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Ein. Isolierung von Mitochondrien aus Maus Herz <ol><li> Zu isolieren Herzen Mitochondrien, zu betäuben und zu opfern Mäusen nach den Verfahren von Ihrem lokalen Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt. </li></ol> Hinweis: Alle Schritte der Mitochondrien isoliert Protokoll muss auf Eis durchgeführt werden. Verwenden eiskalten Puffer und vorgekühlten Petrischalen, Falcon-Röhrchen und Eppendorf-Röhrchen. Die Volumina im Protokoll angegeben ist, für eine Probe mit 2 Mäuseherzen. <ol start="2"><li> Entfernen Herzen, legen Sie sie in kaltem Mitochondrien Isolation Buffer (300 mM Saccharose, 10 mM Na-HEPES, 200 uM EDTA, pH 7,4) und abspülen Blut. </li></ol> Hinweis: Für optimale Ergebnisse der pH-Wert der mitochondrialen Puffer sollten mit KOH und Essigsäure eingestellt werden. <ol start="3"><li> Ort Herzen auf einem kalten Petrischale entfernen Fett und Atrien und Hackfleisch fein mit einem Messer bis zu erhaltenING ein homogenes Produkt. </li><li> Übertragen Hackfleisch Herzen einer 50 ml-Falcon-Röhrchen, 10 ml Mitochondrien Isolation Puffer mit 0,1 mg / ml Trypsin und damit die Probe auf Eis für 10 min zu verdauen. </li></ol> Anmerkung: Trypsin während des Isolierungsverfahrens erhöht die Ausbeute an isolierten Mitochondrien und sollte konstant gehalten zwischen mitochondrialen Präparationen werden. Wir empfehlen Testen mitochondrialen Funktionen auf Zubereitungen isoliert ist die Abwesenheit von Trypsin, um sicherzustellen, dass das Enzym nicht mit Funktionen stören. <ol start="5"><li> 10 ml Mitochondrien Isolation Puffer mit 0,1% Fettsäure free BSA und 5 mg Trypsin-Inhibitor (Soja) und mischen durch Invertieren des Röhrchens mehrmals, um das Trypsin zu neutralisieren. </li></ol> Hinweis: Mitochondrien Isolation Buffer kann im Voraus zubereitet werden und kann bei -20 ° C gelagert werden Überprüfen pH beim Auftauen. Trypsin, Trypsin-Inhibitor oder BSA muss seindded der Mitochondrien Isolation Puffer am Tag des Experiments. <ol start="6"><li> Wiederherstellen der verdaute Gewebe durch niedrige bis mittlere Geschwindigkeit Zentrifugation für 1 min bei 4 ° C. </li><li> Resuspendieren Gewebe in 8 ml Mitochondrien Isolation Puffer mit 0,1% Fettsäure freies BSA und homogenisieren Verwendung eines motorisierten Dounce Homogenisator mit Teflon-Pistill (4-6 Durchläufen bei 1,200-14,00 rpm). Halten Sie die Probe auf Eis, während Homogenisieren. </li><li> Übertragen Homogenat in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen und Zentrifuge bei 800xg 10 min bei 4 ° C bis Pellet Kerne und Gewebereste. </li><li> Wiederherstellen der Überstand mit dem Mitochondrien in Eppendorf-Röhrchen und Zentrifuge bei 8.000 xg für 15 min bei 4 ° C. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die obere weiße Schicht und waschen Sie die verbleibenden dunkleren Pellet die Mitochondrien in 1 ml Mitochondrien Isolation Buffer. </li><li> Zentrifugieren bei 8000 xg für 15 min bei 4 ° C. Überstand und resuspendieren Mitochondrien Pellet in 150 ul Mitochondriale Isolation Buffer. Keep on ice Mitochondrien für weitere Tests. </li></ol> Hinweis: Die besten Ergebnisse bei der funktionellen Assays verwenden Mitochondrien innerhalb von 4 Stunden der Isolation. <ol start="12"><li> Quantifizierung mitochondriale Protein mit dem Bradford-Assay. </li></ol> 2. Qualitätskontrolle von isolierten Mitochondrien 2,1. Messung der Atemwege Regelverhältnis (RCR) <ol><li> Kalibrieren Sie den Oxytherm Sauerstoff-Elektrode mit Luft-gesättigtem Wasser, um die maximale Sauerstoff-Linie zu etablieren. Wenn ein stabiles Niveau von Sauerstoff erhalten werden 100 ul einer