Diese Studie wurde finanziert durch Zuschüsse aus dem National Sciences und Engineering Research Council (NSERC, Entdeckung Grant) und Université de Moncton, NP. LHB möchte die finanzielle Unterstützung des Canadian Institute of Health Research (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) und der Université de Moncton anerkennen. Die Arbeit des EHC wird von der Université de Moncton und Alzheimer Gesellschaft des Gehirns Kanada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, Kanada, New Brunswick Health Research Foundation unterstützt.

(1) Reagenzien Vorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die folgenden Lösungen für Dissektion und Permeabilisierung des Gewebes.<ol>
<li>Bereiten Sie Erhaltung Lösung: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, Taurin, 20 mM 15 mM Na2Phosphokreatin, 20 mM Imidazol, 0,5 mM Dithiothreitol, und 50 mM K-MES, pH 7,1 (kann gespeichert werden bei-20 ° C).</li>
		<li>Bereiten Sie Saponin Lösung: 5 mg Saponin in 1 mL der Bewahrung Lösung (bereiten Sie täglich frisch).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie folgenden Lösungen für die Messung der Atmung.<ol>
<li>Bereiten Sie Atmung Medium: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2und 0,2 % BSA (w/V), pH 7,2.</li>
		<li>Entkuppler, Substrate, Inhibitoren vorzubereiten. Lösen Sie alle Substrate in H2O und lösen Sie der Entkuppler FCCP sowie die Inhibitoren in Ethanol absolut (mit Ausnahme von malonat die H2O verdünnt ist auf). Die meisten der Substrate sowie malonat (siehe Tabelle der Materialien) zu neutralisieren. Alle Konzentrationen im Protokoll gegeben sind Endkonzentrationen in 2 mL Kammern.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Vorbereitung und Kalibrierung von hochauflösenden Respirometer.
<ol><li>Die Kammern, Kappen und Stopfen der Respirometer dreimal mit 70 % Ethanol und dreimal mit destilliertem Wasser zu waschen.</li>
	<li>Kalibrieren auf NULL Sauerstoffkonzentration: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern und 10 mg Natrium Dithionite hinzufügen. Zwar das maximale Volumen der Kammer 2 mL, 2,3 mL hinzugefügt, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen unter der Stopper bleibt, wenn die Kammern zu schließen. Schließen Sie die Kammern mit den Stöpseln und Messen Sie der Sauerstoffkonzentration für 10-20 min. kalibrieren die Elektroden bei Null Sauerstoffkonzentration mit der daraus resultierenden Sauerstoff-Verbrauch zu.</li>
	<li>Die Kammern mit distillated Wasser zu waschen, in absoluten Ethanol für 10 min inkubieren, und dann mit destilliertem Wasser abspülen.</li>
	<li>Bei Sättigung der Luft kalibrieren: pipettieren 2,3 mL Atmung Medium in den Kammern, legen Sie die Stopper, Aspirieren Sie das überschüssige Medium auf die Stopper und heben Sie dann die Stopper mit Abstandhalter. Überschüssige Atmung Medium ist in den Kammern (Volumen von 2 mL gesamt) pipettiert, um das Vorhandensein von Luftblasen zu vermeiden, nach dem Schließen der Kammern.</li>
	<li>Überwachen den Sauerstoffverbrauch für 45 Minuten bis eine Stunde, bis der Sauerstoff-Konzentration (blaue Spur) stabil rund 250 ist nM bei 24 ° C.</li>
</ol>(3) sezieren von fliegen und Permeabilisierung der Gewebe
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass alle Schritte ausgeführt werden, auf dem Eis.</li>
	<li>Betäuben sechs männlichen fliegen von dem gleichen Stamm, dasselbe Alter und auf die gleiche Diät auf Eis, Dissektion der fliegen zu erleichtern (Wildtyp w1118, 15 Tage alt, mit Maismehl Medium gefüttert) erhoben.</li>
	<li>Mit einem Skalpell und feine Spitzen Pinzette, sezieren Sie die fliegen (entfernen Sie die Köpfe und Bäuche) um nur des Thoraxes, enthält die Flugmuskeln zu halten. Dieser Schritt kann mit dem bloßen Auge erfolgen. Die daraus resultierende Thoraxes mit feinen Spitzen Pinzette zu behandeln.</li>
	<li>Drei seziert Thoraxes in einem 25 mm Petrischale mit 2 mL eiskaltes Bewahrung Lösung mit der Pinzette zu übertragen.</li>
	<li>Mit der feinen Spitze Pinzette mechanisch permeabilize des Thoraxes durch Einfügen von der Spitze der Zange in die Thoraxes und wiederholt zerreißen des Gewebes um ein locker verbundenes Netzwerk zu erhalten.</li>
	<li>Füllen Sie in einer 24-Well-Platte zwei Brunnen mit 12,5 µL der Saponin-Lösung und 1 mL der Bewahrung Lösung um eine Endkonzentration von 62,5 µg/mL von Saponin zu erhalten. Füllen Sie die zwei benachbarten Brunnen mit 1 mL der Atmung Medium.</li>
	<li>Mit der feinen Spitze Pinzette drei permeabilized Thoraxes in die verdünnte Saponin-Lösung und mit milden Agitation auf einem Orbitalschüttler auf Eis, für 20 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie nach der zweiten Inkubation die Fasern in die benachbarten Vertiefungen gefüllt mit der Atmung Medium mit milden Agitation, auf Eis, für 5 min die Saponin abzuspülen.</li>
