenn der Spike-in is verwendet wird, kann es nicht verwendet werden, um Umwandlungseffizienz vor der Bibliothek-Sequenzierung zu bestimmen, es sei denn eindeutig verstärkt und unabhängig sequenziert vor Bibliothek Sequenzierung werden. Die festgestellten Umrechnungskurse auf der Methylierungsstatus bei nicht-CpG Seiten. Dies ist möglicherweise nicht für die Verwendung im Zusammenhang mit Hoch Cytosinmethylierung in nicht-CpG-Kontext (zum Beispiel embryonale Stammzellen) und parallel Proben oder andere Mittel zur Bewertung der Umwandlungseffizienz kann für diesen Zweck verwendet werden, geeignet sein. Es gibt einige Einschränkungen an die Adresse, die einzigartig für die Sequenzierung ERRBS Bibliotheken sind. Die ersten drei Basen des Bankfraktionen sequenziert sind nahezu gleichförmig nicht-zufälligen aufgrund der MspI Erkennungsschnittstelle (C ^ CGG; siehe 4B, C). Daraus ergibt sich das Potenzial für erhebliche Datenverluste aufgrund von niedriger Qualität liest aus armen Cluster Lokalisierung trotz der offensichtlich hohen Clusterdichte während der Sequenzierung resultieren. Um dieses Hindernis zu überwinden,sind eine hohe Komplexität Bibliothek in einem unabhängigen Spur (PhiX Kontrolle oder andere Bibliothek Typ) als dedizierter Kontrollspur. Hohe Komplexität Bibliotheken haben Enden, die ein ausgewogenes Verhältnis von A, C, T und G in den ersten vier Basen sequenziert. Geeignete Kontrollspuren sind Bibliotheken wie RNA-seq, ChIP-seq, Sequenzierung ganzer Genome, oder eine Kontrolle durch die Sequenzierung Maschinenhersteller (zB PhiX Steuer v3) angeboten. Wenn sie als eine Kontrollspur für die jeweilige Sequenzierungslauf bezeichnet wird, kann es als Basis für die Matrix Generation, während der ersten vier Basen der Sequenzierung verwendet wird, um Clusteranordnungen detektieren dienen. Je höher die Qualität liest erfasst den mittleren Verbrauch pro CpG-durch zu erhöhen 5.2 (n = 4). Alternativ kann diese technische Schwierigkeit auch mit einem dunklen Sequenzierung Ansatz wie zuvor beschrieben 23 überwunden werden. Andere Sequenzierung Kriterien folgen Standard-Betriebsverfahren gemäß Herstellerprotokolle. Schließlich ist die Deckung pro CpG cHosen für die Datenanalyse wird durch den Benutzer und zum Teil von den biologischen Fragen von Interesse geführt werden. 10x Abdeckung Schwelle bietet eine hohe Abdeckungsanalyse Ansatz ist jedoch diese Schwelle gesenkt sollte, dass die von Interesse sein werden. Eine vollständige Diskussion von ERRBS Datenanalyse geht über den Rahmen dieses Artikels jedoch differentiell methylierte Cytosine und Regionen können mit Open Source Tools 31,51-53 bestimmt werden. Zusätzliche Analyse Überlegungen und Ansätze sind gut beschrieben worden, 54,55, und der Leser wird aufgefordert, die Literatur für die Werkzeuge am besten geeignet, um die geplante Analyse zu suchen. Im Vergleich zu anderen veröffentlichten Verfahren bietet ERRBS eine Vier-Tage-Protokoll, wenn wie beschrieben Erträge hohe Reproduzierbarkeit durchgeführt. Es hat sich im Vergleich zum Goldstandard Massarray EpiTYPER 26 validiert, ist kostengünstig für hohe Reichweite von Daten und ist für verschiedene Eingangsmaterial anpassbarMengen (günstig für klinische Probenverarbeitung und anderen Zelltypen der Niederfrequenz) und Sequenzierungsansätzen. Es bietet Basenpaar-Auflösung bei biologisch relevanten loci und können in integrativen-Analysen mit anderen Techniken Profilierung genomweiten Transkriptionsfaktor-Bindungs, Chromatin-Remodeling, epigenetische Markierungen und andere Cytosin Modifikationen von Interesse. ERRBS Daten Einsatz in solchen Studien können zu einem umfassenden molekularen Ansatz bei und ermöglichen eine hohe Dimensionsanalysen bei der Untersuchung von biologischen Modellen und Krankheit beim Menschen.

