Diese Forschung wird durch Mittel aus dem Programm Intramural des NIH unterstützt.

I. Zellpräparation <ol><li> Die Zellen werden bis zur Konfluenz in DMEM mit 10% FBS etwa ein 80% konfluenten 225 cm 3-Kolben für jeweils 5 Mäusen implantiert werden gezüchtet. </li><li> Saugen Sie Medien aus der Zellen, waschen mit 10 ml PBS ohne Calcium oder Magnesium. PBS absaugen off-Zellen. </li><li> Trypsinieren Zellen mit 3 ml Trypsin, 10-15 Min. warten, und neutralisieren das Trypsin mit 15 ml Medium. </li><li> Pipettieren Sie alle Zellen und Medien in einem 50 ml konischen. Zwei große Flaschen passen in ein 50 ml-Erlenmeyerkolben. </li><li> Spin-Zellen bei 1600 rpm für 7 min bei 4 ° C Überstand vollständig absaugen. Die Zellen in 10 ml kaltem PBS, und spülen Zellen durch vorsichtiges Auf-und Abpipettieren. Stellen Sie sicher, das Zellpellet einheitlich mit der PBS gemischt. Die Suspension soll es wolkig. </li><li> Zu dieser Zeit eine Zellzahl erfolgt mit Hilfe eines Coulter-Zähler. Die Zellen werden erneut bei 1600 rpm für 7 min bei 4 ° C zentrifugiert </li><li> Nach dem 2. Zentrifugation der Zellen, wiePirat aller PBS resuspendieren und in 1 ml PBS. </li><li> Die Zellen werden in der 1 ml PBS bei 3000 UpM für 10 min bei 4 ° C zentrifugiert Die PBS abgesaugt wird, und PBS zugegeben, um die Endkonzentration bis 1x10 6 einzustellen pro 5 ul für U87-Zellen, können andere Zelllinien erfordern eine unterschiedliche Anzahl und Konzentration der Zellen für eine optimale Tumorwachstum. </li><li> Nachdem die letzte Volumen und Konzentration erhalten die Zellen werden auf Eis in einem Eppendorf-Röhrchen aufbewahrt. </li></ol> II. Xenograft <ol class="ualpha"><li> Vorbereiten der Maus <ol><li> Die Mäuse werden betäubt mit einer Injektion Mischung aus Ketamin / Xylazin / Saline. Die Mischung ist 120 mg / kg Ketamin, 16 mg / kg Rompun und Saline. Die Mäuse werden einzeln gegeben und gewogen 0,1 ml pro 10 g bezogen auf ihr Gewicht. Die Narkose wird mit 26G Nadel befestigt, um 1 ml Spritze IP gegeben. Es dauert ca. 15 min für die Mäuse auf eine schlafende Phase für keine Schmerzreaktion zu erreichen. Sie können die Schmerzreaktion derMäuse durch Kneifen ihre Fußsohle. </li><li> Nachdem die Maus ist voll narkotisiert, wird Augensalbe verabreicht, um ihre Augen, um sie vor dem Austrocknen zu verhindern. </li><li> Die Maus wird auf dem Bett des stereotaktischen mit den vorderen oberen Zähne in die Kerbe auf der Mund-Bar platziert. Das Bett wird dann in der stereotaktischen angeordnet. </li><li> Der Nasenschutz wird über die Maus die Nase gesetzt, um die Bewegung des Kopfes zu verhindern, und das Ohr Bars werden sanft in die Gehörgänge der Mäuse zu platzieren. Achten Sie darauf, entweder die Platzierung der Nase oder Ohr-Bar Bars zu stramm zu tun, wie der Schädel kann brechen und / oder verhindern, dass die Maus von der Atmung. </li><li> Stellen Sie sicher, dass der Kopf der Maus auf gleicher Höhe mit den Markierungen auf der stereotaktischen ist hilfreich, während dieses Prozesses. </li><li> Zur Vorbereitung der Maus, Alkohol und Jod providine wird großzügig auf dem Kopf der Maus abwechselnd für insgesamt 3 Anwendung