</ol>4. Bestimmung der Trockenmasse
<ol><li>Trocknen Sie der permeabilized Thoraxes auf einer saugfähigen Unterlage und drehen Sie 3-4 mal mit der feinen Spitze Pinzette um sicherzustellen, dass alle Feuchtigkeit entfernt wird.</li>
	<li>Wiegen Sie die drei Thoraxes auf einer Mikrowaage zusammen. Beachten Sie die erhaltenen Gewicht, wie es verwendet wird, um die mitochondriale Sauerstoff-Verbrauch zu normalisieren.</li>
	<li>Übertragen Sie das Gewebe sofort in einem Tropfen Atmung Medium auf Eis.</li>
</ol>(5) Sauerstoff Verbrauch Rate Bestimmung
<ol><li>Öffnen Sie die Kammern der Respirometer (entfernen Sie die stopfen) und fügen Sie 10 mM von Pyruvat und 2 mM von Malate in jeder Kammer.</li>
	<li>Fügen Sie die permeabilized Gewebe direkt in die Kammern, die mit der Atmung Medium gefüllt.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Stopper mit Abstandhalter.</li>
	<li>Mit einer Spritze 60 mL sammeln Sie Sauerstoff direkt aus einer Sauerstoffflasche zu und Spritzen Sie 2-5 mL Sauerstoff durch die Stopper Kapillare jeder Kammer um sicherzustellen, dass Sauerstoffdiffusion durch das Gewebe nicht Sauerstoffverbrauch beschränkt wird.</li>
	<li>Einsetzen Sie eine Hamilton-Spritze in der Kapillare von jedem Anschlag um sicherzustellen, dass die Thoraxes in der Kammer verbleiben.</li>
	<li>Die Kammern vollständig zu schließen, wenn die Sauerstoffkonzentration rund 400 beträgt nM, Sauerstoffgehalt über Luft Sättigung zu erreichen (etwa 160 % Luft Sättigung) in den Kammern.</li>
	<li>Beenden Sie und starten Sie den Rührer für Luftblasen in den Kammern zu überprüfen.</li>
	<li>Geben Sie die Masse von Gewebe vorher gewogen, um die Atmung durch die Masse von Gewebe (mg), Anzeige Massenspezifische Sauerstoffverbrauch (Pmol O2 consumed.s-1.mg-1 des Gewebes) normalisieren.</li>
	<li>Sobald der Sauerstoffverbrauch (rote Spur) stabilisiert wird, fügen Sie 5 mM ADP mit einer Hamilton-Spritze.</li>
	<li>Spülen Sie nach jeder Injektion Spritzen mit destilliertem Wasser, 70 % Ethanol, und destilliertem Wasser wieder.</li>
	<li>Sobald der Sauerstoffverbrauch wieder stabil ist, injizieren Sie 5 µL einer 4 mm von Cytochrom c.</li>
	<li>Gehen Sie zu den sequentiellen Injektionen der folgenden Substrate, die mitochondriale Sauerstoffverbrauch auf verschiedenen Stufen des ETS zu bewerten:<ol>
<li>5 µL von einer 2 M Proline hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL einer 1 M-Succinat.</li>
		<li>Fügen Sie 30 µL einer 1 M Glycerin-3-Phosphat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Injizieren der Entkuppler FCCP in gewissem Sinne Titration in Schritten von 0,5-1 µm (2 µL einer 1 mM Lösung) bis die optimale Konzentration erreicht, d. h., die Konzentration, den höchsten Sauerstoffverbrauch möglich ohne Hemmung zu erreichen (Vorsicht: siehe Tabelle Materialien).</li>
	<li>Injizieren der folgende Hemmnisse gegenüber dem Vorquartal um vollständig hemmen das Elektron Flussmittel in der ETS um den Restsauerstoff Verbrauch (ROX) messen also nicht-respiratorischen Reaktionen wie Cyclooxygenase Reaktionen unter anderem:<ol>
<li>1 µL einer 1 mM Rotenon hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>5 µL von einer 2 M malonat hinzufügen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
		<li>Fügen Sie 1 µL einer 5 mM Antimycin A (Achtung: siehe Tabelle der Materialien).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fügen Sie 0,2 mM Ascorbat und 0,5 mM TMPD nacheinander in die Kammern beginnend mit Ascorbat, den Sauerstoffverbrauch von Komplex IV zu messen.</li>
	<li>Fügen Sie 20 mM von Natriumazid Komplex IV hemmen (Vorsicht: siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Sobald das Signal stabil ist, die Kammern mit Abstandhalter, wieder mit Sauerstoff die Kammern durch die Injektion von 2 mL reinem Sauerstoff bei öffnen und Schließen der Kammern ist die Konzentration um 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Das Signal für 10-15 min zu messen und chemischen Hintergrund, d. h. den Sauerstoffverbrauch durch Autoxidation TMPD zu berechnen.</li>
</ol>6. Reinigung der Respirometer
<ol><li>Nach den Messungen einmal spülen Sie die Kammern mit destilliertem Wasser und spülen Sie die Kammern dreimal in 70 % igem Ethanol.</li>
	<li>Brüten Sie in absoluten Ethanol für 10 min, die Inhibitoren zu inaktivieren.</li>
	<li>Spülen Sie drei Mal mit destilliertem Wasser, füllen Sie die Kammern mit 70 % Ethanol und ersetzen Sie die stopfen und die Kappen bis zum nächsten Einsatz.</li>
</ol>

