Dr. Keating wird durch DOD Zuschuss CA100335 finanziert und ist ein St. Baldrick Foundation Scholar.

Alle beschriebenen Verfahren wurden überprüft und von unseren institutionellen Tierpflege und Verwendung Ausschuss genehmigt. 1. Planen Sie das Experiment <ol><li> Wählen Zellen injiziert werden. Zellen, die aus einer Vielzahl von Quellen, sind Kandidaten für die Injektion: adhärente Zellkulturlinien, genetisch veränderte Klone, Neuro Zellen, Primärkulturen oder disaggregierten Tumoren. Die Art der gewünschten Modell wird die am besten geeignete Injektionsstelle zu definieren. <ol><li> Bestimmen die Zellzahl zur Injektion. Die Anzahl der Zellen erforderlich ist, um Tumore zu bilden variiert mit Zelllinie und muß empirisch ermittelt werden; Tumorwachstumsrate hängt stark vom Zelltyp, Zellzahl und Zellkulturpassage Nummer. Zellzahlen im Bereich von 1 x 10 4 bis 2 × 10 5 oder mehr pro Injektion wurden Tumoren mit unterschiedlicher Wachstumsraten erzeugt. </li><li> Begrenzen Sie die Lautstärke für die Injektion. Die Zellen in dem kleinsten Volumen der serumfreien Medium oder Phosphat-gepufferter s ausgesetzt,Aline (PBS), die für glatte, leicht Durchgang durch eine 26 G-Nadel ermöglicht. Je kleiner das Volumen tatsächlich in das Gehirn eingebracht werden, desto präziser und definiert die resultierende Tumor; Optimale Ergebnisse können durch Einspritzen von Mengen von 3 bis 6 ul erhalten wurde. Zu planen, um eine endgültige Volumen von mindestens 50 ul der suspendierten Zellen herzustellen, unabhängig von der Anzahl der Injektionen vorgesehen, um eine genaue Messung, Mischen und Probenahme zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Wählen Sie die entsprechende Mäuse für das Modell. Mausmodellen von menschlichen Tumoren nutzen typischerweise junge immungeschwächten Mäusen, die immunvermittelte Transplantatabstoßung zu vermeiden. Es ist nicht notwendig für die Arbeit in einem biologischen Sicherheitsschrank zu nehmen, wenn geeignete Vorkehrungen getroffen werden, einschließlich Dekontamination, Desinfektion, Sterilisation und von Materialien und Geräten. Die hier gezeigten Arbeiten wurden in Nacktmaus, männlich und weiblich zwischen 6 und 12 Wochen alt sind getan worden. Mäuse, die weniger als 20 g wiegen kann schwierig sein, auf so positionierentereotaxic Rahmen und kann anfälliger für Hypothermie. </li></ol> 2. Bauen Sie die Ausrüstung <ol><li> Zu erhalten und zu dekontaminieren eine Maus stereotaktischen Rahmen, Ausrichtung Konsole und Maus Gasnarkose Kopfhalter, Mikropumpe, Wärmekissen, Narkosegerät, LWL-Arbeitsleuchte, und variable Drehbohrer. Reinigung und Dekontamination alle Geräte. </li><li> Programmieren der Einspritzparameter (einschließlich Einspritzvolumen, Durchfluss, Geschwindigkeit Einheiten Spritzentyp) und anderen Variablen, die für den Betrieb der Spritzenpumpe. Optimieren Sie die Einstellungen für jedes einzelne Modell. HINWEIS: In dieser Injektionen die Einstellungen mit Hilfe eines 25 ul Spritze (Device Type &quot;E&quot;) in der nicht gruppierten (&quot;N&quot;)-Modus waren 3.000 nl Proben mit einer Rate von 400 nl / min (Rate Einheiten &quot;M&quot;). </li><li> Reinigen eines Präzisionsmikro mit 26 G-Nadel mit mehreren Spülungen von sterilen VE-Wasser (DIH 2 O) und 70% Ethanol (EtOH), tut ein Abschluss rinse mit DIH 2 O. Einige, aber nicht alle Modelle sind so konzipiert, autoklaviert werden. Stellen Sie sicher, dass die Kolbenbewegung ist glatt und frei. </li><li> Erhalten Anästhesiegeräten. Isofluran ist das bevorzugte Anästhetikum als es leicht ist, die Tiefe und die Dauer der Anästhesie zu regulieren. Sicherzustellen, dass die stereotaktische Gerät ist mit einer Maus Anästhesiegas Befestigung und daß die erforderlichen Leitungen und Anschlüsse vorhanden sind, um das Gasgemisch aus dem Anästhesiegerät zur Maus liefern ausgestattet. </li><li> Autoklaven chirurgische Instrumente, einschließlich feiner Spitze Schere, Pinzette zwei / hemostats (mit Zähnen) zum Nähen, mittelgroße Schere, mittleren und spitzen Pinzette, und mindestens zwei 1 mm Zahnbohrer. Halten Instrumente während des Verfahrens mit 70% EtOH, Desinfektionsmittel oder einem Wulst Sterilisator sauber. </li><li> Isofluran erhalten, analgetisch, Augensalbe / Schmiermittel, antibiotische Salbe, Kochsalzlösung, 30% Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), antiseptische und Knochenwachs (falls gewünscht) von einemTier oder medizinische Versorgung. Bereiten Sie sterile DIH 2 O und 70% EtOH. Einweg wie Gaze-Pads, sterile Wundauflagen, Nähte, Ethanol Tupfer, Wattestäbchen Tupfer, sterile OP-Handschuhe, OP-Sägeblätter und mehr sind in der Materialliste aufgeführt. Eine feine Spitze Permanentmarker zur Markierung des Schädels soll dekontaminiert und für den chirurgischen Einsatz gewidmet sein. </li></ol> 3. Vorbereitung der Zellen für Injection <ol><li> Bei den hier gezeigten Experimente, wählen Sie eine immortalisierte humane GBM-Zelllinie. Bestimmen der Anzahl von Zellen (2 × 10 5) und dem Volumen der Suspension injiziert werden (3 ul) empirisch; Details können bei Zelltyp variieren. Verwenden ein Volumen von mindestens 50 ul, um eine genaue Messung, Mischung und Injektion zu erleichtern. </li><li> Trypsinieren Zellen und Resuspension in Medium oder PBS. Führen Sie die folgenden Schritte kurz vor der Zellinjektion: <ol><li> Entfernen Sie das Medium aus den Zellen durch Absaugen und Spülen mit 10 ml PBS pro 100 mm-Platte; PBS zu entfernen. </li><li> Anzeiged 1 ml Trypsin zu jedem 100 mm Platte und Inkubation bei RT gerade lang genug, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten. </li><li> Stoppen Trypsin-Aktivität mit 5 ml Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) + 10% fetales Rinderserum (FBS) auf 100-mm-Platte. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g und Resuspendieren in ~ 5 ml serumfreiem DMEM (SF-DMEM) pro 100 mm Platte. </li><li> Graf lebensfähigen Zellen mit einem Hämazytometer oder einem automatisierten Zellzähler. </li><li> Einstellen der Lebendzelldichte von 2 x 10 5 Zellen / 3 ul (oder wie durch Experimente bestimmt), die durch Pelletieren der Zellen und Resuspendieren in SF-DMEM. </li></ol></li><li> Halten Zellen auf Eis oder einem kühlen Pack (nicht erlauben Zellen zu frieren) gekühlt. Vorsichtig mischen Finger Schnippen. </li></ol> 4. Bereiten Sie Anesthetize und Maus für Chirurgie <ol><li> Induzieren Anästhesie mit ~ 5% Isofluran (Sauerstoffströmungs ~ 2 l / min) oder durch Tierarzt gerichtet. Induktion sollte 2 bis 3 Minuten dauern. Pflegen Maus in einer angemessenen Tiefeder Narkose mit Isofluran ~ 3%. <ol><li> Überprüfen der Narkosetiefe durch toe Prise, Isofluran einstellen, wenn angegeben und weiter, um die Atmung und Zehen Prise Reaktion während des gesamten Verfahrens zu überwachen. Decken Maus mit Gaze-Pads für Wärme und regelmäßig überwachen Maus während des gesamten Verfahrens, die 45 Minuten bis 1 Stunde in Anspruch nehmen kann, abhängig von der Geschwindigkeit der Injektion. </li></ol></li><li> Bewegen Sie die Maus in stereotaktischen Rahmen von sorgfältig Schiebe den Gaumen bar über die Zunge und in den Mund. Haken Sie die Frontzähne in die Zahn Loch. Verwenden Sie Ohr Bars, um den Kopf zu stabilisieren, mit dem Ohr-zu-Augenoberfläche so horizontal wie möglich. Bars nicht mit Gewalt in den Gehörgang. Es ist entscheidend, um den Kopf sicher zu positionieren: Check von Seite zu Seite und nach oben und unten Bewegung sanft mit den Fingerspitzen. Mit den einstellbaren Bedienelementen der stereotaktischen Gerät zur Optimierung der Passform. </li><li> Schmieren Sie die Augen mit Augensalbe. Reinigen Sie die Haut zwischen den Ohren und Augen zweimal mit wechselnden Anwendungen einer PVP-Jode antiseptische und 70% EtOH. </li><li> Injizieren gewählt Analgetikum subkutan (SQ) in Flanke (oder wie vorgeschrieben). </li></ol> 5. Führen Injection <ol><li> Bestimmen Sie die Injektionsstelle. Die Injektionsstelle kann mit der Größe und Mäusestamm und dem Zelltyp variieren. Zellen zu nahe an den Ventrikel injiziert können cranio-Rücken Ausbreitung der Krankheit führen. Zellen zu flach eingespritzt wird, durch die Nadelbahn wachsen. HINWEIS: In der hier gezeigten Experimenten wurde das Target als der Vorderbereich der Hirnrinde definiert eine Stelle 2,5 mm lateral (rechts), 1,5 mm anterior und 3,5 mm ventral bezüglich des Bregma gewählt wurde (Figur 1), wodurch eine Mittelhirn-Tumors bei Mäusen von 20 bis 30 g. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt (~ 8 mm lang) mit steriler Technik durch die Haut des Kopfes, um das Bregma und der Injektionsstelle aus. Ein diagonaler Schnitt, von einem Punkt zwischen der Mittellinie Achse und das rechte Auge in Richtung des rechten Ohres ( <strong&gt; 2) ermöglicht den Zugang zu sowohl dem Bregma und der Injektionsstelle. </li><li> Ziehen Sie die Haut und eine sterile Wattestäbchen, um die Oberfläche des Schädels zu trocknen. Tupfen Sie den Knochen mit einem anderen Tupfer mit H 2 O 2 befeuchtet Bregma visualisieren. Das H 2 O 2 Sauerstoffblasen zu produzieren, so dass dünne Linien von weißen Schaum entlang der koronalen und sagittalen Nähten, die an Bregma schneiden. </li><li> Sperren eine leere Spritze mit Nadel auf der Mikropumpe und manövrieren die Spitze der Nadel direkt über dem Bregma; Satz Koordinaten auf der Ausrichtung Konsole, um 0,0 mm seitlich, 0,0 mm anterior / posterior und 0,0 mm ventral / dorsal. </li><li> Bewegen Sie die Nadel bis 2,5 mm lateral (rechts) und 1,5 mm vor in Bezug auf Bregma (oder gewünschten Ort) mit den Steuerknöpfen auf der stereotaktischen Gerät. Heben Sie die Spritze leicht und markieren Sie den genauen Standort auf dem Schädel mit einem speziellen Filzstift. Wenn die Außenfläche des Schädels ist nicht auf eine ebene Fläche mit Bregma (i.e. der dorsal / ventral Koordinaten nicht mehr auf Null steht), Zurücksetzen der ventrale / dorsale Lese bis 0,0, um zu gewährleisten, daß die Tiefe der Injektion nicht verschoben wird. </li><li> Bohren Sie ein kleines Loch in den Schädel mit einem Handdrehbohrer mit einem sterilen Dentalspitze an der entsprechenden Stelle mit dem Stift in Schritt 5.5 markiert ausgestattet. Halten Sie den Bohrer in einem Winkel auf den Schädel und sehr sanft berühren die Spitze bis auf die Knochen. Wiederholen Sie nach Bedarf. Bohren fast, aber nicht vollständig durch den Knochen, so dass die Nadel, um diese Schicht des Schädels tatsächlich zu durchdringen, führt der saubersten Injektion. </li><li> Entfernen Knochenstaub mit einem Wattestäbchen in PBS oder Kochsalzlösung befeuchtet. Bringen Sie die