DNA Methylierung an Cytosin (5-Methylcytosin) eine epigenetische Filter kritisch in Säugerzellen für eine Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich aber nicht beschränkt auf Prägen, X-Chromosom Inaktivierung, die Entwicklung und die Regulation der Genexpression 1-8 beschränkt. Die Untersuchung der DNA-Methylierungsmuster in malignen und anderen Erkrankungen wurde krankheitsspezifische Muster bestimmt und dazu beigetragen, das Verständnis der Pathogenese der Krankheit und potentielle Biomarker Entdeckungen 9-17. Es gibt viele Protokolle, die das Epigenom für DNA-Methylierungs-Status abfragen. Diese können in der Affinitäts-geteilt werden, Restriktionsenzymbasis und Bisulfitumwandlung basierten Assays, Mikroarray oder Sequenzierplattformen abwärts zu nutzen. Darüber hinaus gibt es einige Protokolle, die diese allgemeinen Kategorien, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Kombinierte Bisulfit Restriktionsanalyse 18 begrenzt und reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung (RRBS 19) zu überbrücken. </p&gt; RRBS wurde ursprünglich von Meissner et al. 19,20 beschrieben. Das Protokoll wurde ein Schritt zur GC-reiche genomischen Regionen, gefolgt von Bisulfit-Sequenzierung, die quantitativen Basenpaarauflösung Daten geführt, die kostengünstig ist 21,22 bereichern. Die GC-reiche Regionen werden durch das MspI (C ^ CGG) Restriktionsenzym gezielte und Cytosin Methylierung durch Bisulfit-Umwandlung von Cytosinen (Deaminierung von unmodifizierten Cytosine in Uracil), gefolgt von Polymerasekettenreaktion (PCR) gelöst. RRBS bedeckt den Großteil der Genpromotoren und CpG-Inseln in einem Bruchteil der für einen gesamten Genoms erforderliche Reihenfolge; jedoch RRBS nur eine begrenzte Verbreitung von CpG-Ufer und anderen intergenen Regionen biologische Relevanz. Mehrere Gruppen haben seit dem ursprünglichen Bericht, der von der Methode und der daraus resultierenden Abdeckung dieser genomischen Regionen 23-25 ​​verbessern veröffentlicht aktualisierte RRBS Protokolle. Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfite Sequflussen (ERRBS) umfasst Bibliothek Vorbereitung Änderungen und eine alternative Datenabgleich Ansatz 26 im Vergleich zu RRBS. ERRBS führte zu einer höheren Anzahl an CpGs in den erzeugten Daten dargestellt wird und eine erhöhte Abdeckung aller genomischen Regionen 26 abgefragt. Dieses Verfahren wurde verwendet, um DNA-Methylierungsmuster in menschlichen Patienten und anderen tierischen Proben 26-30 lösen. Die ERRBS Protokoll beschrieben Angebote Details über alle Schritte für den Abschluss und die Daten wurden unter Verwendung repräsentativer menschlicher DNA erzeugt benötigt (Proben wurden von zuvor berichteten deidentifizierte Patientenproben 31 erhalten und ein CD34 + Knochenmarksprobe von einem normalen menschlichen Spender). Das Protokoll umfasst eine automatische Größenauswahlprozesses, der die Bearbeitungszeit pro Probe reduziert und ermöglicht eine erhöhte Genauigkeit bei der Bibliotheksgrße Auswahl. Das Protokoll kombiniert eine Reihe etablierter molekularbiologischer Techniken. Hochmolekulare DNA wird w verdautit einem Methylierungsunempfindlichen Restriktionsenzym (MspI), gefolgt von End-Reparatur, A-Tailing, und Ligation von methylierter Adapter. Größe Auswahl der GC-reiche Fragmente durch Bisulfit-Konvertierung und PCR-Amplifikation vor der Sequenzierung gefolgt. Bisulfitumwandlung zuvor beschrieben 32 und detaillierte Überprüfung der Datenanalyse und Anwendungen würde den Rahmen dieses Artikels jedoch Empfehlungen und Referenzen sind für die Leser Einsatz enthalten gewesen. Das Protokoll kann über vier Tage durchgeführt werden und ist offen für kleine Eingangs (50 ng oder weniger) Materialmengen. Das Protokoll, wie beschrieben, liefert Ergebnisse mit hoher Deckkraft pro CpG-reichen nicht nur für Differenzmethylierungsstelle und der Region Bestimmungen, sondern auch für epigenetische Polymorphismus Erkennung durch Landan, et al. 33 beschrieben.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1216">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:269px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:153px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:193px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:497px;">URL</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">MspI</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">R0106M</td>
			<td style="width:193px;">100,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/r0106-mspi</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">NEBuffer 2</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B7002S</td>
			<td style="width:193px;">Reaction buffer for MspI enzyme; protocol step 1.2</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7002-nebuffer-2</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:269px;">Phenol solution</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">P4557</td>
			<td style="width:193px;">Equilibrated with 10&#160;mM Tris HCl, pH&#160;8.0; see safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p4557</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:269px;">Chloroform</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">C2432</td>
			<td style="width:193px;">See safety and handling instructions at http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/c2432</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Glycogen</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">G1767</td>
			<td style="width:193px;">19-22 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g1767</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">NaOAc</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td style="width:193px;">3M pH 5.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/s7899</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Ethanol</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E7023</td>
			<td style="width:193px;">200 proof, for molecular biology</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/e7023</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Buffer EB</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">19086</td>
			<td style="width:193px;">10 mM Tris-Cl, pH 8.5</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/buffer-eb</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T1503</td>
			<td style="width:193px;">prepare a 1M pH 8.5 solution</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t1503</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Tris- Ethylenediaminetetraacetic acid (TE)</td>
			<td style="width:153px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">T9285</td>
			<td style="width:193px;">Dilute to 1X buffer solution per manufacturer&#39;s recommendations</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t9285</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">B0202S</td>
			<td style="width:193px;">10X concentration</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b0202-t4-dna-ligase-reaction-buffer</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Deoxynucleotide triphosphate (dNTP) Solution Mix</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">N0447L</td>
			<td style="width:193px;">10 mM each nucleotide</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n0447-deoxynucleotide-dntp-solution-mix</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Polymerase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0203L</td>
			<td style="width:193px;">3,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0203-t4-dna-polymerase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">DNA Polymerase I, Large (Klenow) Fragment</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0210L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0210-dna-polymerase-i-large-klenow-fragment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 Polynucleotide Kinase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0201L</td>
			<td style="width:193px;">10,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0201-t4-polynucleotide-kinase</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28104</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 2.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">2&#39;-deoxyadenosine 5&#39;-triphosphate (dATP)</td>
			<td style="width:153px;">Promega</td>
			<td style="width:104px;">U1201</td>
			<td style="width:193px;">100 mM</td>