<ol>
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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation:+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies.">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li><li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li><li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+metabolism+of+proline,+a+stress+substrate,+modulates+carcinogenic+pathways.">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li><li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease:+To+carry+or+not+to+carry?.">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li><li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinediones+are+acute,+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier.">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li><li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion.">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

In dieser Studie wird ein Verfahren zur Probenaufbereitung vor den Messungen der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila beschrieben. Diese Methode wurde entwickelt, um verschiedene Probleme im Zusammenhang mit der Protokolle, die mit mitochondrialen Isolationen, insbesondere im Hinblick auf Dauer und Anzahl der Personen erforderlich. Anstatt zu arbeiten mit mitochondrialen Isolationen, erfordern in der Regel große Menge an Gewebe aus mehreren Personen gewonnen, erfolgt dieses Experiment permeabilized Muskelfa...

Der Taufliege Drosophila Melanogaster, dient als Modellorganismus für genetische Forschung für über ein Jahrhundert1. Die Studie dieses Organismus führte nicht nur zu erheblichen Grundlagenwissen über geschlechtsgebundene Vererbung2, Mutation Satz3, die Entwicklung des Nervensystems und die Zelle Schicksal Bestimmung4, sondern hat auch vor kurzem entstanden, als ein wertvolles Instrument, um die Mechanismen, die verschiedene Krankheiten wie Alzheimer und Parkinson5,6zu studieren. Darüber hinaus ist es ein beliebtes Modell, den Alterungsprozess zu studieren, da sie in großer Zahl über einen kurzen Zeitraum hinweg angehoben werden können und eine kurze Lebensdauer haben. Sie besitzen auch homologe Strukturen menschlicher Organe, wie Herz, Oenocytes (Hepatozyten-ähnliche Zellen), Fett Körper (funktionieren ähnlich wie die Leber und weißen Fettgewebe), Insulin produzierenden Zellen (β-Pankreaszellen entspricht), sowie die Hämolymphe Transport von Metaboliten (analog zu dem Blut der Wirbeltiere)7. Darüber hinaus sind die zentralen Bahnen des intermediären Stoffwechsels (einschließlich Insulin/Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-ähnliche Signalweg und Target of Rapamycin-TOR Wege) auch hoch konservierte7. Aus diesen Gründen Drosophila haben vor kurzem wurde ausgenutzt, um die grundlegenden Mechanismen zu beschreiben, die Stoffwechsel, vor allem in pathologischen Zuständen inhärenten menschlichen Stoffwechselerkrankungen wie Diabetes8steuern. Ein wichtiger Bestandteil des Stoffwechsels ist das Mitochondrium, das mehrere Wege integriert und führt eine der wichtigsten biologischen Lebensfunktionen, ATP-Produktion über die Oxidative Phosphorylierung-Verfahren (OXPHOS). Angesichts ihrer zentralen Rolle im Stoffwechsel des Organismus ist es nicht verwunderlich, dass die mitochondriale Funktionsstörungen bei vielen Erkrankungen wie Parkinson9 und Alzheimer Erkrankungen10sowie Amyotrophe Lateralsklerose beteiligt sind 11 , 12. sie sind auch wesentliche Determinanten des Alterungsprozesses. In der Tat sind die Hauptproduzenten von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Zelle, die auf die Zelle in hoher Konzentration durch oxidativen Schäden11nachteilig sein kann. Alterung wurde auch die Anhäufung von beschädigten oder mutierte mitochondriale DNA-13, Mitophagy Dysfunktionen14,15 , sowie Beeinträchtigung der mitochondrialen Biogenese16gebracht. Mitochondrien sind ebenfalls wichtige Determinanten der Homöostase der Zelle, wie sie verschiedene Substrate anpassen verschiedene Zellfunktionen entsprechend der Fülle oder Mangel an Makronährstoffen17,18nutzen können.
In der Tat sind die verschiedenen Nährstoffe in der Nahrung (Kohlenhydrate, Lipide und Proteine) verdaut, absorbiert und in die Zellen transportiert. Sie werden dann umgewandelt in das Zytosol, und die abgeleitete Substrate werden in der mitochondrialen Matrix, wo sie reduzierende Mittel, wie NADH und FADH219 produzieren,transportiert. Diese Verringerung äquivalente werden dann von verschiedenen enzymatischen komplexen Elektronentransport-System (ETS) oxidiert. Diese komplexe sind eingebettet in die mitochondriale innere Membran, wie Komplex I und Komplex II. Darüber hinaus vertreten anderen enzymatischen komplexe wie die mitochondriale Glycerin-3-phosphat-Dehydrogenase und Prolin Dehydrogenase alternative Routen für die Eingabe von Elektronen in die ETS-20,-21. Diese "alternative" komplexe sind besonders wichtig bei Insekten, können als je nach Tierart, sie aktiv um die Atmung20,22,23,21zu erhöhen. Elektronen aus diesen ETS Zuführsysteme werden das Ubiquinon und anschließend zum Komplex III und dann Komplex IV, bis die endgültigen Akzeptor, molekularen Sauerstoff übertragen. Diese Elektronentransfer erzeugt eine Kraft, Proton-Motiv auf der inneren mitochondrialen Membran fahren die Phosphorylierung von ADP zu ATP bei komplexen V (Abbildung 1). Unter Berücksichtigung der zentralen Rolle der Mitochondrien in der Zelle Homöostase, mitochondrialen Stoffwechsel mit der relevanten Modell D. Melanogaster stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, die zugrunde liegenden Mechanismen der verschiedenen abzugrenzen pathophysiologischen Bedingungen oder unter Mobilfunk und Umwelt betont. Überraschend jedoch nur eine Handvoll Studien gemessen tatsächlich mitochondriale Atmung in Drosophila24,25,26. Tatsächlich erfordern Experimente mit dem Ziel, mitochondriale Sauerstoffverbrauch bewerten die Isolation von Mitochondrien. Obwohl für die Messung der verschiedenen mitochondriale Funktionen (z. B. ROS-Produktion oder P/O Verhältnis als Marker der mitochondrialen Effizienz27,28) vorteilhaft, erfordern diese Isolationen in der Regel ziemlich große Mengen Gewebe aus mehreren Individuen24,29. Diese Anforderung für hohe Mengen von Gewebe und Einzelpersonen ist ein wichtiger begrenzende Faktor, besonders wenn man bedenkt, dass alle Personen, die im gleichen Alter sein sollte und vorzugsweise des gleichen Geschlechts für die Experimente machen das Maß der Atmung zu anderen Zeitpunkt am besten verweist mühsam. Darüber hinaus während mitochondriale Isolationen bedeutenden Einblick in die grundlegenden Mechanismen mitochondrialen Stoffwechsel zur Verfügung stellen können, haben die Methoden verwendet, um die Mitochondrien isolieren einige Nachteile wie die Schwierigkeit, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen , Störungen der mitochondrialen Netz- und Veränderung der mitochondrialen Struktur und Funktion29,30,31.
Das Ziel dieser Studie ist es, ein robustes Protokoll zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Drosophila mit nur eine minimale Menge an Gewebe aus sehr wenige Individuen zu präsentieren. Dieses Protokoll besteht aus mitochondriale Sauerstoff Verbrauch Messen in Situ mit permeabilized Muskelfasern29 von Drosophila Thoraxes in Kombination mit hochauflösender respirometrie32,33, 34 , 35. diese Methode hat auch weitere Vorteile im Vergleich zu den klassischen mitochondriale Isolationsmethode da die Interaktionen mit den anderen Komponenten der Zelle als auch mitochondrialen Struktur und Funktion in mehr konserviert werden permeabilized Fasern29,31,36, wodurch dieser Ansatz mehr physiologisch relevanten. Mit diesem Protokoll können mitochondriale Funktionen genau mit hochauflösender respirometrie in nur drei Thoraxes von Drosophila, mit Substraten ermöglicht die Bestimmung der Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS ausgewertet werden. Dieses Protokoll könnte daher wichtige Fragen über die grundlegenden Mechanismen helfen, die Stoffwechsel im Zusammenhang mit vielen Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen zu steuern, unter Ausnutzung des Drosophila-Modells.