Spritze mit der Pumpe und senken Sie die Nadel gerade in den Bohrloch zu Ort zu bestätigen. Wenn das Bohrloch wird nicht mit der Nadel zentriert, verwenden Sie den Bohrer die Öffnung zu vergrößern. </li><li> Vorsichtig mischen die Zellsuspension und zeichnen Sie die Zellen in die Spritze mit der Pumpensteuerung. Vermeiden Sie Blasen und Klumpen, und wischen Sie die Nadel Witzh einem Alkoholtupfer, um kontaminierende Zellen auf der Außenfläche zu entfernen. Wenn die Spritze / Nadel ist verstopft oder gefroren, herausnehmen und schnell sauber mit sterilem Wasser und 70% EtOH. </li><li> Senken Sie die Nadel auf der Ebene der Schädeloberfläche (0,0 mm ventral / dorsal). Dann langsam (ca. 1 min) Absenken der Nadel durch die gesamte Dicke des Schädels durchbohren und durchdringen das Gehirn zu einer Tiefe von 4 mm ventrall. Ziehen Sie die Nadel langsam auf 3,5 mm ventralen. Wenn die Maus den Kopf sicher in der stereotaktischen Einheit gehalten, sollte es fast keine Bewegung des Schädels sein. </li><li> Bestätigen Sie, dass die richtigen Parameter sind in der Pumpensteuerung eingegeben werden (Abschnitt 2.2) und drücken Sie &quot;RUN / STOP&quot; (oder wie von Produkthandbuch gerichtet), um Zellen autoinject. Überwachen Sie die Maus und passen Isofluran, wenn angegeben. Spritze beobachten und sicherzustellen, dass der Kolben im Zylinder bewegt. Gefroren oder verstopft Bewegung kann in einer gebogenen / gebrochen Kolben führen. </li><li> Warte 1 bis 2 min mit der Nadel in der bregen, dann sehr langsam (über 3 bis 4 min) zurücktreten Nadel von Gewebe. Gesamtzeit, um die Nadel zu entfernen, nachdem die Injektion abgeschlossen ist, 5 min. Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die Gegend rund um den Bohrloch auslöschen; lassen die Ränder der Haut offen, damit der Knochen zu trocknen. </li><li> Entfernen Sie Spritze aus der Pumpe und 3x schnell gründlich mit sterilem H 2 O, 3x mit 70% EtOH und 3x mit sterilem H 2 O (oder, wie von Hersteller gerichtet). Wischen Nadel mit EtOH und beiseite stellen. </li><li> Steriler Knochenwachs (entspricht 1 oder 2 ul) mit dem Bohrloch und verwenden Sie die Holz Ende einer sterilen Wattestäbchen, um das Wachs auf und in die Knochen verstopfen. Wenn die Oberfläche ausreichend getrocknet, sollte dabei bleiben. </li><li> Verbreiten sterilen Tuch über die Maus und die umliegenden Arbeitsbereich und Naht der Schnitt; drei Maschen ausreichend. Alternativ kann eine chirurgische Klebstoff verwendet werden. Gelten eine topische Antibiotika. </li><li> Reduzieren Isofluran auf 0% und entfernen Sie die Maus aus der stereotaktischen Einheit, wobei careful, um die Zähne zu schützen. Überprüfen Ohren, Mund und Zunge. </li><li> Überwachen Sie die Maus eng nach der Einspritzung. Bewegen Sie die Maus auf einem Heizkissen für 5 bis 10 min; dann Transfer zum Käfig (auf Wärmekissen) und beobachten, bis der Maus wacht auf und wird ambulant. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis er das Bewusstsein wiedererlangt, um genug sternalen recumbence halten. Nicht Maus, um das Unternehmen von anderen Tieren zurück, bis vollständig erholt. Betrachten Sie die Verwendung von zusätzlichen analgetischen, wenn Anzeichen von Schmerzen bemerkt. </li></ol> 6. Beenden und Monitor-Recovery-&amp; Tumorentwicklung <ol><li> Reinigen Sie alle Instrumente und Geräte mit 70% EtOH, eine Perle Sterilisator oder Desinfektionsmittel zwischen Mäusen. </li><li> Überwachung der injizierten Mäuse zwei Tage nach der Behandlung auf Anzeichen von Schmerzen, Infektionen oder andere Komplikationen. Injizieren Analgetikum bei 24 und 48 h (oder wie angegeben) nach der Prozedur. Nahtmaterial zu entfernen, auf 7 bis 10 Tage, wenn nötig. </li><li> Bewerten Sie die Mäuse für die klinische Anzeichen der Krankheit, paralysis, verminderte Aktivität, Gewichtsverlust, Krampfanfälle oder allgemeine Krankheit. </li><li> Überwachen Sie die Tumor-Entwicklung durch die entsprechende Methode [Magnet-Resonanz-Tomographie (MRT), In-vivo-Imaging Systems (IVIS), etc.]. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereotactic+intracranial+implantation+and+in+vivo+bioluminescent+imaging+of+tumor+xenografts+in+a+mouse+model+system+of+glioblastoma+multiforme.">Stereotactic intracranial implantation and in vivo bioluminescent imaging of tumor xenografts in a mouse model system of glioblastoma multiforme.</a> J. Vis. Exp. (67), (2012).</li><li>Iwami, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+of+intracranial+injection+via+the+postglenoid+foramen+for+brain+tumor+mouse+models.">A novel method of intracranial injection via the postglenoid foramen for brain tumor mouse models.</a> Journal of neurosurgery. 116, 630-635 (2012).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Orthotopen Mausmodell des menschlichen Gehirns Krebs kann ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Beurteilung der Wirksamkeit von klinischen Therapien sein, aber darauf zu achten, um die Platzierung der Zellen im Hirngewebe zu optimieren. Studien haben gezeigt, dass die übermäßige aliquoten Volumen, suboptimal Injektionstechnik und hastig Injektionsraten können zu Undichtigkeiten und dem Auftreten von Tumorzellen in unerwünschten Stellen (Kammern, Rückenmark, extradural Regionen, etc.) Und hohe Variation in...