von Alkohol und 3 Anwendungen von Jod angewendet. Eine letzte Anwendung eines Alkohol-Pad mit 70% wird angewendetder Kopf. </li></ol></li><li> Chirurgische Verfahren <ol><li> Alle Geräte der Verfahren sollte entweder durch Autoklavieren oder Einweichen Instrumente in 70% Ethanol vor Beginn des Verfahrens sterilisiert werden. </li><li> Ein Schnitt ist oben auf dem Schädel hinter dem rechten Auge diagonal zurück auf die linke hintere des Schädels gemacht. Der Schnitt sollte etwa 10 mm bis 15 mm lang sein. </li><li> Mit einem Q-Tip, langsam trennen den Einschnitt, den Schädel freizulegen, und wischen Sie die Membran, die zwischen dem Schädel und der Haut ist. Verwenden Sie ein Q-Tip, um das Blut beflecken und für starke Blutungen zu beobachten. </li><li> Setzen Sie die Oberseite des Schädels, um die Bregma visualisieren. Mit dem Hamilton-Spritze Punkt, positionieren Sie es über das Bregma. Die richtige Position des Lochs im Schädel gebohrt werden soll 2 mm rechts und 1 mm anterior von Bregma (Abbildung 2). Ein Chirurg Filzspitze Marker, die gekauft sterilen wird, wird verwendet, um die Position des zu bohrenden Lochs markieren. Bitte beachten Sie, dass das Loch in der Nähe ist mit der ein sichterior Nahtlinie. </li><li> Anschließend bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel an der markierten Stelle mit der Spitze einer 22G-Nadel in einem Stift Vase oder Fed durch eine 18G Nadel. </li><li> Laden Sie die 10 pl Glas Hamilton-Spritze mit 5 ul der Zellen. Der Hamilton-Spritze ist 10 ul mit einem stumpfen 30G bis 33G fester Nadel attached to it. Achten Sie darauf, um die Zellen vor dem Laden zu mischen, entweder durch Pipettieren ihnen oder mit einer 1 ml Spritze mit einer 25G Kanüle. Nach dem Hamilton-Spritze geladen wird, setzen Sie ihn wieder in den Arm, um es zu einer Linie mit dem Loch in den Schädel. </li><li> Senken der bunt Ende der Nadel auf die Oberfläche des Schädels, sobald die Nadel Höhe der Schädeldecke; Senken der Nadel, bis sie in einer Tiefe von 3 mm unterhalb der Oberfläche des Schädels. </li><li> Nachdem die Nadel abgesenkt wird, so ist dort für 2 Minuten keine schweres Trauma von der Nadel, die das Gehirn zu vermeiden. Implantation der Zellen ist mit einer Rate von 1 ul pro Minute für insgesamt 6-8 Minuten, achten Sie auf jeden backflow. Nachdem die letzte der Zellen implantiert worden sind, lassen Sie die Nadel an Ort und Stelle für weitere 2 Minuten, damit alle Zellen, sich einzugewöhnen </li><li> Entfernen Sie die Nadel aus dem Gehirn, und reinigen Sie das Loch mit einem Q-Tip. Fahren Sie mit der Nadel und Spritze mit 50% Actone, 100% EtOH und PBS, 3x in jeder Lösung und in dieser Reihenfolge zu reinigen. </li><li> Die Haut auf dem Schädel bereit ist, an dieser Stelle vernäht werden. Mit 5-0 PBS schließen Sie den Schnitt mit etwa 3 Stiche. </li><li> Lassen Sie die Maus zum Aufwachen auf einem Heizkissen, und erneut anwenden, Augensalbe, wenn nötig. Die Maus kann an den Käfig zurückgebracht werden, nachdem es auf Bewegungen auf seiner eigenen Shows (z. B. durch Anheben des Kopfes oder Bewegen der Schultern). </li></ol></li></ol> III. Die Behandlung der IC-Implantat