Den Sauerstoffverbrauch bei mehreren verschiedenen Schritten des ETS Messen und auswerten wie verschiedene Substrate tragen zur Atmung, verschiedene Substrate (Abbildung 1), Entkuppler und Inhibitoren sind gebrauchte30 nach Permeabilisierung der der Gewebe. Insbesondere werden fortlaufende Ergänzungen von verschiedenen Substraten durchgeführt, um Regen die Einreise von Elektronen durch verschiedene komplexe des ETS. Ein Entkuppler Carbonyl Zyanid-4-(Trifluoromethoxy) Phenylhydrazone (FCCP), wird dann hinzugefügt, bei optimaler Konzentration, die Atmung nicht gekoppelt zu messen, d.h., die Atmung nicht Phosphorylierung stimuliert, um maximale Sauerstoff-Verbrauch. Sequentielle Hemmungen von komplexen I, II und III dann durchgeführt werden, um den Restsauerstoff-Verbrauch zu überwachen, der durch nicht-ETS-Oxidationsreaktionen ist. Zu guter Letzt Komplex IV maximal Atmung Kapazität ausgewertet werden kann, durch die Injektion von N, N, N', N, - Tetramethyl - p-Phenylendiamin (TMPD), eine künstliche Elektron Anbieter und Ascorbat. Es ist wichtig zu beachten, dass die Experimente bei 24 °C durchgeführt werden, da es die Temperatur an der die fliegen ausgelöst werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High-resolution respirometer Oxygraph O2K</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>10022-02</td>
			<td>Startup O2K respirometer kit 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2K-Titration Set&#160;</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20820-03</td>
			<td>Hamilton syringes with different volumes 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Datlab software</td>
			<td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td>
			<td>20700</td>
			<td>Software for data acquisition and analysis 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tipped antimagnetic forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-400</td>
			<td> 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secura225D-1S-DQE</td>
			<td>Sartorius AG, Goettingen, Germany</td>
			<td></td>
			<td>Semi-micro balance (distributed by several companies)&#160; 
			&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila melanogaster wild-type w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td>
			<td></td>
			<td> 
			Storage Condition: 24 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E4378</td>
			<td>EGTA 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1767</td>
			<td>CAUTION: corrosive to metals, acute toxicity, skin corrosion, serious eye damage, acute aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCO3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4830</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2383</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2.6H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9272</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taurine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0625</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2Phosphocreatine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7936</td>
			<td> 
			Storage Condition: -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiothreitol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8250</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saponin from quillaja bark</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7900</td>
			<td>Saponin 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: 5 mg in 1 mL of preservation solution. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9541</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9791</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td> 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>05470</td>
			<td> 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2S2O4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>157953</td>
			<td>Sodium dithionite. CAUTION: self-heating substances and mixtures, acute toxicity, acute aquatic toxi chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2256</td>
			<td>Pyruvate 
			Storage Condition: 2-8 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-(-)-Malic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1000</td>
			<td>Malate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-diphosphate monopotassium salt hydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5285</td>
			<td>ADP 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytochrome c from equine heart</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7752</td>
			<td>Cytochrome c 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Proline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P0380</td>
			<td>Proline 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium succinate dibasic hexahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2378</td>
			<td>Succinate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sn-Glycerol 3-phosphate bis(cyclohexylammonium) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7886</td>
			<td>Glycerol-3-phosphate 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with HCl and store at -80 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2920</td>
			<td>FCCP. CAUTION: acute toxicity, skin sensitisation, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in glass vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotenone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R8875</td>
			<td>CAUTION: acute toxicity, skin irritation, eye irritation, specific target organ toxicity (respir sytem), acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store in dark vials at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Malonic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M1296</td>
			<td>Malonate. CAUTION: acute toxicity, serious eye damage. 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Neutralize with KOH. Prepare fresh daily.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antimycin A from Streptomyces sp.</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8674</td>
			<td>Antimycin A. CAUTION: acute toxicity, acute aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity. 
			Storage Condition: -20 &#176;C 
			Solution Preparation: In absolute ethanol. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N,N&#8242;,N&#8242;-Tetramethyl-p-phenylenediamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7394</td>
			<td>TMPD 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(+)-Sodium L-ascorbate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A4034</td>
			<td>Ascorbate 
			Storage Condition: RT 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store in dark vials at&#160; -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaN3</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td>Sodium azide. CAUTION: acute toxicity (oral and dermal), specific target organ toxicity (brain), aquatic toxicity, chronic aquatic toxicity.&#160; 
			Solution Preparation: In MilliQ water. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measurement of mitochondrial oxygen consumption in permeabilized fibers of drosophila using minimal amounts of tissue

