Dieses Protokoll hebt die Rolle von Natrium als zweiter Botenstoff hervor und zeigt auch die Existenz von teilweise differenzierten Ubiquinol-Pools. Diese Technik zeigt einen extrem einfachen Ansatz für die Untersuchung von Ubiquinol-Pools, der ansonsten sehr spezifische Zellmodelle erfordert. Dieser Ansatz kann für die Untersuchung des Elektronentransfers in anderen Membranen, insbesondere von Enzymen in Lipidtropfen, verwendet werden.
Teilen Sie die Proben in vier Teilproben zu je 20 Mikrogramm auf und kennzeichnen Sie sie A bis D.Teilen Sie die Proben A und B in zwei Teilproben von je 10 Mikrogramm auf und kennzeichnen Sie sie als A1, A2, B1 und B2. Bereiten Sie den C1/C2-Puffer wie im Textprotokoll beschrieben vor und heizen Sie ihn auf 37 Grad Celsius vor. In einer Ein-Milliliter-Küvette wird jede der Teilproben zu 30 Mikrolitern Cytochrom c und 10 Mikrolitern Malonat addiert. Fügen Sie C1 / C2-Puffer hinzu, um das Volumen auf 980 Mikroliter in den Küvetten A1 und B1 und 979 Mikroliter in A2 und B2 zu erhöhen. Fügen Sie 10 Mikroliter einmolares Kaliumchlorid in die Küvetten A1 und A2 und 10 Mikroliter einmolares Natriumchlorid in B1 und B2 hinzu. Geben Sie einen Mikroliter einmillimolares Rotenon in die Küvetten A2 und B2. Fügen Sie kurz vor der Messung 10 Mikroliter 10-Millimolar NADH in alle Küvetten hinzu.
Drehen Sie die Küvette dreimal um und legen Sie sie in das Spektralphotometer. Klicken Sie in der angeschlossenen Software auf Messen, dann auf Parameter, gehen Sie dann zu Allgemein und stellen Sie die Messparameter auf eine Wellenlänge von 550 Nanometern und eine Zeit auf vier Minuten nach dem Ablesen ein. Klicken Sie auf OK und Start, um das Experiment zu starten.
Speichern Sie am Ende der Messung die Steigung, die die lineare Erhöhung der Absorption umfasst, indem Sie auf Datei und Speichern unter klicken.Teilen Sie die Proben C und D in zwei Teilproben von je 10 Mikrogramm auf und kennzeichnen Sie sie als C1, C2, D1 und D2. Mischen Sie jede der Teilproben in einer Ein-Milliliter-Küvette mit 30 Mikrolitern Cytochrom c und einem Mikroliter Rotenon. Fügen Sie C1 / C2-Puffer hinzu, der bei 37 Grad Celsius vorgewärmt ist, um das Volumen auf 980 Mikroliter in den Küvetten C1 und D1 und 970 Mikroliter in C2 und D2 zu erhöhen. Fügen Sie 10 Mikroliter einmolares Kaliumchlorid in die Küvetten C1 und C2 und 10 Mikroliter einmolares Natriumchlorid in D1 und D2 hinzu. Geben Sie einen Mikroliter einmillimoläres Antimycin A in die Küvetten C2 und D2 direkt vor der Messung und 10 Mikroliter einmolares Succinat in alle Küvetten. Drehen Sie die Küvette dreimal um und legen Sie sie in das Spektralphotometer.
Führen Sie die Messung durch und speichern Sie die Steigung, einschließlich der linearen Erhöhung der Absorption am Ende der Messung. Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung von Natriumionen auf die Reduktion von Cytochrom c durch mitochondriale Membranen bei NADH- oder Succinatzugabe zu untersuchen. Absorptionsspuren, die bei 550 Nanometern für die Proben A und B erzeugt wurden, wurden auf ihre entsprechende Hemmung korrigiert.
Diese Spuren zeigten eine ähnliche Steigung, was auf eine ähnliche NADH-Cytochrom-c-Oxidoreduktase-Aktivität hinweist. Die Spuren für die Proben C und D waren jedoch unterschiedlich und zeigten, dass die Succinat-Cytochrom-c-Oxidoreduktase-Aktivität von Probe C höher ist als die der Probe, D.In um die mit dieser Technik gemessene Menge an Veränderung zu normalisieren, können andere Methoden weiter durchgeführt werden, wie z. B. isolierte Komplex-I-Aktivität, Komplex II oder Komplex III. Mit dieser Technik erforschen wir die physiologischen Einstellungen, in denen Natrium als zweiter Botenstoff beteiligt sein kann.