			<td style="width:497px;">http://www.promega.com/products/pcr/routine-pcr/deoxynucleotide-triphosphates-_dntps_/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Klenow Fragment (3&#39;&#8594;5&#39; exo-)</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0212L</td>
			<td style="width:193px;">5,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0212-klenow-fragment-3-5-exo</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">MinElute PCR Purification Kit</td>
			<td style="width:153px;">Qiagen</td>
			<td style="width:104px;">28004</td>
			<td style="width:193px;">Used for DNA product purification in protocol step 3.3</td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/minelute-pcr-purification-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">T4 DNA Ligase</td>
			<td style="width:153px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:104px;">M0202M</td>
			<td style="width:193px;">2,000,000 units/ml</td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/m0202-t4-dna-ligase</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Methylation Adapter Oligo Kit</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td style="width:104px;">ME-100-0010</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:269px;">Agencourt AMPure XP</td>
			<td style="width:153px;">Beckman Coulter</td>
			<td style="width:104px;">A63881</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol sections that implement magnetic bead purification steps (steps 4.3 and 8.2). Equilibrate to room temperature before use</td>
			<td style="width:497px;">https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/nucleic-acid-sample-preparation/agencourt-ampure-xp-pcr-purification/index.htm?i=A63882#2/10//0/25/1/0/asc/2/A63882///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">Pippin Prep Gel Cassettes, 2% Agarose, dye-free</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td style="width:104px;">CDF2010</td>
			<td style="width:193px;">with internal standards</td>
			<td style="width:497px;">http://store.sagescience.com/s.nl/it.A/id.1036/.f</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Certified Low Range Ultra Agarose</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>161-3106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.bio-rad.com/en-us/sku/161-3106-certified-low-range-ultra-agarose</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T4415</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t4415</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1510</td>
			<td style="width:193px;">10 mg/ml</td>
			<td style="width:497px;">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e1510</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3236S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3236-50-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">100 bp DNA Ladder</td>
			<td>NEB</td>
			<td>N3231S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/n3231-100-bp-dna-ladder</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel Loading Dye, Orange (6X)</td>
			<td>NEB</td>
			<td>B7022S</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.neb.com/products/b7022-gel-loading-dye-orange-6x</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scalpel&#160;Blade&#160;No.&#160;11</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>3120030</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.fishersci.com/ecomm/servlet/fsproductdetail?position=content&#38;tab=Items&#38;productId=11876776</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28704</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.qiagen.com/products/catalog/sample-technologies/dna-sample-technologies/dna-cleanup/qiaquick-gel-extraction-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5001</td>
			<td style="width:193px;">Used in protocol step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-kits/ez-dna-methylation-kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">EZ DNA Methylation-Lightning Kit</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:104px;">D5030</td>
			<td style="width:193px;">Alternative for step 6.2</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/bisulfite-conversion/ez-dna-methylation-lightning-kit</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:269px;">Universal Methylated Human DNA Standard</td>
			<td style="width:153px;">Zymo Research</td>
			<td>D5011</td>
			<td style="width:193px;">Used as bisulfite conversion control</td>
			<td style="width:497px;">http://www.zymoresearch.com/epigenetics/dna-methylation/methylated-dna-standards/universal-methylated-human-dna-standard</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">FastStart High Fidelity PCR System</td>
			<td style="width:153px;">Roche</td>
			<td style="width:104px;">03553426001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://lifescience.roche.com/shop/products/faststart-high-fidelity-pcr-system#tab-0</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:269px;">Qubit dsDNA High Sensitivity Assay Kit</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:104px;">Q32854</td>
			<td style="width:193px;">A fluorescence-based DNA quantitation assay; used in protocol steps 1.1, 9.1 and 10.1</td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32854</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">DynaMag-2 Magnet</td>
			<td style="width:153px;">Life Technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12321D</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td style="width:104px;">5067-4626</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-DNA-RNA-Kits/High-Sensitivity-DNA-Analysis-Kits/?cid=AG-PT-105&#38;tabId=AG-PR-1069</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:269px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:153px;">Agilent Technologies</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106&#38;tabId=AG-PR-1001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">PhiX Control v3</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td>FC-110-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/phix_control_v3.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">HiSeq 2500</td>
			<td style="width:153px;">Illumina</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/systems/hiseq_2500_1500.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Pippin Prep</td>
			<td style="width:153px;">Sage Science</td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.sagescience.com/products/pippin-prep/</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Qubit 2.0 Fluorometer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32872</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/Q32872</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">TruSeq SR Cluster Kit v3-cBot-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>GD-401-3001</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sr_cluster_kit_v3-cbot-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TruSeq SBS Kit v3-HS</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-401-3002</td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;">http://www.illumina.com/products/truseq_sbs_kit_v3-hs.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;">TruSeq RNA Sample prep</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>RS-122-2001</td>
			<td style="width:193px;">Barcoded adapters used for multiplexing libraries; See Supplemental file for multiplexing protocol</td>
			<td style="width:497px;">http:/http://www.illumina.com/products/truseq-rna-access-kit.ilmn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex Mixer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Block Heater</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Thermal Cycler</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Water Bath</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel electrophoresis system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Electrophoresis power supply</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">Gel doc</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:269px;">UV or blue light transilluminator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:193px;"></td>
			<td style="width:497px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced reduced representation bisulfite sequencing for assessment of dna methylation at base pair resolution