frisch zubereiteten 10 mM Natriumhydrosulfit Lösung, um die Null Sauerstoff Linie festzulegen. Führen Sie Messungen bei 30 ° C. </li><li> 2 ml Mitochondrien Respiration Buffer (125 mM KCl, 20 mM HEPES, 3 mM MgCl 2, 400 uM EGTA, 300 uM DTT, 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) mit 1 uM Rotenon der Oxytherm Kammer, versiegeln die Kammer und Start Recording. </li><li> Wenn Sauerstoff Signal stabil ist, fügen Sie 250 ug Mitochondrien und aufzeichnen Basalatmung für 1 min. Die Atmung sollte an dieser Stelle sehr niedrig sein wie Mitochondrien auf endogene Substrate (State 1 Atmung) werden atmenden. </li><li> Add 5 mM Succinat und Record-Signal für 1 min. Sauerstoffverbrauch sollte während State 2 Atmung erhöhen. </li><li> Erbrechen State 3 Atmung durch Zugabe von 150 uM ADP. An diesem Punkt Sauerstoffverbrauch erhöhen sollte aufgrund der ATP-Synthese durch oxidative Phosphorylierung. Record-Signal, bis die Atmung verlangsamt, was auf ADP Verbrauch und Übergang zu 4 Atmung Zustand. Rekord State 4 Atmung für mindestens 1 min. </li><li> Fügen Sie 1 uM CCCP und Record-Signal für 1 min. Entkoppelt Atmung sollte maximal sein. </li></ol> Hinweis: Die Wirkung von CCCP auf die mitochondriale Atmung ist dosisabhängig: hohe Konzentrationen von CCCP können Sauerstoffverbrauch hemmen und sollten daher sorgfältig titrated. <ol start="7"><li> Berechnen Sie die Atemwege Regelverhältnis (RCR), indem Sauerstoffverbrauchsrate im Zustand 3 Atmung durch den Sauerstoff-Verbrauch während der State 4 Atmung. Ein Ziel RCR sollte ≥ 4 sein. </li></ol> 2,2. Beurteilung der mitochondrialen Membran Integrität (Cytochrom c-Test) <ol><li> Gründlich waschen Oxytherm Kammer mit 70% Ethanol und Wasser und wiederholen Sie die Schritte 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Fügen Sie 1 mM ADP und aufzeichnen Sauerstoffverbrauch für 1 min. </li><li> Hinzufügen 10 uM Cytochrom c. Da Cytochrom c ist undurchlässig für intakte Membranen der Mitochondrien, zeigt eine Zunahme der Atmung gebrochen oder beschädigt mitochondrialen Membranen. </li></ol> 3. Messung der mitochondrialen Permeabilität Transition Pore Opening <ol><li> Richten Sie den Spektrofluorometer für die Multi-Parameter-Messung mtPTP Öffnung. Mit dem FelixGx Programm, erstellen Sie eine neue Hardware-Konfiguration (Quanta Master stetigen state), umfassend die Lichtquelle, Anregungsmonochromator, Probenkammer und zwei Detektoren bei 90 ° und 270 ° in Bezug auf die Anregung Monochromator (Abbildung 4) positioniert ist. Um eine maximale zeitliche Auflösung zu erreichen, müssen beide Emissionsmonochromatoren (90 ° und 270 °) deaktiviert und die Emissions-Filter bei 90 ° und 270 ° in den Probenraum in der Hardware-Konfiguration aktiviert haben. Dieser Schritt entfernt die Motorsteuerung der Emissionswellenlängen und beheben jeden Monochromator bei einer bestimmten Wellenlänge. Wenn die Emissionsmonochromatoren nicht deaktiviert sind, wird jeder Detektor Zyklus zwischen beiden Wellenlängen und doppelte Messungen werden aufgezeichnet. </li><li> Erstellen Sie eine neue Übernahme-Protokoll mit der Multi Dye und geben Sie die folgenden Farbstoffe: <ul><li> Fura (hohe Ca + +): Anregung 340 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li><li> Fura (low Ca + +): Anregung 380 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li><li> JC1 (Aggregat): Anregung 543 nm, Emission 595 nm (Detektor 2) </li><li> JC1 (Monomer): Anregung 498 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li><li> Schwellung: Anregung 525 nm, Emission 525 nm (Detektor 1) </li></ul></li><li> Einstellen der Anregung und Emission Schlitze bis 1 nm und die Temperatur auf 37 ° C. </li><li> Um die ratiometrische Signal für Fura und JC-1 zu erhalten, erzeugen zwei abgeleiteten Spuren: Fura (hohe Ca + +) / Fura (low Ca + +) und JC1 (Aggregat) / JC1 (Monomer). </li><li> Manuelle Einstellung der Emissionswellenlänge von Detektoren 1 und 2 bis 525 nm und 595 nm auf. </li><li> Mix 1 ml Mitochondrien Assaypuffer (120 mM KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) mit 1 uM Rotenon, 5 mM Succinat und 800 nM Fura FF in einem Einweg-4-seitige Methacrylat Küvette. Fügen Sie 250 ug Mitochondrien und Ort Probe im Probenraum. Stellen Sie sicher, dass der Magnetrührer eingeschaltet ist. </li><li> Starten Sie die Aufnahme. Nach 1 min Pause den Erwerb, 500 nM JC-1 und starten Sie den acquisition. Der JC-1-Ratio Signal sollte zu erhöhen, was darauf hinweist Farbstoffaufnahme durch aktive Mitochondrien. Aufnahme fortsetzen, bis JC-1-Signal ein Plateau (in der Regel innerhalb von 5 min) erreicht hat. </li><li> Hinzufügen 20 uM CaCl 2. Ein momentaner Anstieg der Fura FF Verhältnissignal sollte von der erhöhten Ca 2 + in der Gegenwart Assaypuffer, durch eine allmähliche Abnahme durch mitochondriale Ca 2 +-Aufnahme gefolgt beobachtet werden. Der JC-1-Ratio Signal sollte zeigen eine kurze vorübergehende Abnahme indikativ für leichte Mitochondrienmembran Depolarisation. </li><li> Warten Sie, bis Fura FF Verhältnis Signal wieder auf Basisniveau vor der Zugabe der anderen CaCl 2 Puls (1-1.5 min). Weiter pulsierenden in festen Intervallen, bis Mitochondrien nicht ansammeln können Ca 2 + und beginnen Loslassen Ca 2 + in die Assay-Puffer. mtPTP Öffnung ist durch eine gleichzeitige Erhöhung der Fura FF Verhältnissignal durch Ca 2 +-Freisetzung visualisiert, eine Abnahme in der JC-1-Signal-Verhältnisses aufgrund Membran potential Kollaps und eine Abnahme der Lichtstreuung aufgrund mitochondriale Schwellung (Abbildung 5). </li><li> Nach mtPTP Aktivierung, ob die Spezifität der Fura FF, JC-1 und Schwellungen, die jeweils mit 1 mM EGTA, 1 uM CCCP und 5 ug / ml Alamethicin. </li><li> Um die Spezifität der mtPTP Öffnung zu überprüfen, wiederholen Sie die Schritte 3,6 bis 3,9 in Gegenwart von 1 uM des Cyclophilin D Inhibitor Cyclosporin A (Cyclophilin D ist eine Komponente des mtPTP). In Anwesenheit von Cyclosporin A, das Öffnen des mtPTP benötigt erheblich mehr CaCl2 Impulse als Kontrollproben (Abbildung 6). </li></ol> 4. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 2 zeigt eine typische respiratorische Kontrolle der isolierten Maus-Mitochondrien. Zustand 3 Beatmung wird durch Zugabe von ADP in Mitochondrien atmenden auf Succinat erreicht, und wird durch eine deutliche Erhöhung des Sauerstoffverbrauchs bezüglich des Substra dadurchte allein. Abreicherung zugegeben ADP initiiert State 4 Atmung, bei dem Sauerstoffverbrauch verlangsamt und ist vergleichbar mit Raten vor ADP Zugabe erreicht. RCR wird berechnet, indem der Sauerstoff-Verbrauch für staatliche 3 Atmung durch, dass der Staat 4 Beatmung erhalten. Die Cytochrom c-Test wird verwendet, um Test der Integrität der äußeren Membran der Mitochondrien: wenn Cytochrom c zu Mitochondrien atmenden auf Succinat und ADP, keine weitere Zunahme der Atmung beobachtet wird hinzugefügt, was auf eine intakte äußeren mitochondrialen Membranen (Abbildung 3). Ein repräsentatives Bild für die mtPTP Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien ist in Abbildung 4 dargestellt. In diesem Fall mtPTP Öffnung wurde durch die Zugabe von 4 CaCl 2 Impulse (20 uM jedes) nach 1,5 min Intervallen ausgelöst. mtPTP Öffnung ist durch die gleichzeitige Freisetzung der Nähe der mitochondrialen Ca 2 + (Erhöhung Fura FF Verhältnissignal), Zusammenbruch mitochond scheinbarenrial Membranpotential (Abnahme der JC-1-Ratio-Signal) und erhöhte mitochondriale Volumen (Rückgang der Schwellung Signal). Wenn Cyclosporin A zugesetzt wird, welche an den D-Anteil des Cyclophilin bindet mtPTP erfordert mtPTP Öffnung 7 Impulsen von CaCl 2 anstelle von 4 (Abbildung 5). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Abbildung 1. Ablaufdiagramm des Multi-Parameter-mitochondrialer Permeabilitätsübergang Porenöffnung Protokoll für isolierte Mitochondrien. Herz von Mäusen geerntet und Mitochondrien werden durch differentielle Zentrifugation isoliert. Die mitochondrialen Präparation wird dann qualitativ durch polarographische Messung des respiratorischen Verstärkungsfaktor und Mitochondrienmembran Intaktheit in Anwesenheit von Cytochrom c ausgewertet. Mitochondriale permeability transition pore Öffnung in isolierten Mitochondrien wird durch sequentielle CaC ausgelöstl 2 Additionen und ist mit einem Spektrofluorometer durch Überwachung Ca 2 +-Freisetzung aus Mitochondrien-Membran möglichen Zusammenbruch und Schwellung der mitochondrialen Matrix gemessen. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Abbildung 2. Messung Atemwege Regelverhältnis (RCR) von isolierten Herzen Mitochondrien. Sauerstoffverbrauch durch isolierte Mitochondrien während State 3 Atmung in Gegenwart von Succinat und ADP gemessen, und im Zustand 4 Atmung nach ADP Verbrauch. Die Reaktion des isolierten Mitochondrien Entkuppler wird durch die Zugabe von CCCP gemessen. Zahlen auf dem Graphen sind die Raten der Sauerstoffverbrauch durch isolierte Mitochondrien in nmol / min / mg Protein. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Abbildung 3. Measure<html> ment der Membran Integrität der isolierten Herzen Mitochondrien. Mitochondrienmembran Integrität wird durch Messen des Sauerstoffverbrauchs in isolierter Mitochondrien in Gegenwart von Succinat und ADP und nach der Zugabe von Cytochrom c bestimmt. Zahlen auf dem Graphen sind die Raten der Sauerstoffverbrauch durch isolierte Mitochondrien in nmol / min / mg Protein. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Abbildung 4. Spectrofluorometer Hardwarekonfiguration für die Multi-Parameter-Messung mtPTP Öffnung. Die Hardware-Konfiguration der Spektrofluorometer umfasst eine Lichtquelle, ein Erregungssignal-Monochromator, einen Probenraum und zwei Detektoren mit festen Emissionswellenlängen bei 525 nm und 595 nm liegt. Detektor 1 ist für die Signaldetektion von Fura FF hohen und niedrigen Ca 2 +, JC-1-Monomer und Aufblähen Signals verwendet wird. Detector 2 misst die JC-1 Summensignal. jove_content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Abbildung 5. Multi-Parameter-Messung mtPTP Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien. mtPTP Eröffnung wurde durch sequentielle Zugabe von 20 uM CaCl 2 ausgelöst und wurde von Ca 2, dadurch +-Freisetzung aus Mitochondrien, Mitochondrienmembranpotentials Zusammenbruch und erhöhten mitochondrialen Matrix Volumen (Schwellung). Extramitochondrialen Ca 2 + und Membranpotential wurden mit den ratiometrisch Indikatoren Fura FF (grüne Kurve) und JC-1 (rote Kurve) gemessen. Schwellung der Mitochondrien wurde durch Aufnahme Lichtstreuung bei 525 nm (schwarze Kurve) gemessen. Spezifität von JC-1 und Schwellungen Signale wurde mit 1 uM CCCP und 5 ug / ml Alamethicin (a mikrobiellen Toxin) getestet. <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Abbildung 6. Multi-Parameter-Messung der mtPTP Öffnung in isolierten Mitochondrien in Gegenwart von Cyclosporin A. Cyclosporin A (1 uM) erhöht die Anzahl der CaCl 2 Impulse benötigt, um mtPTP in isolierten Mitochondrien öffnen.