Die Fruchtfliege Drosophila Melanogaster, stellt eine aufstrebende Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels. In der Tat, Drosophila haben Strukturen, die Homolog zu menschlichen Organen, hoch konservierte Stoffwechselwege besitzen und haben eine relativ kurze Lebensdauer, die das Studium der verschiedenen grundlegenden Mechanismen in kurzer Zeit ermöglicht. Es ist jedoch verwunderlich, dass einer der Mechanismen wichtig für Zellstoffwechsel, die mitochondriale Atmung in diesem Modell nicht gründlich untersucht worden ist. Es ist wahrscheinlich, weil das Maß für die mitochondriale Atmung in Drosophila in der Regel eine sehr große Anzahl von Individuen erfordert und die erzielten Ergebnisse nicht sehr reproduzierbar sind. Hier ist eine Methode, die genaue Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch mit minimalen Mengen von Gewebe von Drosophila beschrieben. Bei dieser Methode des Thoraxes seziert und permeabilized sowohl mechanisch mit scharfen Zangen und chemisch mit Saponin, so dass verschiedene Verbindungen zu überqueren die Zellmembran und modulieren die mitochondriale Atmung. Nach Permeabilisierung wird ein Protokoll durchgeführt, um die Kapazität der verschiedenen komplexe der Elektronentransport-System (ETS), verschiedene Substrate zu oxidieren zu bewerten sowie ihre Reaktion auf einen Entkuppler und mehrere Inhibitoren. Diese Methode bietet viele Vorteile im Vergleich zu Methoden mit mitochondrialen Isolationen, wie es mehr physiologisch relevant, ist da die Mitochondrien noch mit den anderen zellulären Komponenten interagieren sind und die mitochondriale Morphologie konserviert. Darüber hinaus Probe Vorbereitungen sind schneller, und die erzielten Ergebnisse sind sehr reproduzierbar. Durch die Kombination der Vorteile von Drosophila als ein Modell für die Untersuchung des Stoffwechsels bei der Auswertung der mitochondrialen Atmung, wichtige neue Erkenntnisse können werden vorgestellt, vor allem wenn die fliegen erleben verschiedene Umwelt- oder pathophysiologischen Bedingungen.