DNA-Methylierungsmuster Mapping ist stark in normalen und erkrankten Geweben untersucht. Eine Vielzahl von Methoden wurden etabliert, um die Cytosin-Methylierungsmustern in Zellen abzufragen. Reduzierte Darstellung des gesamten Genoms Bisulfit-Sequenzierung wurde entwickelt, um quantitative Basenpaar Auflösung Cytosin-Methylierungsmuster bei GC-reichen genomischen Loci zu erkennen. Dies wird durch die Kombination der Verwendung von einem Restriktionsenzym, gefolgt von Bisulfitumwandlung bewerkstelligt. Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung (ERRBS) erhöht die biologisch relevanten genomischen Loci bedeckt und wurde genutzt, um Cytosin-Methylierung in DNA aus Mensch, Maus und anderen Organismen zu profilieren. ERRBS initiiert mit dem Restriktionsenzym Verdauung von DNA, um niedermolekulare Bruchstücke für die Verwendung in der Bibliothek Vorbereitung erzeugen. Diese Fragmente werden zu Standardbibliothek Bau der nächsten Generation Sequenzierung unterzogen. Bisulfit-Umwandlung von nicht methylierten Cytosine vor der endgültigen amplificatiauf Schritt ermöglicht die quantitative Basisauflösung von Cytosin-Methylierung Niveaus in gedeckten genomischen Loci. Das Protokoll kann innerhalb von vier Tagen abgeschlossen sein. Trotz geringer Komplexität in den ersten drei Basen sequenziert, ERRBS Bibliotheken liefern hohe Datenqualität bei Verwendung eines vorgesehenen Ablaufsteuerung Spur. Mapping und Bioinformatik-Analyse wird dann durchgeführt und liefert Ergebnisse, die leicht mit einer Vielzahl von genomweite Plattformen integriert werden kann. ERRBS können kleine Mengen der Vorleistungsgüter nutzen, so dass es möglich ist, den menschlichen klinischen Proben und anwendbar in einer Reihe von Forschungsanwendungen verarbeiten. Das produzierte Video zeigt kritischen Schritte des ERRBS Protokoll.