durch Strahlung und Drug <ol class="ualpha"><li> Bestrahlung <ol><li> Abhängig von der Zell-Linie, kann die Behandlung der Mäuse Platz 5 bis 7 Tagen nach der Implantation zu nehmen. Unsere Abteilung nutzt einen Orthovolt Strahlentherapie-Einheit für die Strahlung behandelnment. </li><li> Imaging wie BLI (Biolumineszenz-Bildgebung), MRT oder CT kann verwendet werden, um den Tumor vor der Randomisierung (Abbildung 3A) zu visualisieren. </li><li> Die Mäuse werden betäubt mit der Ketamin / Xylazin / Kochsalzlösung Cocktail wie zuvor, und Augensalbe, um ihre Augen aufgetragen. </li><li> Die Mäuse werden in einem speziell angefertigten Schablone Strahlung, die wie eine Torte Rad, in der die Köpfe der Mäuse zeigen in Richtung der Mitte konfiguriert positioniert ist. Die Körper der Mäuse werden von der Strahlung mit Blei abgeschirmt. </li><li> Die medikamentöse Behandlung kann entweder vor oder Strahlung durch verschiedene Lieferwege, dh SQ, IP-und IV angegeben. </li></ol></li></ol> IV. Ergebnisse Die Maus sollte aufwachen aus dem Verfahren innerhalb von 45-60 Minuten nach der Narkose Injektion. Wenn die Maus schwer Aufwachen hat sich nach dem Eingriff und die Zeit ist 1 überschritten ½ Stunde nach dem Eingriff kann die Maus nicht erholen und Euthanasie kann eine wirksame Alternative sein. Wenn there ist starke Blutungen oder der Schädel wird an jedem Punkt während des Verfahrens Euthanasie geknackt wird empfohlen. Wenn alles gut geht und je nach Zelllinie, sollte ein Tumor bilden, beginnen innerhalb von 2-4 Wochen nach dem Eingriff erfolgen hat. Bei der Verwendung von intrakraniellen Xenograft-Modellen, wird die therapeutische Wirksamkeit in der Regel als das Überleben nach der Implantation 5 gemessen. Da dies jedoch eine IC-Modell Anzeichen und Symptome wird vor Tod eintreten. Einige der körperlichen Zeichen der Maus zeigen können sind eine gekrümmte Haltung, Verlust von Körpergewicht, und Nichterwerbstätigkeit. Einige der neurologischen Symptome können Krampfanfälle, Kopfschiefhaltung und Verlust des Gleichgewichts sein. 3B zeigt eine HE-Färbung eines Tumors bei Mortalität. Eine Kaplan-Meier-Plot wird verwendet, um die Daten (Bild 4) zu bewerten. Die Anzahl der Tage des Überlebens bei 50% berechnet und verglichen mit der Kontrollgruppe. Wenn die Kombination Gruppe lebte länger als die Addition der einzelnen Strahlung und Drogen Arme die Kombination erfolgreich war. <img alt = &quot;Abbildung 1&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/3397/3397fig1.jpg&quot; /&gt; Abbildung 1. Die Stölting stereotaktischen Geräten. <img alt="2" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig2.jpg" /> 2. Eine schematische Darstellung der Position der Bohrung in der Maus Schädel. <img alt="3A" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3A.jpg" /> 3A. BLI Bildgebung nach Implantation GBM. <img alt="3B" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig3B.jpg" /> 3B. H und E der GBM Tumor auf die Sterblichkeit. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3397/3397fig4.jpg" /> Abbildung 4. Ergebnisse der U87 IC Implantate mit PARP-Inhibitor 7 Tage nach der Operation injiziert.