In-vitro-Studien der Gehirntumorzellen sind von unschätzbarem Wert für Sezieren molekularen Mechanismen das Wachstum, Überleben, Migration und Invasion von Krebszellen; kultivierten Zellexperimenten können festlegen, Signalwege, schlage potenzielle therapeutische Ziele, und zu charakterisieren, zelluläre Reaktion auf medikamentöse Behandlung. Aber in vitro-Systeme sind viel zu einfach zu organismischen Reaktion auf Arzneimittel vorherzusagen; sie nicht über die physiologischen Reaktionen, Immunreaktionen, Zellmikroumgebung, und die allgemeine Heterogenität der lebenden Tier-Systemen. Gentechnisch veränderte Modelle können von unschätzbarem Wert, wenn verfügbar, aber molekulare Unterschiede zwischen den Arten und murine Zellen nicht Ereignisse in der menschlichen Prozesse zu rekapitulieren, was zu erheblichen Diskrepanzen beim Vergleich von Tiermodellen zu klinischen Beobachtungen 1. Maus-Xenograft-Modelle, die subkutan (SQ) Injektion von menschlichen Gehirntumorzelllinien unter der Haut der Flanke sind einfach durchzuführenund zu messen; sie können verwendet werden, um Auswirkungen von Gen-Modifikation and Drug Administration / Lieferung, Metabolismus und Toxizität anzugehen. Signifikante Nachteile begrenzen jedoch die Nützlichkeit des SQ-Modelle. Die Mikroumgebung nicht rekapitulieren ist die eines natürlich vorkommenden Hirntumor: Wechselwirkungen von verschiedenen Zelltypen und Geweben; die lokale Gefäßsystem und unzähligen anderen Faktoren einzigartig an das Gehirn kann nicht repliziert werden. Um genauer zu reproduzieren die einzigartige Milieu einer natürlich vorkommenden Gehirntumor und Testen der Wirkung von pharmazeutischen Eingriffe sollten eine Maus orthotopen Modell verwendet werden. Darüber hinaus kann orthotopen Techniken als Teil einer gentechnisch veränderten Ansatz, bei dem humane primäre Nicht-Krebszellen (differenzierte oder Vorläufer) verwendet werden genetisch verändert und in die jeweiligen Gelände einer Maus injiziert, mit oder ohne menschliche Stromazellen, was in der Tumorgenese beim Menschen ein ähnlich gesehen. Dieser Artikel beschreibt,eine Methode, um Gehirntumore exakt und reproduzierbar zu schaffen, in Mäusen. Mit dieser Technik kann der Benutzer genau einzuspritzen Ein kleines Aliquot von suspendierten Zellen in einer bestimmten Position des fronto-parietooccipitalis Schläfenregion des Maus-Hirnrinde. Maus Sterblichkeit ist extrem niedrig; in unseren Händen sind keine Mäuse von chirurgischen Komplikationen nach 185 Verfahren gestorben. Eigenschaften des resultierenden Tumors mit der typischen klinischen Tumoren verglichen werden; Zum Beispiel: Schnelligkeit des Wachstums, der Grad der Nekrose, das Ausmaß der Invasion, die Heterogenität der Zelltyp, die Anwesenheit von mitotischen Zellen, Marker der Proliferation und Apoptose etc. Zelllinien oder aufgeschlüsselte menschlichem Gewebe oder Tumorproben können dann bewertet werden basierend auf ihrer Fähigkeit zu simulieren tatsächlichen klinischen Präsentation. Arzneimittel, ausgewählt auf der Grundlage ihrer Leistung in Zellkultur kann im Rahmen eines funktionierenden Stoffwechsel, Kreislauf und Blut-Hirn-Schranke nicht getestet werden, da sie in einem Tier belastet wit existierenha Tumor, die alle in einem relevanten architektonischen Kontext. Ferner können die Zellen für die Injektion gewählten genetisch modifiziert werden, um den Einfluss von Niederschlägen, Deletionen untersuchen, Knock-ins, Mutationen usw. auf Tumorwachstum und Überleben. Eine Anzahl von Veröffentlichungen dokumentieren Tumoren Studien mit einer Vielzahl von Hirntechniken. Yamada et al. Haben eine detaillierte Studie über die Injektion von Farbstoff und der U87-Zellen und fanden, daß die Minimierung Volumen und die Einspritzgeschwindigkeit erzeugt die beste Tumor 2. . Brooks et al legene Reproduzierbarkeit und Effizienz mit einem mikroprozessorgesteuerten Injektor anstatt eine manuelle Methode, um virale Vektoren zu liefern; ihre Schlussfolgerungen in Bezug auf die optimale Einspritzparameter gelten für Zell Lieferung 3. Shankavaram et al., Dass Glioblastoma multiforme (GBM)-Zelllinien injiziert orthotopisch (mit einer manuellen Methode) in das Gehirn rekapituliert das Genexpressionsprofil des clinical Tumoren stärker als in vitro oder SQ Fremdtransplantaten, die den Einsatz von intrakraniellen Modelle für präklinische Studien 4. Giannini et al. Injizierten Zellen aus menschlichen chirurgischen Proben, die in den Flanken von Nacktmäusen durch serielle Passage in das Gehirn von Mäusen weitere erlitten hatte, und zeigte, dass dieser Ansatz erhalten Patienten Tumor-Gen Veränderungen im Modell 5. Ähnliche Ergebnisse wurden von Yi et al 6 angegeben. Mit Hilfe eines stereotaktischen Setup, sorgfältig definierten Injektionsstelle, und eine langsame und stetige Einspritzrate, erhalten sie reproduzierbare Hirntumoren mit konsequenten Wachstumsraten und hohe (100%) Transplantationsrate. Die Gültigkeit dieser Technik ist daher gut etabliert; eine Literaturrecherche zeigt, dass die Anwendungen dieser Technik sind umfangreiche. Carty et al. Verwendet intrakraniellen Injektionen virale Vektoren, die therapeutische Gene erfolgreich liefern in den frontalen Kortex von transgenic Modell der Alzheimer-Krankheit 7. Thaci et al. Die Verwendung intrakranielle Injektionen therapeutische onkolytische Adenovirus in einer neuralen Stammzellträger in Nacktmäuse injiziert bereits orthotopisch GBM Tumoren 8 trägt zu liefern. Offensichtlich sind intrakranielle Injektionen ein vielseitiges und effektives Werkzeug für die präklinische Forschung. Früheren Publikationen im Journal of Visualisierte Experimente beschreiben grundlegende Ansätze 9-11, aber wir nehmen das Konzept der intrakraniellen Tumorinjektion und orthotopen Modellierung zu einem höheren Maß an Präzision mit easy-to-Master-Technologie.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="866">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:87px;">Company</td>
			<td style="width:145px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:287px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Equipment</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:349px;">Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console.</td>
			<td style="width:87px;">Kopf</td>
			<td style="width:145px;">Model 940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Mouse Gas Anesthesia Head Holder</td>
			<td style="width:87px;">Kopf</td>
			<td style="width:145px;">Model 923-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Mouse Ear Bars</td>