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Keine Interessenskonflikte erklärt.

Das Protokoll hier vorgestellten beschreibt die notwendigen experimentellen Schritte permeability transition pore Öffnung in isolierten Herzen Mitochondrien (Abbildung 1 und Abbildung 4) zu beurteilen: das Verfahren zur Isolierung von Maus-Mitochondrien, die Atemwege Steuerelemente, die ihre Integrität und Funktionalität zu gewährleisten, die mitochondriale Parameter während überwacht mtPTP Öffnung und die Farbstoffe für ihre Messung eingesetzt, die Einrichtung des spektrofluorometrischen Instrumentierung und die Charakterisierung von mtPTP Öffnung. Die Spektrofluorometer in diesem Protokoll eingesetzt ermöglicht die schnelle Messung dieser drei Parameter gleichzeitig. Jedoch kann das Basisprotokoll Arbeitsweise, bei anderen handelsüblichen Instrumenten, wenn auch mit verminderter Zeitauflösung werden. Nicht-ratiometrische Farbstoffe können auch verwendet werden, aber nicht zulassen quantitative Messungen von sowohl Ca 2 + und Mitochondrienmembranpotential 5. Agute Qualität mitochondrialen Herstellung ist wesentlich, wenn das Testen der mtPTP Öffnung, da sowohl die Fähigkeit, Ca 2 + akkumulieren und die Aufrechterhaltung eines Membranpotential sind eng miteinander verknüpft. Zum Beispiel fanden wir, dass Mitochondrien mit einem niedrigen RCR weisen eine reduzierte JC-1 Akkumulation und armen Ca 2 +-Mobilisierung. Das Verfahren, mit denen wir Herzmitochondrien isolieren von bisher veröffentlichten Protokollen 6, 7 angepasst und erwies sich als sehr konsistent in die Erstellung hochwertiger Mitochondrien von RCR und Cytochrom c Tests gemessen. Eröffnung der mtPTP ist ein komplexes Phänomen, das Änderungen auf mehreren Ebenen in der mitochondrialen Anatomie und Physiologie beinhaltet. Der Test beschreiben wir hier spectrofluorometrically misst die gleichzeitige Veränderungen in extramitochondrialen Ca 2 +-Spiegel, Mitochondrienmembranpotentials und mitochondriale Volumen. Die Messung einer Vielzahl von Parametern zur gleichen Zeit bietet eine comprehensive Bild des Phänomens als die Messung der einzelnen Parameter allein, wie Ca 2 +-Mobilisierung oder Schwellung. Darüber hinaus begrenzt die Nutzung von ratiometrische Farbstoffe Fura FF und JC-1 für Ca 2 + und Membran-Potential-Messungen experimentelles Artefakt in Bezug auf Konzentration, Aufnahme oder Ausbleichen zu färben. Diese Farbstoffe können auch leicht kalibriert werden, um mehr quantitative Messungen zu erhalten. Eine wichtige Beobachtung besteht darin, dass alle Farbstoffkonzentrationen so gering wie möglich gehalten werden sollten, um Interferenzen mit Mitochondrien Atmung und Membranpotential vermeiden sowie sensibilisieren mtPTP Öffnung. In unseren Händen, reduzieren JC-1-Konzentrationen oberhalb von 1 uM die Anzahl der Impulse benötigt, um durch 1-2 mtPTP Impulsen öffnen. Daher sollten geeignete Kontrollen durch Ausschließen der Farbstoffe und Aufzeichnen anderer Parameter (wie Schwellungen allein) um sicher zu sein, dass die Anzahl der Impulse benötigt, um die PTP öffnen konsistent bleibt durchgeführt werden. In diesem ProtokollWir haben mtPTP Öffnung für Mitochondrien atmenden am Komplex II Substrat Succinat in Gegenwart Rotenon, die revers Elektronentransportverbindung hemmt aus komplexen II Komplex I. Andere Substraten gemessen Atemwege können ebenso verwendet werden, wie zum Beispiel Pyruvat / Malat die Atmung unterstützt auf komplexen I. Jedoch Substrat Unterschiede in der Anzahl der Ca 2 +-Impulse erforderlich ist, um zu öffnen mtPTP berichtet worden 8. Dasselbe Protokoll zum Messen der mtPTP Öffnung kann mit Mitochondrien isoliert aus verschiedenen Geweben oder Zelllinien eingesetzt werden. Wir haben erfolgreich diese Protokoll für Leber, Muskel und Gehirn Mitochondrien ausgenutzt, obwohl die Anzahl der Ca 2 +-Impulse benötigt, um das Auslösen mtPTP Öffnung war gewebeabhängig wie zuvor 9, 10 gemeldet. Die Mitochondrien isoliert Protokoll muss angepasst und für jedes Gewebe oder Zelllinie aufgrund der spezifischen Anforderungen an die Homogenisierung Verfahren und Isolation Puffern 11, 12 optimiert werden </sup&gt;.