In Abbildung 2ist eine repräsentative Spur von mitochondrialen Sauerstoffverbrauch unter Verwendung des oben beschriebenen Protokolls kostenfrei. Pyruvat und Malat in den Kammern zusammen mit den permeabilized Muskelfasern injiziert werden bezeichnet, die CI-LECK-Atmung, d.h.wenn der Komplex I von der ETS durch stimuliert wird die NADH produziert durch Oxidation von Pyruvat und Malat über die Tricarboxylic Säure Zyklus (CI). Während diese Atemfre...

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Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

The overall goal of this procedure is to evaluate mitochondrial respiration in the common fruit fly, Drosophila Melanogaster, using high resolution respirometry.This is achieved by first dissecting the Drosophila, to collect the thorax.The thoraces containing the flight muscles are then carefully permeabilized mechanically, with sharp forceps, and incubated with saponin, for further permeabilization.The thoraces are then transferred into the chambers of a respirometer, and mitochondrial oxygen consumption is measured with a combination of different substrates, uncouplers and inhibitors.Hi, I am Chlo

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.7K Aufrufe.  Université de Moncton. The overall goal of this procedure is to evaluate mitochondrial respiration in the common fruit fly, Drosophila Melanogaster, using high resolution respirometry.This is achieved by first dissecting the Drosophila, to collect the thorax.The thoraces containing the flight muscles are then carefully permeabilized mechanically, with sharp forceps, and incubated with saponin, for further permeabilization.The thoraces are then transferred into the chambers of a respirometer, and mitochondrial oxyge...

Serie: Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Forschung

Biochemie

Simultaneous Measurement of Superoxide/Hydrogen Peroxide and NADH Production by Flavin-containing Mitochondrial Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include flavin-dependent respiratory complexes and dehydrogenases that produce a mixture of superoxide (O2&#9679;-) and hydrogen peroxide (H2O2). Accurate quantification of the ROS-producing potential of individual sites in isolated mitochondria can be challenging due to the presence of antioxidant defense systems&#160;and side reactions that also form O2&#9679;-/H2O2. Use&#160;of nonspecific inhibitors that can disrupt mitochondrial bioenergetics can also compromise measurements by altering&#160;ROS release from other sites of production. Here, we present an easy method for the simultaneous measurement of H2O2 release and nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) production by purified flavin-linked dehydrogenases. For our purposes here, we have used purified pyruvate dehydrogenase complex (PDHC) and &#945;-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) of porcine heart origin as examples. This method allows for an accurate measure of native H2O2 release rates by individual sites of production by eliminating other potential sources of ROS and antioxidant systems. In addition, this method allows for a direct comparison of the relationship between H2O2 release and enzyme activity and the screening of the effectiveness and selectivity of inhibitors for ROS production. Overall, this approach can allow for the in-depth assessment of native rates of ROS release for individual enzymes prior to conducting more sophisticated experiments with isolated mitochondria or permeabilized muscle fiber.