			<td style="width:87px;">Kopf</td>
			<td style="width:145px;">Medel 922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Fiber Optic Illuminator</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">12-562-36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">UltraMicroPump III</td>
			<td style="width:87px;">WPI</td>
			<td style="width:145px;">UMP3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Micro4 microprocessor</td>
			<td style="width:87px;">WPI</td>
			<td style="width:145px;">UMC4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Variable speed hand-held rotary drill</td>
			<td style="width:87px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">Model 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Dental drill bit, 1.0 mm</td>
			<td style="width:87px;">Spoelting</td>
			<td style="width:145px;">514554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Adaptor for dental drill bit: 3/32 inch collet</td>
			<td style="width:87px;">Dremel</td>
			<td style="width:145px;">481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Heating pad</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Isoflurane vaporizer system</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for mice</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:349px;">Medical tubing and connectors</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:287px;">to connect isoflurane vaporizer with stereotaxic frame</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Instruments</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Precision 25 ul micro syringe</td>
			<td style="width:87px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:145px;">7636-01</td>
			<td>Model 702, without needle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Microsyringe needles, 26s gauge&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Hamilton&#160;</td>
			<td style="width:145px;">7804-04</td>
			<td>RN, 25 mm point style 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Fine-tipped scissors (straight, sharp/sharp)</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Medium-sized standard scissors</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Standard serrated forceps</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Serrated hemostats (2)</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Fine-tipped forceps</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Supplies</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sutures 5-0 vicryl P-3 13 mm (Ethicon)</td>
			<td style="width:87px;">MWI</td>
			<td style="width:145px;">J463G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Surgical blades #10, stainless (Feather)</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">296#10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:349px;">Isoflurane (Fluriso)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">VetOne&#160;</td>
			<td style="width:145px;">NDC 13985-528-60</td>
			<td style="width:287px;">Item #502017. Liquid inhalation anesthetic. federal law restricts this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Carprofen (Rimadyl Injectable 50 mg/mL)&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Pfizer</td>
			<td style="width:145px;">NDC 61106-8507-01</td>
			<td>dilute in saline</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Ophthalmic ointment (artificial tears)</td>
			<td style="width:87px;">Rugby</td>
			<td style="width:145px;">NDC 0536-6550-91</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Topical antibiotic (AK-Poly-Bac )</td>
			<td style="width:87px;">Akorn</td>
			<td style="width:145px;">NDC 17478-238-35</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Povidone-iodine topical antiseptic, 10% (Betadine)</td>
			<td style="width:87px;">Betadine</td>
			<td style="width:145px;">NDC 67618-150-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td style="width:87px;">Fisher&#160;</td>
			<td style="width:145px;">H325-100</td>
			<td>for visualizing skull landmarks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile saline</td>
			<td style="width:87px;">VetOne&#160;&#160;</td>
			<td style="width:145px;">NDC 13985-807-25</td>
			<td>for diluting solutions, cleaning tissue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Bone wax</td>
			<td style="width:87px;">WPI</td>
			<td style="width:145px;">Item #501771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile drapes</td>
			<td style="width:87px;">McKesson</td>
			<td style="width:145px;">25-517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile surgical gloves</td>
			<td style="width:87px;">McKesson</td>
			<td style="width:145px;">(to fit)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile gauze pads, 2 x 2</td>
			<td style="width:87px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:145px;">22028556</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile gauze pads, 4 x 4</td>
			<td style="width:87px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:145px;">22-415-469</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Alcohol prep pads (medium)</td>
			<td style="width:87px;">PDI</td>
			<td style="width:145px;">B603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Sterile cotton-tipped applicators</td>
			<td style="width:87px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:145px;">23-400-114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:349px;">Sterile 0.5 ml screw cap tube with caps for cells</td>
			<td style="width:87px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:145px;">1405-4700</td>
			<td>for cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Individually wrapped sterile dispo pipettes</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">BD 357575</td>
			<td>for needle cleaning solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">BD insulin syringes with needles&#160;</td>
			<td style="width:87px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">329461</td>
			<td>for analgesic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:349px;">Sterile di H2O</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Microfuge tubes for cleaning solutions</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for needle cleaning solutions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:349px;">Felt tip pen (dedicated)</td>
			<td style="width:87px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td>for marking skull</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