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td></tr><tr><td> Trypsin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Trypsin-Inhibitor (Sojabohne) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Natriumhydrosulfit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> Rotenone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytochrom c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alamethicin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyclosporin A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Tissue Grinder Potter-Elvehjem mit Teflon Pistill 15 ml </td><td> Wheaton Industries </td><td></td></tr><tr><td> Rührwerk </td><td> Wheaton Industries </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (temperaturgesteuerten Sauerstoffelektrode) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 duale Emission Spektrofluorometer </td><td> Photon Technology International, Inc. </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Das mitochondriale Permeabilitätsübergang Pore (mtPTP) ein nicht spezifischen Kanal, der in der inneren mitochondrialen Membran bildet für gelöste Stoffe mit einem Molekulargewicht kleiner als 1,5 kDa transportieren. Obwohl die definitive molekulare Identität der Pore wird noch diskutiert, tragen Proteine ​​wie Cyclophilin D, VDAC und ANT zur Bildung mtPTP. Während die Beteiligung von mtPTP Öffnung in Zelltod gut 1 festgelegten vermehrt Hinweise darauf gibt, dass die mtPTP eine physiologische Rolle dient während mitochondriale Ca 2 +-Homöostase 2, Bioenergetik und Redox Signaling 3. mtPTP Öffnung durch Matrix Ca 2 + ausgelöst aber seine Aktivität kann durch verschiedene andere Faktoren, wie oxidative Stress, Adeninnucleotid Depletion, hohe Konzentrationen von Pi, Mitochondrienmembran Depolarisation oder Entkuppeln und langkettigen Fettsäuren 4 moduliert. In vitro mtPTP Öffnung kann ach seinieved durch Erhöhen Ca 2 +-Konzentration innerhalb der mitochondrialen Matrix durch exogene Zugabe von Ca 2 + (Calcium Retention Capacity). Wenn Ca 2 +-Spiegel in den Mitochondrien zu erreichen eine bestimmte Schwelle, wird das mtPTP und erleichtert Ca 2 +-Freisetzung, die Ableitung des Protons treibende Kraft, Membranpotential Kollaps und eine Erhöhung der mitochondrialen Matrix Volumen (Schwellung), die letztlich zum Bruch der äußeren Membran der Mitochondrien und irreversiblen Verlust der Organellen-Funktion. Hier beschreiben wir eine fluorimetrischen Assay, die für eine umfassende Charakterisierung der mtPTP Öffnung in isolierten Maus-Mitochondrien ermöglicht. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von 3 mitochondrialen Parameter verändert, wenn mtPTP Öffnung eintritt sind: mitochondrialen Ca 2 +-Handling (Aufnahme und Abgabe, wie durch Ca2 +-Konzentration im Testmedium gemessen), Mitochondrienmembranpotential und mitochondrial Volumen. Die Farbstoffe für Ca 2 +-Messung eingesetzt im Testmedium und Mitochondrienmembranpotential sind Fura FF, einer Membran impermeante, ratiometrisch Indikator, der eine Verschiebung in der Anregungswellenlänge in Gegenwart von Ca 2 + und JC-1, ein kationisches erfährt, ratiometrische Indikator, grün oder rot Monomeren Aggregate bildet bei niedrigen und hohen Membranpotential sind. Veränderungen im mitochondrialen Volumens erfolgt durch Aufnahme Lichtstreuung durch den mitochondrialen Suspension gemessen. Da qualitativ hochwertige, funktionelle Mitochondrien für die mtPTP Öffnung Assay erforderlich sind, beschreiben wir auch die notwendigen Schritte zu erhalten intakt, stark gekoppelte und funktionelle isolierten Herzen Mitochondrien.