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	<li>Bleau, A. M., Holland, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trapping+the+mouse+genome+to+hunt+human+alternations.">Trapping the mouse genome to hunt human alternations.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 104, 7737-7738 (2007).</li><li>McGrady, B. J., McCormick, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+murine+model+of+intracranial+invasion:+morphological+observations+on+central+nervous+system+invasion+by+melanoma+cells.">A murine model of intracranial invasion: morphological observations on central nervous system invasion by melanoma cells.</a> Clin. Exp. Metastasis. 10, 387-393 (1992).</li><li>Fei, X., Zhang, Q., Dong, J., Diao, y., Wang, Z., Li, R., Wu, Z., Wang, A., Lan, Q., Zhang, S., Huang, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+clinically+relevant+orthotopic+xenograft+mouse+model+of+metastatic+lung+cancer+and+glioblastoma+through+surgical+tumor+tissues+injection+with+trocar.">Development of clinically relevant orthotopic xenograft mouse model of metastatic lung cancer and glioblastoma through surgical tumor tissues injection with trocar.</a> Journal of Experimental &#38; Clinical Cancer Research. 29, 84-84 (2010).</li><li>Fujita, M., Zhu, X., Sasaki, K., Ueda, R., Low, K., Pollack, I., Okada, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+STAT3+Promotes+the+Efficacy+of+Adoptive+Transfer+Therapy+Using+Type-1+CTLs+by+Modulation+of+the+Immunological+Microenvironment+in+a+Murine+Intracranial+Glioma.">Inhibition of STAT3 Promotes the Efficacy of Adoptive Transfer Therapy Using Type-1 CTLs by Modulation of the Immunological Microenvironment in a Murine Intracranial Glioma.</a> J. Immunol. 180, 2089-2098 (2008).</li><li>Candolfi, M., Curtin, J. F., Nichols, W. S., Muhammad, A. K. M. .. . G., King, G., Pluhar, G. D., McNiel, G. E., Ohlfest, E. A., Freese, J. R., Moore, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology:+neuropathlogical+characterization+and+tumor+progression.">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathlogical characterization and tumor progression.</a> J. 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Neuroimmunol. 182, 63-72 (2007).</li><li>Martens, T., Laabs, Y., Günther, H., Kemming, D., Zhu, Z., Witte, L., Hagel, C., Westphal, M., Lamszus, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Glioblastoma+Growth+in+a+Highly+Invasive+Nude+Mouse+Model+Can+Be+Achieved+by+Targeting+Epidermal+Growth+Factor+Receptor+but+not+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2.">Inhibition of Glioblastoma Growth in a Highly Invasive Nude Mouse Model Can Be Achieved by Targeting Epidermal Growth Factor Receptor but not Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2.</a> Clin. Cancer Res. 14, 5447-5458 (2008).</li><li>Purow, B., Schiff, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+genetics+of+glioblastoma:+are+we+reaching+critical+mass.">Advances in the genetics of glioblastoma: are we reaching critical mass.</a> Nat. Rev. Neurol. 5, 419-426 (2009).</li></ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Maligne Gliome, wie zB Glioblastoma multiforme, stellen die häufigsten primären Hirntumoren und haben eine schlechte Prognose 4. Die Überlebenschancen von Patienten durch GBM betroffen praktisch unverändert geblieben ist während des letzten Jahrzehnts (dh 9-12 Monate nach der Diagnose) trotz der Fortschritte in der Chirurgie, Bestrahlung und Chemotherapie 5. Die Merkmale eines geeigneten Modells für das Studium der Gliom-Behandlung sollte eine reproduzierbare Tumorlokalisation und Wachstum de...