creating anatomically accurate and reproducible intracranial xenografts of human brain tumors

Orthotope Tumormodelle sind derzeit die beste Weg, um die Eigenschaften eines Tumortyps zu studieren, mit und ohne Intervention im Kontext von einem lebenden Tier - vor allem an Standorten mit einzigartigen physiologischen und architektonische Qualitäten wie das Gehirn in vitro und Eileiter Modelle nicht. Konto für Funktionen wie Gefäßsystem, Blut-Hirn-Schranke, Stoffwechsel, Lieferung und Toxizität, und eine Vielzahl von anderen relevanten Faktoren. Orthotopen Modelle haben ihre Grenzen auch, aber mit der richtigen Technik Tumorzellen von Interesse genau in das Gewebe eingepflanzt werden, die am ehesten imitiert Bedingungen im menschlichen Gehirn. Durch Verwendung Methoden, die genau abgemessene Mengen zu liefern, genau definierten Stellen in einer konsistenten und Druck, Maus-Modellen der menschlichen Gehirntumoren mit vorhersagbaren Wachstumsraten reproduzierbar erzeugt werden und eignen sich für eine zuverlässige Analyse von verschiedenen Eingriffen. Das hier beschriebene Protokoll konzentriert sich auf die technische der Gestaltung und Herstellung für eine intrakraniale Injektion der Durchführung der Operation, und sicherzustellen, erfolgreiche und reproduzierbare Tumorwachstum und stellt Ausgangspunkte für eine Vielzahl von Bedingungen, die für eine Reihe von verschiedenen Gehirntumormodelle angepasst werden kann.