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Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Verbesserte Reduzierte Darstellung Bisulfit-Sequenzierung für die Bewertung der DNA-Methylierung bei Basenpaar Auflösung

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...

enhanced-reduced-representation-bisulfite-sequencing-for-assessment

Research

JoVE Journal

Biology

25.2K Aufrufe.  Weill Cornell Medical College. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

Serie: Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

In-vivo-Imaging von Intact Drosophila-Larven auf subzellulärer Auflösung

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

Forschung

Biologie

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA methyltransferases is viable, thus providing a system to study how loss of DNA methylation in a genome affects growth and development. Imprinting refers to differential expression of maternal and paternal alleles and plays an important role in reproduction development in both mammal and plants. DNA methylation is critical for determining whether the maternal or paternal alleles of an imprinted gene is expressed or silenced. In flowering plants, there is a double fertilization event in reproduction: one sperm cell fertilizes the egg cell to form embryo and a second sperm fuses with the central cell to give rise to endosperm. Endosperm is the tissue where imprinting occurs in plants. MEDEA, a SET domain Polycomb group gene, and FWA, a transcription factor regulating flowering, are the first two genes shown to be imprinted in endosperm and their expression is controlled by DNA methylation and demethylation in plants. In order to determine imprinting status of a gene and methylation pattern in endosperm, we need to be able to isolate endosperm first. Since seed is tiny in Arabidopsis, it remains challenging to isolate Arabidopsis endosperm and examine its methylation. In this video protocol, we report how to conduct a genetic cross, to isolate endosperm tissue from seeds, and to determine the methylation status by bisulfite sequencing.

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Imprinting is a phenomenon in plant and mammal reproduction. DNA methylation plays an important role in mechanisms of imprinting. Isolating endosperm and determining methylation status of imprinted genes in Arabidopsis can be difficult. In this protocol, we describe how to isolate endosperm and determine methylation by bisulfite sequencing.

Bestimmung der DNA-Methylierung von geprägten Genen in Arabidopsis Endosperm

Arabidopsis thaliana is an excellent model organism for studying epigenetic mechanisms. One of the reasons is the loss-of-function null mutant of DNA ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

DNA-Methylierung: Bisulfit Modifikation und Analyse

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified and/or determined via proteomic approaches, and/or immunoblotting with methyl-arginine specific antibodies. However, these techniques sometimes can be misleading and often provide false positive results. Most importantly, these techniques cannot provide direct evidence in support of the PRMT substrate specificity. In vitro methylation assays, on the other hand, are useful biochemical assays, which are sensitive, and consistently reveal if the identified proteins are indeed PRMT substrates. A typical in vitro methylation assay includes purified, active PRMTs, purified substrate and a radioisotope labeled methyl donor (S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine). Here we describe a step-by-step protocol to isolate catalytically active PRMT1, a ubiquitously expressed PRMT family member. The methyl transferase activities of the purified PRMT1 were later tested on Ras-GTPase activating protein binding protein 1 (G3BP1), a known PRMT substrate, in the presence of S-adenosyl-L-[methyl-3H] methionine as the methyl donor. This protocol can be employed not only for establishing the methylation status of novel physiological PRMT1 substrates, but also for understanding the basic mechanism of protein arginine methylation.