<table border="1"><tbody><tr><td> Lab Standard Stereotaktische Instrutment </td><td> Maus und Ratte Stoelting Adapter </td></tr><tr><td> Betadine </td><td> 100% EtOH </td></tr><tr><td> 70% EtOH </td><td> 50% Aceton </td></tr><tr><td> 6 &quot;Q-Tips </td><td> Alkoholtupfer </td></tr><tr><td> Hamilton-Spritze 80008 </td><td> Ethicon 5-0 PD </td></tr><tr><td> 1701 SN 31-33G / 1 &quot;/ PT3 Nadel </td><td> 1 ml-Spritzen </td></tr><tr><td> 25G Nadeln </td><td> Heizkissen </td></tr><tr><td> Künstliche Tränen-Salbe </td><td> Sehr feine Spitze Permanentmarker </td></tr></tbody></table>

combination radiotherapy in an orthotopic mouse brain tumor model

Glioblastoma multiforme (GBM) ist die häufigste und aggressivste erwachsenen primären Hirntumoren ein. In den letzten Jahren hat es erhebliche Fortschritte im Verständnis von den Mechanismen der Tumorinvasion und direkter intrazerebraler Inokulation des Tumors bietet die Möglichkeit der Beobachtung der invasiven Verfahren in einem physiologisch geeigneten Umgebung 2. Soweit menschlichen Hirntumoren betrifft, so sind die derzeit verfügbaren Modelle orthotopen entweder durch stereotaktische Injektion von Zellsuspensionen oder Implantation eines festen Tumors Stück durch ein kompliziertes Verfahren Kraniotomie 3 hergestellt. In unserer Technik ernten Zellen aus Gewebekulturen, um eine Zellsuspension verwendet, um direkt in das Gehirn implantiert zu schaffen. Die Dauer der Operation beträgt etwa 30 Minuten, und die Maus muss in einem konstanten chirurgischen Ebene liegen, eine injizierbare Anästhetika. Die Maus wird in einen stereotaktischen Bohrlehre von Stoetling (Abbildung 1) aus angeordnet. Achterner das Operationsgebiet wird gereinigt und vorbereitet, wird ein Einschnitt vorgenommen, und die Bregma befindet, um die Position der Kraniotomie bestimmen. Die Lage der Kraniotomie ist 2 mm nach rechts und 1 mm rostral zu Bregma. Die Tiefe von 3 mm von der Oberfläche des Schädels und die Zellen werden mit einer Rate von 2 ul alle 2 Minuten injiziert. Die Haut wird mit 5-0 PDS genäht, und die Maus darf aufwachen auf einem Heizkissen. Aus unserer Erfahrung, abhängig von der Zell-Linie, kann die Behandlung Platz 7 bis 10 Tagen nach der Operation. Drug Delivery ist abhängig von der Arzneimittel-Zusammensetzung. Für Bestrahlung die Mäuse sind anästhesiert, und in einem speziell angefertigten Vorrichtungsbau. Blei deckt der Maus Körpers und setzt nur das Gehirn der Maus. Das Studium der Tumorentstehung und die Evaluierung neuer Therapien für GBM erfordern genaue und reproduzierbare Hirntumor Tiermodellen. So verwenden wir diese orthotopen Gehirn Modell, um die Interaktion der Mikroumgebung des Gehirns und des Tumors zu studieren, um das zu testen aftlichess von verschiedenen therapeutischen Wirkstoffen mit und ohne Bestrahlung.

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Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

Kombination Strahlentherapie in einem orthotopen Maus Brain Tumor-Modell

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

combination-radiotherapy-in-an-orthotopic-mouse-brain-tumor-model

Research

JoVE Journal

Medicine

16.3K Aufrufe.  National Cancer Institute. Der Zweck dieses Artikels ist es, die Verwendung einer orthotopen Glioblastom-Modell für die Radiochemotherapie Studien beschreiben. Dieser Artikel wird jedoch Zellprozessierung gehen, Implantieren, Strahlentherapie und der Maus mit Hilfe eines intrakraniellen Modell.

Serie: Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Einem orthotopen Modell des Murine Blasenkrebs

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Forschung

Medizin

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

An Orthotopic Bladder Tumor Model and the Evaluation of Intravesical saRNA Treatment

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder tumor model. The mouse model is established by urethral catheterization under inhaled general anesthetic. Chemical burn is then introduced to the bladder mucosa using intravesical silver nitrate solution to disrupt the bladder glycosaminoglycan layer and allows cells to attach. Following several washes with sterile water, human bladder cancer KU-7-luc2-GFP cells are instilled through the catheter into the bladder to dwell for 2 hours. Subsequent growth of bladder tumors is confirmed and monitored by in vivo bladder ultrasound and bioluminescent imaging. The tumors are then treated intravesically with saRNA formulated in lipid nanoparticles (LNPs). Tumor growth is monitored with ultrasound and bioluminescence. All steps of this procedure are demonstrated in the accompanying video.

Establishing an orthotopic bladder tumor model to evaluate antitumor effects of intravesically delivered saRNA and monitoring tumor growth by ultrasound and bioluminescent imaging.