Mitochondria contain several flavin-dependent enzymes that can produce reactive oxygen species (ROS). Monitoring ROS release from individual sites in mitochondria is challenging due to unwanted side reactions. We present an easy, inexpensive method for direct assessment of native rates for ROS release using purified flavoenzymes and microplate fluorometry.

Gleichzeitige Messung von Superoxid/Wasserstoffperoxid und NADH Produktion durch Flavin-haltigen mitochondriale Dehydrogenases

It has been reported that mitochondria can contain up to 12 enzymatic sources of reactive oxygen species (ROS). A majority of these sites include ...

Measuring Liver Mitochondrial Oxygen Consumption and Proton Leak Kinetics to Estimate Mitochondrial Respiration in Holstein Dairy Cattle

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert NADH and FADH into ATP. Since mitochondria are also the primary site for oxygen use and nutrient oxidation to carbon dioxide and water, how efficiently they use oxygen and produce ATP directly relates to the efficiency of nutrient metabolism, nutrient requirements of the animal, and health of the animal. The purpose of this method is to examine mitochondrial respiration, which can be used to examine the effects of different drugs, diets and environmental effects on mitochondrial metabolism. Results include oxygen consumption measured as proton dependent respiration (State 3) and proton leak dependent respiration (State 4). The ratio of State 3 / State 4 respiration is defined as respiratory control ratio (RCR) and can represent mitochondrial energetic efficiency. Mitochondrial proton leak is a process that allows dissipation of mitochondrial membrane potential (MMP) by uncoupling oxidative phosphorylation from ADP decreasing the efficiency of ATP synthesis. Oxygen and TRMP+ sensitive electrodes with mitochondrial substrates and electron transport chain inhibitors are used to measure State 3 and State 4 respiration, mitochondrial membrane PMF (or the potential to produce ATP) and proton leak. Limitations to this method are that liver tissue must be as fresh as possible and all biopsies and assays must be performed in less than 10 h. This limits the number of samples that can be collected and processed by a single person in a day to approximately 5. However, only 1 g of liver tissue is needed, so in large animals, such as dairy cattle, the amount of sample needed is small relative to liver size and there is little recovery time needed.

Here, we share methods for measuring mitochondrial oxygen consumption, a defining concept of nutritional energetics, and proton leak, the primary cause of inefficiency in mitochondrial generation of ATP. These results can account for 30% of the energy lost in nutrient utilization to help evaluate mitochondrial function.

Messung der Leber mitochondriale Sauerstoffverbrauch und Proton Leck Kinetik zur Abschätzung der mitochondrialen Atmung in Holstein Milchvieh

Oxygen consumption, proton motive force (PMF) and proton leak are measurements of mitochondrial respiration, or how well mitochondria are able to convert ...

Measuring and Interpreting Oxygen Consumption Rates in Whole Fly Head Segments

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the progression of cancer, diabetes, neurodegeneration, and aging to name a few. For instance, changes in mitochondrial activity, the cell&#39;s metabolic powerhouse, have been characterized in many such diseases. Generally, the oxygen consumption rates of mitochondria were considered a reliable readout of mitochondrial activity and measurements in some of these studies were based on isolated mitochondria or cells. However, such conditions may not represent the complexity of a whole tissue. Recently, we have developed a novel method that enables the dynamic measurement of oxygen consumption rates from whole isolated fly heads. By utilizing this method, we have recorded lower oxygen consumption rates of the whole head segment in young versus aged flies. Secondly, we have discovered that lysine deacetylase inhibitors rapidly alter the oxygen consumption in the whole head. Our novel technique may therefore aid in uncovering new properties of various drugs, which may impact metabolic rates. Furthermore, our method may give a better understanding of metabolic behavior in an experimental setup that more closely resembles physiological states.

Measuring alterations in metabolic rates is central to understanding the progression of various diseases and aging. Here, we present a novel technique to measure whole head oxygen consumption that more closely resembles the physiological state and may aid in revealing novel drugs that modify mitochondrial activity.

Messung und Interpretation von Sauerstoff-Verbrauch im ganzen fliegen Kopf Segmente

Regulated metabolic activity is essential for the normal functioning of living cells. Indeed, altered metabolic activity is causally linked with the ...