Zuverlässigen intrakraniellen Xenotransplantaten mit diesem beschriebenen Verfahren erzeugt werden. Identifizierung der kritischen Strukturen der Maus Schädel (Abbildung 1) wird für die Anerkennung der Bregma ermöglichen und führen die Ermittler auf eine präzise und reproduzierbare Injektion Lage. In diesen Studien wurde die Elternlinie U251, U251-Zellen mit Luciferase (U251-Luc) oder U87 transfizierten immortalisierten menschlichen GBM-Gewebekulturzellen wurden in 4 bis 6 ul SF-DMEM suspendiert u...

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Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden.

Erstellen Anatomisch genaue und reproduzierbare intrakranielle Xenografts der Menschen Hirntumoren

Orthotopic tumor models are currently the best way to study the characteristics of a tumor type, with and without intervention, in the context of a live ...

creating-anatomically-accurate-reproducible-intracranial-xenografts

Research

JoVE Journal

Medicine

15.4K Aufrufe.  University of Colorado School of Medicine.  Das Gehirn ist ein einzigartiger Ort mit Eigenschaften, die nicht gut durch in vitro-oder Eileiter Analysen dargestellt. Orthotopen Mausmodellen mit reproduzierbaren Lage und Wachstumseigenschaften zuverlässig mit intrakraniellen Injektionen mit einem stereotaktischen Fixierung Instrument und eine Niederdruckspritzenpumpe erzeugt werden. 

Serie: Creating Anatomically Accurate and Reproducible Intracranial Xenografts of Human Brain Tumors

Establishment and Propagation of Human Retinoblastoma Tumors in Immune Deficient Mice

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited time. These cultured tumorspheres may exhibit markedly different cellular phenotypes when compared to the original tumors. Demonstration that cultured cells have the capability of forming new tumors is important to ensure that cultured cells model the biology of the original tumor. 
Here we present a protocol for propagating human retinoblastoma tumors in vivo using Rag2-/- immune deficient mice. Cultured human retinoblastoma tumorspheres of low passage or cells obtained from freshly harvested human retinoblastoma tumors injected directly into the vitreous cavity of murine eyes form tumors within 2-4 weeks. These tumors can be harvested and either further passaged into murine eyes in vivo or grown as tumorspheres in vitro. Propagation has been successfully carried out for at least three passages thus establishing a continuing source of human retinoblastoma tissue for further experimentation. 
Wesley S. Bond and Lalita Wadhwa are co-first authors.

A method is described to propagate human retinoblastoma tumors in mice. Tumor cells are directly injected into the eyes of immune deficient mice. Secondary tumors have been successfully established using both cells directly harvested from human tumors and cultured tumorspheres.

Aufbau und Verbreitung der Menschenrechte Retinoblastoma Tumore in immundefizienten Mäuse

Culturing retinoblastoma tumor cells in defined stem cell media gives rise to primary tumorspheres that can be grown and maintained for only a limited ...

Forschung

Medizin

Automated Midline Shift and Intracranial Pressure Estimation based on Brain CT Images

In this paper we present an automated system based mainly on the computed tomography (CT) images consisting of two main components: the midline shift estimation and intracranial pressure (ICP) pre-screening system. To estimate the midline shift, first an estimation of the ideal midline is performed based on the symmetry of the skull and anatomical features in the brain CT scan. Then, segmentation of the ventricles from the CT scan is performed and used as a guide for the identification of the actual midline through shape matching. These processes mimic the measuring process by physicians and have shown promising results in the evaluation. In the second component, more features are extracted related to ICP, such as the texture information, blood amount from CT scans and other recorded features, such as age, injury severity score to estimate the ICP are also incorporated. Machine learning techniques including feature selection and classification, such as Support Vector Machines (SVMs), are employed to build the prediction model using RapidMiner. The evaluation of the prediction shows potential usefulness of the model. The estimated ideal midline shift and predicted ICP levels may be used as a fast pre-screening step for physicians to make decisions, so as to recommend for or against invasive ICP monitoring.

An automated midline shift estimation and intracranial pressure (ICP) pre-screening system based on computed tomography (CT) images for patients with traumatic brain injury (TBI) is proposed using image processing and machine learning techniques.

Automatisierte Midline Shift und intrakranieller Druck Schätzung basierend auf Gehirn CT Images

In this paper we present an automated system based mainly on the computed tomography (CT) images consisting of two main components: the midline shift ...

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality treatment consisting of surgical resection, post-operative radiation therapy and temozolomide chemotherapy 1. New therapeutic approaches are clearly needed to improve patient survival and quality of life. The development of more effective treatment strategies would be aided by animal models of GBM that recapitulate human disease yet allow serial imaging to monitor tumor growth and treatment response. In this paper, we describe our technique for the precise stereotactic implantation of bio-imageable GBM cancer cells into the brains of nude mice resulting in tumor xenografts that recapitulate key clinical features of GBM 2. This method yields tumors that are reproducible and are located in precise anatomic locations while allowing in vivo bioluminescent imaging to serially monitor intracranial xenograft growth and response to treatments 3-5. This method is also well-tolerated by the animals with low perioperative morbidity and mortality.

Stereotactic Intracranial Implantation and In vivo Bioluminescent Imaging of Tumor Xenografts in a Mouse Model System of Glioblastoma Multiforme

We describe an integrated method for the precise, stereotactic implantation of human glioblastoma multiforme cells into the brains of nude mice and subsequent serial in vivo imaging to monitor growth and response to treatment of the resultant xenografts.

Stereotaktische Intrakranielle Implantation und<em&gt; In vivo</em&gt; Bioluminescent Imaging der Tumorxenotransplantaten in einem Maus-Modell-System des Glioblastoma multiforme

Glioblastoma multiforme (GBM) is a high-grade primary brain cancer with a median survival of only 14.6 months in humans despite standard tri-modality ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel Hochauflösende<em&gt; In vivo</em&gt; Bildtechnik, um die Dynamik der intrakranielle Strukturen zu Tumorwachstum und Therapeutics Studieren

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

Generierung von subkutanen und Intrahepatische Menschenleberzellkarzinom Xenografts in immundefizienten Mäusen

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer's Disease and Normal Elderly

