Dieses Wort beschreibt die Atmungsanalyse bei der Verarbeitung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus. Dieses Protokoll reduziert die Reinigungszeit erheblich und ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung mehrerer Proben. Mitochondrien von Tieren eines beliebigen Geschlechts mit vereintem Hintergrund können mit diesem Protokoll verstümmelt werden, was die Untersuchung der Atmung unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen ermöglicht.
Diese Methode eignet sich für alle Forschungsbereiche, in denen die Funktion der Mitochondrien relevant ist, einschließlich Alterung, Drogentests, Krebs oder Entwicklung. Es kann sogar an andere Gewebe und Organismen angepasst werden. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien kalt sind, indem Sie während des Vorgangs alles auf das Eis legen, um die Mitochondrien vor Schäden zu schützen.
Legen Sie drei 50-Milliliter-Bechergläser pro Probe auf Eis und fügen Sie 10 Milliliter PBS in Becherglas eins, 10 Milliliter 10 Millimolar EDTA PBS in Becherglas zwei und vier Milliliter IB1 in Becherglas drei hinzu. Besprühen Sie das rechte Hinterteil einer eingeschläferten Maus mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell abfällt, und kleben Sie das Glied an das Kork-Sezierbrett und kleben Sie dann das linke vordere Glied ab. Machen Sie einen Schnitt mit einem sterilen Einwegskalpell durch die Haut vom Knie bis zu den Zehen.
Greifen Sie die Haut mit einer gezähnten Pinzette auf Knöchelhöhe und schneiden Sie sie mit einer feinen Schere um den Knöchel. Erleichtern Sie die Haut von der darunter liegenden Muskulatur mit einer feinen Pinzette in der einen Hand, während Sie sie mit einer Zahnzange in der anderen Hand hochziehen. Sezieren Sie alle Skelettmuskeln vom Knöchel bis zum Knie und entfernen Sie das gesamte Bindegewebe über dem vorderen Musculus tibialis mit einer feinen Pinzette und Schere.
Finden Sie die vier distalen Sehnen des Musculus extensor digitorum longus und schneiden Sie sie in der Nähe ihrer Insertionen in den Zehen. Suchen Sie die vordere distale Sehne von Tibialis und schneiden Sie sie in der Nähe ihres Einführens unterhalb des Knöchels ab. Ziehen Sie die Sehnen Tibialis anterior und Extensor digitorum longus über den Knöchel, um die losen Enden zu befreien.
Greifen Sie die losen Enden der Sehnen und entspannen Sie die Muskeln vom Rest der Muskulatur in den Knochen, indem Sie sie hochziehen. Schneiden Sie die proximalen Sehnen dieser Muskeln so nah wie möglich an der Kniescheibe ab. Drehen Sie die Maus auf den Kopf, um mit der Extraktion von Gastrocnemius und Soleus fortzufahren.
Greifen Sie die Tasche zwischen dem Bizeps, Femoris und dem Gastrocnemius und trennen Sie diese Muskeln mit einer feinen Schere, um die proximale Gastrocnemius-Sehne zu visualisieren. Greifen und schneiden Sie die distale Achillessehne vorsichtig mit einer feinen Schere ab. Schneiden Sie die proximale Gastrocnemius-Sehne ab und befreien Sie sie mit dem darunter liegenden Soleus.
Sezieren Sie vorsichtig die verbleibenden Muskeln und fixieren Sie die Maus in der Ausgangsposition erneut, um den Quadrizepsmuskel zu sezieren. Entsorgen Sie das Fettgewebe und führen Sie dann eine feine Pinzette zwischen den Quadrizeps und den Femur ein, um den Muskel vom Knochen zu trennen. Greifen Sie die distalen Quadrizeps-Muskelsehnen und schneiden Sie die Sehne so nah wie möglich an die Kniescheibe.
Ziehen Sie den Quadrizeps nach oben und befreien Sie ihn mit einer feinen Schere am proximalen Einführen. Wiederholen Sie dasselbe für das linke Hinterbein. Spülen Sie alle Muskeln in Becherglas eins, dann zwei, gefolgt von Becher drei.
Zum Schluss hacken Sie alle Muskeln in Becherglas drei mit einer scharfen Schere auf Eis. Legen Sie die Aufhängung auf ein C-Rohr, schließen Sie es fest und befestigen Sie es kopfüber an der Hülse des Homogenisators. Teilen Sie das Homogenat in zwei 2 Milliliter vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie für 10 Minuten.