Quantification of Subcellular Glycogen Distribution in Skeletal Muscle Fibers using Transmission Electron Microscopy

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This enables quantifications of ultrastructural aspects such as volume fractions, surface area to volume ratios, morphometry, and physical contact sites of different subcellular structures. In the 1970s, a protocol for enhanced staining of glycogen in cells was developed and paved the way for a string of studies on the subcellular localization of glycogen and glycogen particle size using transmission electron microscopy. While most analyses interpret glycogen as if it is homogeneously distributed within the muscle fibers, providing only a single value (e.g., an average concentration), transmission electron microscopy has revealed that glycogen is stored as discrete glycogen particles located in distinct subcellular compartments. Here, the step-by-step protocol from tissue collection to the quantitative determination of the volume fraction and particle diameter of glycogen in the distinct subcellular compartments of individual skeletal muscle fibers is described. Considerations on how to 1) collect and stain tissue specimens, 2) perform image analyses and data handling, 3) evaluate the precision of estimates, 4) discriminate between muscle fiber types, and 5) methodological pitfalls and limitations are included.

A modified post-fixation procedure increases the contrast of glycogen particles in tissue. This paper provides a step-by-step protocol describing how to handle the tissue, conduct the imaging, and use stereological methods to obtain unbiased and quantitative data on fiber type-specific subcellular glycogen distribution in skeletal muscle.

Quantifizierung der subzellulären Glykogenverteilung in Skelettmuskelfasern mittels Transmissionselektronenmikroskopie

With the use of transmission electron microscopy, high-resolution images of fixed samples containing individual muscle fibers can be obtained. This ...

Hochdurchsatz-Quantifizierung der Synthese und Verteilung von mtDNA

High-Throughput Image-Based Quantification of Mitochondrial DNA Synthesis and Distribution

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells produce most of their ATP in the mitochondria by oxidative phosphorylation. Mitochondria are unique organelles because they have their own genome that is replicated and passed on to the next generation of cells. In contrast to the nuclear genome, there are multiple copies of the mitochondrial genome in the cell. The detailed study of the mechanisms responsible for the replication, repair, and maintenance of the mitochondrial genome is essential for understanding the proper functioning of mitochondria and whole cells under both normal and disease conditions. Here, a method that allows the high-throughput quantification of the synthesis and distribution of mitochondrial DNA (mtDNA) in human cells cultured in vitro is presented. This approach is based on the immunofluorescence detection of actively synthesized DNA molecules labeled by 5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) incorporation and the concurrent detection of all the mtDNA molecules with anti-DNA antibodies. Additionally, the mitochondria are visualized with specific dyes or antibodies. The culturing of cells in a multi-well format and the utilization of an automated fluorescence microscope make it easier to study the dynamics of mtDNA and the morphology of mitochondria under a variety of experimental conditions in a relatively short time.

Autor im Rampenlicht: Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung  

A procedure for studying the dynamics of mitochondrial DNA (mtDNA) metabolism in cells using a multi-well plate format and automated immunofluorescence imaging to detect and quantify mtDNA synthesis and distribution is described. This can be further used to investigate the effects of various inhibitors, cellular stresses, and gene silencing on mtDNA metabolism.

Bildbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung der mitochondrialen DNA-Synthese und -Verteilung

The vast majority of cellular processes require a continuous supply of energy, the most common carrier of which is the ATP molecule. Eukaryotic cells ...

Stabile Isotopenverfolgung und LC-MS-Analyse zur Messung von DHODH- und SDH-Aktivitäten

Oxygen-Independent Assays to Measure Mitochondrial Function in Mammals

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in mammalian cells. As oxygen (O2) is the most ubiquitous terminal electron acceptor for the mammalian ETC, the O2 consumption rate is frequently used as a proxy for mitochondrial function. However, emerging research demonstrates that this parameter is not always indicative of mitochondrial function, as fumarate can be employed as an alternative electron acceptor to sustain mitochondrial functions in hypoxia. This article compiles a series of protocols that allow researchers to measure mitochondrial function independently of the O2 consumption rate. These assays are particularly useful when studying mitochondrial function in hypoxic environments. Specifically, we describe methods to measure mitochondrial ATP production, de novo pyrimidine biosynthesis, NADH oxidation by complex I, and superoxide production. In combination with classical respirometry experiments, these orthogonal and economical assays will provide researchers with a more comprehensive assessment of mitochondrial function in their system of interest.

Autor im Rampenlicht: Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren  

Here, we present a compilation of assays to directly measure mitochondrial function in mammalian cells independently of their ability to consume molecular oxygen.

Sauerstoffunabhängige Assays zur Messung der mitochondrialen Funktion bei Säugetieren

The flow of electrons in the mitochondrial electron transport chain (ETC) supports multifaceted biosynthetic, bioenergetic, and signaling functions in ...