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are exacerbated when significant brain atrophy and age-related white matter changes (e.g. Leukoaraiosis) are present. Lesion Explorer (LE) is an accurate and reliable neuroimaging pipeline specifically developed to address such issues commonly observed on MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. The pipeline is a complex set of semi-automatic procedures which has been previously validated in a series of internal and external reliability tests1,2. However, LE's accuracy and reliability is highly dependent on properly trained manual operators to execute commands, identify distinct anatomical landmarks, and manually edit/verify various computer-generated segmentation outputs.
LE can be divided into 3 main components, each requiring a set of commands and manual operations: 1) Brain-Sizer, 2) SABRE, and 3) Lesion-Seg. Brain-Sizer's manual operations involve editing of the automatic skull-stripped total intracranial vault (TIV) extraction mask, designation of ventricular cerebrospinal fluid (vCSF), and removal of subtentorial structures. The SABRE component requires checking of image alignment along the anterior and posterior commissure (ACPC) plane, and identification of several anatomical landmarks required for regional parcellation. Finally, the Lesion-Seg component involves manual checking of the automatic lesion segmentation of subcortical hyperintensities (SH) for false positive errors.
While on-site training of the LE pipeline is preferable, readily available visual teaching tools with interactive training images are a viable alternative. Developed to ensure a high degree of accuracy and reliability, the following is a step-by-step, video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Lesion Explorer: A Video-guided, Standardized Protocol for Accurate and Reliable MRI-derived Volumetrics in Alzheimer&#039;s Disease and Normal Elderly

Lesion Explorer (LE) is a semi-automatic, image-processing pipeline developed to obtain regional brain tissue and subcortical hyperintensity lesion volumetrics from structural MRI of Alzheimer's disease and normal elderly. To ensure a high level of accuracy and reliability, the following is a video-guided, standardized protocol for LE's manual procedures.

Läsion Explorer: Ein Video-geführt, standardisiertes Protokoll für genaue und zuverlässige MRI-abgeleiteten Volumetrics in der Alzheimer-Krankheit und Normale Ältere

Obtaining in vivo human brain tissue volumetrics from MRI is often complicated by various technical and biological issues. These challenges are ...

Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable cell lines are inoculated either by intravesical instillation (model of nonmuscle invasive growth) or intramural injection into the bladder wall (model of invasive growth). Both procedures are complex and highly time-consuming. Additionally, the superficial model has its shortcomings due to the lack of cell lines that are tumorigenic following instillation. Intramural injection, on the other hand, is marred by the invasiveness of the procedure and the associated morbidity for the host mouse.
With these shortcomings in mind, we modified previous methods to develop a minimally invasive approach for creating orthotopic bladder cancer xenografts. Using ultrasound guidance we have successfully performed percutaneous inoculation of the bladder cancer cell lines UM-UC1, UM-UC3 and UM-UC13 into 50 athymic nude. We have been able to demonstrate that this approach is time efficient, precise and safe. With this technique, initially a space is created under the bladder mucosa with PBS, and tumor cells are then injected into this space in a second step. Tumor growth is monitored at regular intervals with bioluminescence imaging and ultrasound. The average tumor volumes increased steadily in in all but one of our 50 mice over the study period.
In our institution, this novel approach, which allows bladder cancer xenograft inoculation in a minimally-invasive, rapid and highly precise way, has replaced the traditional model.

The established technique to inoculate primary invasive orthotopic bladder cancer xenografts requires laparotomy and mobilization of the bladder. This procedure inflicts significant morbidity on the mice, is technically challenging and time-consuming. We therefore developed a high-precision, percutaneous approach utilizing ultrasound guidance.

Minimal Invasive Gründung von murinen orthotopen Blasen Xenografts

Orthotopic bladder cancer xenografts are the gold standard to study molecular cellular manipulations and new therapeutic agents&#160;in vivo. Suitable ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

In Vivo Optical Imaging von Hirntumoren und Arthritis mit fluoreszierenden SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

Fast and Accurate Exhaled Breath Ammonia Measurement

This exhaled breath ammonia method uses a fast and highly sensitive spectroscopic method known as quartz enhanced photoacoustic spectroscopy (QEPAS) that uses a quantum cascade based laser. The monitor is coupled to a sampler that measures mouth pressure and carbon dioxide. The system is temperature controlled and specifically designed to address the reactivity of this compound. The sampler provides immediate feedback to the subject and the technician on the quality of the breath effort. Together with the quick response time of the monitor, this system is capable of accurately measuring exhaled breath ammonia representative of deep lung systemic levels. 
Because the system is easy to use and produces real time results, it has enabled experiments to identify factors that influence measurements. For example, mouth rinse and oral pH reproducibly and significantly affect results and therefore must be controlled. Temperature and mode of breathing are other examples. As our understanding of these factors evolves, error is reduced, and clinical studies become more meaningful. This system is very reliable and individual measurements are inexpensive. 
The sampler is relatively inexpensive and quite portable, but the monitor is neither. This limits options for some clinical studies and provides rational for future innovations.

Ammonia is an important physiologic metabolite relevant to various disease and wellness states. It is also a difficult molecule to measure in breath, which demands particular precautions be taken to obtain accurate results. Not all factors influencing ammonia are known, but progress can be difficult without accounting for these factors.

Schnelle und genaue Messung der ausgeatmeten Luft Ammoniak

This exhaled breath ammonia method uses a fast and highly sensitive spectroscopic method known as quartz enhanced photoacoustic spectroscopy (QEPAS) that ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

Depletion von Maus-Zellen aus menschlichem Tumorxenografte deutlich verbessert Downstream-Analyse von Zielzellen

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...