Dann den Überstand für weitere 10 Minuten in neue vorgekühlte Röhrchen und Zentrifuge überführen. Kombinieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern IB2 Übertragen Sie den Überstand auf ein neues vorgekühltes 2-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und kennzeichnen Sie es als Überstand Nummer zwei oder SN2. Suspendiert das letzte mitochondriale Pellet in 200 Mikrolitern Respensionspuffer.
Stellen Sie schnell 10 Mikroliter für die Proteinquantifizierung zur Verfügung und fügen Sie sofort 10 Mikroliter 10% FFA BSA zur verbleibenden mitochondrialen Suspension hinzu, um Schäden zu vermeiden. Die konzentrierte mitochondriale Suspension bei 10.500 mal G zentrifugieren für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Suspendieren Sie das mitochondriale Pellet in 100 Mikrolitern 1X Kopplungsassaymedium mit BSA, 1X Elektronenfluss-Assay-Medium mit BSA oder 1X Beta-Oxidationsmedium mit BSA, abhängig vom durchzuführenden Protokoll.
Verdünnen Sie diese konzentrierte mitochondriale Probe mit dem entsprechenden Assay-Medium auf 0,2 Mikrogramm pro Mikroliter. Samen Sie 50 Mikroliter der Suspension pro Vertiefung in einer vorgekühlten 24-Well-Mikroplatte auf Eis. Fügen Sie in den Hintergrundkorrekturwellen nur das entsprechende Assay-Medium hinzu.
Lagern Sie die verbleibende mitochondriale Suspension bei minus 80 Grad Celsius, um die Reinheit der Fragmentierung zu bestimmen. Drehen Sie die Mikroplatte in der vorgekühlten präparativen Zentrifuge für 20 Minuten. In der Zwischenzeit den verbleibenden Assay auf 37 Grad Celsius erwärmen.
Lassen Sie die Mikroplatte nach der Zentrifugation fünf Minuten lang auf der Bank, um sich auszugleichen. Fügen Sie 450 Mikroliter des warmen Assay-Mediums pro Vertiefung langsam und vorsichtig hinzu, um eine Ablösung der Mitochondrien zu vermeiden. Legen Sie die Mikroplatte sofort in das Sauerstoffverbrauchsmessgerät ohne Deckel und starten Sie das Messprogramm.
Stellen Sie sicher, dass der erste Schritt eine 10-minütige Inkubation ist, damit sich die Mikroplatte erwärmen kann. Wenn das Experiment beendet ist, entfernen Sie die Kartusche und die Mikroplatte, schalten Sie das Gerät aus und starten Sie die Analyse. Allgemeine Proteinprofile aus den verschiedenen Fraktionen, die durch serielle Zentrifugationen erhalten wurden, zeigten unterschiedliche Proteinpopulationen in den isolierten Fraktionen.
Das Vorhandensein des gesamten mitochondrialen Inhalts wird durch die starken Signale für Marker der äußeren und inneren mitochondrialen Membran und der nukleoidassoziierten Proteine deutlich. Fraktion N steht für Kerne und ungestörtes Material. Die meisten endoplasmatischen Retikulum-, Plasmamembran- oder Zytoplasmamarker in den SN1- oder SN2-Fraktionen unterstreichen die hohe Reinheit, die während der Isolierung erhalten wird.
Ein Anstieg des Sauerstoffverbrauchs wurde nach ADP-Zugabe in den Kopplungs- und Beta-Oxidationsassays beobachtet. Nach der Carbonylcyanid-p-trifluormethoxyphenylhydrazon-Zugabe erreichte der Sauerstoffverbrauch seinen höchsten Niveau. Ein niedriges Atemkontrollverhältnis gewährleistet die Integrität der isolierten Mitochondrien.
Der Elektronenflussassay untersuchte die Aktivität der Elektronentransportkettenkomplexe einzeln oder in Kombination durch die Injektion spezifischer Substrate und Inhibitoren. Isolierende Mitochondrien sind extrem empfindlich. Daher müssen alle Schritte nach der Gewebeminderung sorgfältig und sorgfältig durchgeführt werden, um ihre Lebensfähigkeit zu erhalten.
Experimentelle Assays können durch eine deterministische sematische Analyse wichtiger Mitochondrienmoleküle oder durch die Untersuchung der Montage respirometrischer Komplexe unter Verwendung der blauen nativen Polyacrylamid-Gelelektrophorese ergänzt werden.