Einem orthotopen Blasentumor Modell und der Auswertung der intravesikalen Behandlung SÄRNA

We present a novel method for treating bladder cancer with intravesically delivered small activating RNA (saRNA) in an orthotopic xenograft mouse bladder ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Ein orthotopen Mausmodell des Anaplastic Schilddrüsenkarzinom

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Ein orthotopen Blasenkrebs-Modell für Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Ein orthotopen Mausmodell der menschlichen Prostatakrebs-Metastasen

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology rely on the injection of a suspension of glioma cells into the brain parenchyma following incision of the dura-mater. Whereas the cells have to be injected superficially to be accessible to intravital two-photon microscopy, superficial injections fail to recapitulate the physiopathological conditions. Indeed, escaping through the injection tract most tumor cells reach the extra-dural space where they expand abnormally fast in absence of mechanical constraints from the parenchyma.
Our improvements consist not only in focally implanting a glioma spheroid rather than injecting a suspension of glioma cells in the superficial layers of the cerebral cortex but also in clogging the injection site by a cross-linked dextran gel hemi-bead that is glued to the surrounding parenchyma and sealed to dura-mater with cyanoacrylate. Altogether these measures enforce the physiological expansion and infiltration of the tumor cells inside the brain parenchyma. Craniotomy was finally closed with a glass window cemented to the skull to allow chronic imaging over weeks in absence of scar tissue development.
Taking advantage of fluorescent transgenic animals grafted with fluorescent tumor cells we have shown that the dynamics of interactions occurring between glioma cells, neurons (e.g. Thy1-CFP mice) and vasculature (highlighted by an intravenous injection of a fluorescent dye) can be visualized by intravital two-photon microscopy during the progression of the disease.
The possibility to image a tumor at microscopic resolution in a minimally compromised cerebral environment represents an improvement of current GBM animal models which should benefit the field of neuro-oncology and drug testing.

We have established a cortical orthotopic glioblastoma model in mice for intravital two-photon microscopy that recapitulates the biophysical constraints normally at play during the growth of the tumor. A chronic glass window replacing the skull above the tumor enables the follow-up of the tumor progression over time by two-photon microscopy.

Ein Orthotopische Glioblastoma Maus-Modell Pflege Gehirn Parenchymale Körperliche Einschränkungen und geeignet für Zwei-Photonen-Intravitalmikroskopie

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

Tumor Treating Field Therapy in Combination with Bevacizumab for the Treatment of Recurrent Glioblastoma

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA approved in April 2011 for the treatment of patients 22 years or older with rGBM. The device delivers alternating electric fields and is programmed to ensure maximal tumor cell kill1.
Glioblastoma is the most common type of glioma and has an estimated incidence of approximately 10,000 new cases per year in the United States alone2. This tumor is particularly resistant to treatment and is uniformly fatal especially in the recurrent setting3-5. Prior to the approval of the TTF System, the only FDA approved treatment for rGBM was bevacizumab6. Bevacizumab is a humanized monoclonal antibody targeted against the vascular endothelial growth factor (VEGF) protein that drives tumor angiogenesis7. By blocking the VEGF pathway, bevacizumab can result in a significant radiographic response (pseudoresponse), improve progression free survival and reduce corticosteroid requirements in rGBM patients8,9. Bevacizumab however failed to prolong overall survival in a recent phase III trial26. A pivotal phase III trial (EF-11) demonstrated comparable overall survival between physicians&#8217; choice chemotherapy and TTF Therapy but better quality of life were observed in the TTF arm10.
There is currently an unmet need to develop novel approaches designed to prolong overall survival and/or improve quality of life in this unfortunate patient population. One appealing approach would be to combine the two currently approved treatment modalities namely bevacizumab and TTF Therapy. These two treatments are currently approved as monotherapy11,12, but their combination has never been evaluated in a clinical trial. We have developed an approach for combining those two treatment modalities and treated 2 rGBM patients. Here we describe a detailed methodology outlining this novel treatment protocol and present representative data from one of the treated patients.

A novel methodology that is employed for the treatment of recurrent glioblastomas is described. This treatment approach employs the application of alternating electric tumor treating fields (TTFields), known as TTF Therapy in combination with bevacizumab, a targeted agent that is currently FDA approved as monotherapy.

Tumor Behandlung Feldtherapie in Kombination mit Bevacizumab für die Behandlung von rezidivierendem Glioblastom

A novel device that employs TTF therapy has recently been developed and is currently in use for the treatment of recurrent glioblastoma (rGBM). It was FDA ...