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Handhabung, Mitochondrienmembranpotentials und mitochondriale Volumen. Das Verfahren zur Beantragung hochwertige und funktionale Herzmitochondrien wird ebenfalls beschrieben.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K Aufrufe.  University of Washington, Seattle. Ein spektrofluorometrischen Protokoll für die Messung der mitochondrialen Permeabilitätsübergang Porenöffnung in isolierten Maus-Mitochondrien wird hier vorgestellt. Der Assay umfasst die gleichzeitige Messung von Mitochondrien Ca 2 + Handhabung, Mitochondrienmembranpotentials und mitochondriale Volumen. Das Verfahren zur Beantragung hochwertige und funktionale Herzmitochondrien wird ebenfalls beschrieben.

Serie: Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Herstellung von hoch Coupled Rat-Mitochondrien

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Forschung

Biologie

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Die konfokale Bildgebung von Einzel Mitochondrial Super Blinkt Intact Herz oder<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifizierung der Mikrogefäßdurchlässigkeit im Einzel isolierten Blutdurchbluteten Lungen Rat Vorbereitung

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

Messung des osmotischen Wasserdurchlässigkeit Koeffizient (P<sub&gt; F</sub&gt;) Von sphärischen Zellen: Isolierte Pflanzenprotoplasten als Beispiel

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immundetektion von Außenmembranproteinen mittels Durchflusszytometrie von isolierten Mitochondrien

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Die Messung der Smooth Muscle Function in den Isolated Tissue Bath-Anwendungen Pharmakologie Forschung

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Methoden zur Bestimmung von Preisen von Glucose und die Oxidation von Fettsäuren in der isolierten Arbeitsrattenherz

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

Die Maus isoliert perfundierten Nieren-Technik

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.

Multi-Parameter-Messung der Durchlässigkeit Transition Pore Opening in isolierten Maus-Mitochondrien

Zusammenfassung

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