In vitro Methylation Assay to Study Protein Arginine Methylation

Protein arginine methylation, catalyzed by a class of enzymes viz., protein arginine methyl transferases (PRMTs), is the process of enzymatic addition of methyl group(s) to arginines within proteins. The in vitro methylation assay is the most dependable tool for assessing the methylation status of known or novel PRMT substrates.

In-vitro-Test zur Methylierung Protein-Arginin-Methylierung Studieren

Protein arginine methylation is one of the most abundant post-translational modifications in the nucleus. Protein arginine methylation can be identified ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Gezielte DNA Methylierungsanalyse von Next-Generation-Sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplification, Next-Generation-Sequenzierung und genomischer DNA Mapping von Retrovirale Integration Seiten

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

The ChIP-exo Method: Identifying Protein-DNA Interactions with Near Base Pair Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA interactions. ChIP coupled to high throughput sequencing (ChIP-seq) is commonly used to determine the genomic location of proteins that interact with chromatin. However, ChIP-seq is hampered by relatively low mapping resolution of several hundred base pairs and high background signal. The ChIP-exo method is a refined version of ChIP-seq that substantially improves upon both resolution and noise. The key distinction of the ChIP-exo methodology is the incorporation of lambda exonuclease digestion in the library preparation workflow to effectively footprint the left and right 5&#39; DNA borders of the protein-DNA crosslink site. The ChIP-exo libraries are then subjected to high throughput sequencing. The resulting data can be leveraged to provide unique and ultra-high resolution insights into the functional organization of the genome. Here, we describe the ChIP-exo method that we have optimized and streamlined for mammalian systems and next-generation sequencing-by-synthesis platform.

Here, we present a protocol to achieve near base pair resolution of protein-DNA interactions. This is obtained by exonuclease treatment of DNA fragments selectively enriched by chromatin immunoprecipitation (ChIP-exo) followed by high throughput sequencing.

Der Chip-exo-Methode: Ermittlung von Protein-DNA-Wechselwirkungen mit Near-Basenpaar Precision

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is an indispensable tool in the fields of epigenetics and gene regulation that isolates specific protein-DNA ...

Generating Transposon Insertion Libraries in Gram-Negative Bacteria for High-Throughput Sequencing

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways that contribute to bacterial fitness under a wide range of environmental conditions. Tn-seq applications are extensive and have not only enabled examination of genotype-phenotype relationships at an organism level but also at the population, community and systems levels. Gram-negative bacteria are highly associated with antimicrobial resistance phenotypes, which has increased incidents of antibiotic treatment failure. Antimicrobial resistance is defined as bacterial growth in the presence of otherwise lethal antibiotics. The &#8220;last-line&#8221; antimicrobial colistin is used to treat Gram-negative bacterial infections. However, several Gram-negative pathogens, including Acinetobacter baumannii can develop colistin resistance through a range of molecular mechanisms, some of which were characterized using Tn-seq. Furthermore, signal transduction pathways that regulate colistin resistance vary within Gram-negative bacteria. Here we propose an efficient method of transposon mutagenesis in A. baumannii that streamlines generation of a saturating transposon insertion library and amplicon library construction by eliminating the need for restriction enzymes, adapter ligation, and gel purification. The methods described herein will enable in-depth analysis of molecular determinants that contribute to A. baumannii fitness when challenged with colistin. The protocol is also applicable to other Gram-negative ESKAPE pathogens, which are primarily associated with drug resistant hospital-acquired infections.

We describe a method to generate saturating transposon mutant libraries in Gram-negative bacteria and subsequent preparation of DNA amplicon libraries for high-throughput sequencing. As an example, we focus on the ESKAPE pathogen, Acinetobacter baumannii, but this protocol is amenable to a wide range of Gram-negative organisms.

Generieren von Transposon-Einfügungsbibliotheken in gramnegativen Bakterien für die Sequenzierung mit hohem Durchsatz

Transposon sequencing (Tn-seq) is a powerful method that combines transposon mutagenesis and massive parallel sequencing to identify genes and pathways ...