Unterstützt durch NIH Zuschüsse RC1-HL-101102, P01-CA039542, T32-HL007622, ​​der Hartwell-Stiftung, und der Doris Duke Charitable Foundation. Dr. Paczesny ist ein Ermittler der Eric Hartwell Fonds und Amy Strelzer Manasevit Research Program.

Ein. Experiment Tag 0: Probenvorbereitung und ELISA-Test Platte Coating mit Capture Antikörper für IL-2Rα, REG3α und HGF <ol><li> Plasma Aliquot zu analysierenden Proben werden gezogen, werden aufgetaut und zentrifugiert bei 12.000 UpM für 10 min auf die Gerinnsel an der Unterseite und auf der Oberseite Lipide aus dem Plasma abzutrennen. 150 ul unverdünnten Plasma wird von jeder Probe auf eine 96-Well-V-Bodenplatte plattiert werden (Quelle Platte) durch manuelle Pipettiervorrichtung nach vordefinierten Karten. Die Aliquots werden in Parafilm eingewickelt werden und in einer feuchten Kammer bei 4 ° C während des gesamten Prozesses; nicht mehr als 72 Stunden. </li><li> IL-2Rα und HGF Fängerantikörpern wird rekonstituiert und verdünnt werden pro Hersteller Spezifikation und 50 ul wird in jede Vertiefung der 96-Well jeweiligen High-bindende half-well Platten, die dann verschlossen und über Nacht bei 4 ° C inkubiert ausplattiert Alternativ können viele Platten bei 37 ° C getrocknet werden und bei 4 ° C für eine spätere Verwendung, hängenING auf die Stabilität des Proteins. </li><li> REG3α Fängerantikörper wird nach Herstellerangaben Protokoll mit Hersteller-Beschichtungs-Puffer und 25 ul verdünnt werden in jede Vertiefung einer 384-well Nunc Maxi-Sorp Platte, die dann verschlossen und über Nacht bei 4 ° C inkubiert beschichtet werden </li></ol> 2. Experiment 1. Tag: IL-2Rα ELISA (Abbildung 1) <ol><li> Die IL-2Rα Testplatte gewaschen, mit BLOTTO in TBS, und die Standard-rekonstituiert wird und ein 8-Punkt-Standardkurve wird pro Hersteller-Protokoll vorbereitet. </li><li> Nach Waschen der Platte nach der Sperrung Schritt wird 50 ul unverdünntem Plasma im Duplikat aus der Quellenplatte zu der ELISA-Test Platte ausplattiert und 50 ul jeder Standard ist in zweifacher Ausfertigung ausplattiert. Die Platte wird verschlossen und inkubiert 2 h bei Raumtemperatur auf einem Rotator Platte bei 300 Upm eingestellt. </li><li> Das Plasma wird aus dem IL-2Rα ELISA Testplatte zurückgewonnen und wieder in die un platziertverdünnt Plasmaquelle Platte. Der ELISA ist je Hersteller-Protokoll (mit Volumina für half-well Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts Satzes um 450 bis 570 nm nicht beendet werden, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 3. Experiment Tag 1: REG3α ELISA (Abbildung 1) <ol><li> 10 ul unverdünnten Plasma wird mit einem separaten v-bottom Source-Platte übertragen werden. 90 ul Hersteller bereitgestellte Verdünnungspuffer in jede Vertiefung eine 1:10 Verdünnung Source-Platte erstellen hinzugefügt. </li><li> Die REG3α ELISA wird pro Hersteller-Protokoll durchgeführt (mit einem Volumen eingestellt für 384-Well-Platten) und die optische Dichte jeder Vertiefung liest mit einer Platte-Reader bei 450-620 nm, und die Daten werden gespeichert und analysiert werden. </li></ol> 4. Experiment Tag 1: Elafin und TNFR1 Prüfplatte Coating mit Capture Antikörper <ol><li> Elafin und TNFR1 Fänger-Antikörper werden rekonstituierte und dilausgeschüttet pro Hersteller Spezifikation und 50 ul wird in jede Vertiefung der 96-Well jeweiligen High-bindende half-well Platten, die dann verschlossen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert Elafin plattiert und bei 4 ° C für TNFR1. </li></ol> 5. Experiment Tag 1-2: HGF ELISA (Abbildung 1) <ol><li> Nach Abschluss der IL-2Rα ELISA und Sicherung der Test nicht wiederholt zu werden brauchen, werden mit 60 ul der unverdünnten Plasma zu einer neuen Quelle Platte übertragen und dann 60 ul 1% BSA in 1 x PBS zu jeder Vertiefung gegeben, um ein make 1:2 verdünnt Plasmaquelle Platte. </li><li> Die HGF Testplatte gewaschen, mit BLOTTO in TBS, und die Standard-rekonstituiert wird und ein 8-Punkt-Standardkurve wird pro Hersteller-Protokoll vorbereitet. </li><li> Nach Waschen der Platte nach der Sperrung Schritt wird 50 ul von 1:2 verdünntem Plasma in zweifacher Ausfertigung auf dem ELISA-Test Platte ausplattiert, und 50 ul jeden Standard wird in zweifacher Ausfertigung ausplattiert. Die Platte ist abgedichtet undüber Nacht bei Raumtemperatur auf einem Teller Rotator bei 300 RPM gesetzt inkubiert. </li><li> Die 1:2 verdünntes Plasma aus dem HGF ELISA Testplatte zurückgewonnen und wieder in den platziert 1:2 verdünntes Plasmaquelle Platte. Der ELISA ist je Hersteller-Protokoll (mit Volumina für half-well Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts Satzes um 450 bis 570 nm nicht beendet werden, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 6. Experiment Tag 2: Elafin ELISA <ol><li> 10 ul unverdünnten Plasma wird zu einer neuen Quelle Platte übertragen werden und dann 190 ul 1% BSA in 1 x PBS wird zu jedem Well hinzugefügt werden, um 200 ul von Plasma dluted 01.20 machen. </li><li> Die ELISA-Tests durchgeführt Elafin entsprechend Hersteller-Protokoll (mit Volumina eingestellt für Halb-Well-Platten), und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts auf 450-570 nm ist, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 7. Experiment Day 2: TNFR1 ELISA <ol><li> 25 ul 1% BSA in PBS wird dem 01.20 Geberplattenteil (jetzt mit 100 ul Plasma 1.20) zu 125 ul verdünnte 1.25 Plasma zu erhalten zugesetzt werden. </li><li> Der ELISA ist TNFR1 pro Hersteller-Protokoll abgeschlossen (mit Volumina für Halb-Well-Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts auf 450-570 nm ist, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> 8. Experiment Tag 2: IL-8 ELISA <ol><li> 60 ul von 1:2 verdünnte Plasma wird zu einer neuen Quelle Platte überführt und anschließend 180 ul IL-8 Verdünnungsmittel zu jeder Vertiefung zugegeben, um eine verdünnte 1.06 Plasmaquelle Platte zu machen. </li><li> Die IL-8 ELISA ist je Hersteller-Protokoll abgeschlossen (mit Volumina für Halb-Well-Platten eingestellt) und die optische Dichte eines jeden Wells liest unter Verwendung eines Plattenlesegeräts auf 450-570 nm ist, und die Daten gespeichert und analysiert. </li></ol> Sobald alle ELISAs abgeschlossen sind, Nichtbenutzungd Lager Plasma werden in die Aliquots aufgetaut ersetzt werden und zur späteren Verwendung eingefroren.

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	<li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+biomarker+panel+for+acute+graft-versus-host+disease.">A biomarker panel for acute graft-versus-host disease.</a> Blood. 113, 273-278 (2009).</li><li>Paczesny, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elafin+is+a+biomarker+of+graft-versus-host+disease+of+the+skin.">Elafin is a biomarker of graft-versus-host disease of the skin.</a> Science Translational Medicine. 2, 13ra12 (2010).</li><li>Ferrara, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+islet-derived+3+alpha+is+a+biomarker+of+gastrointestinal+graft-versus-host+disease.">Regenerating islet-derived 3 alpha is a biomarker of gastrointestinal graft-versus-host disease.</a> Blood. , (2011).</li><li>Ferrara, J. L., Levine, J. E., Reddy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graft-versus-host+disease.">Graft-versus-host disease.</a> Lancet. 373, 1550-1561 (2009).</li><li>Miyamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+concentration+of+the+soluble+interleukin-2+receptor+for+monitoring+acute+graft-versus-host+disease.">Serum concentration of the soluble interleukin-2 receptor for monitoring acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 17, 185-190 (1996).</li><li>Holler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+acute+graft-versus-host+disease+and+complications+following+allogeneic+bone+marrow+transplantation.">Role of tumor necrosis factor alpha in acute graft-versus-host disease and complications following allogeneic bone marrow transplantation.</a> Transplant. Proc. 25, 1234-1236 (1993).</li><li>Okamoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hepatocyte+growth+factor+in+serum+in+acute+graft-versus-host+disease.">Increased hepatocyte growth factor in serum in acute graft-versus-host disease.</a> Bone Marrow Transpl. 28, 197-200 (2001).</li><li>Uguccioni, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+interleukin-8+serum+concentrations+in+beta-thalassemia+and+graft-versus-host+disease.">Elevated interleukin-8 serum concentrations in beta-thalassemia and graft-versus-host disease.</a> Blood. 81, 2252-2256 (1993).</li><li>Osuchowski, M. F., Siddiqui, J., Copeland, S., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+ELISA+to+profile+multiple+cytokines+from+small+volumes.">Sequential ELISA to profile multiple cytokines from small volumes.</a> J. Immunol. Methods. 302, 172-181 (2005).</li><li>Osuchowski, M. F., Remick, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+repetitive+use+of+samples+to+measure+multiple+cytokines:+the+sequential+ELISA.">The repetitive use of samples to measure multiple cytokines: the sequential ELISA.</a> Methods. 38, 304-311 (2006).</li><li>Schweitzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+protein+profiling+on+microarrays+by+rolling-circle+amplification.">Multiplexed protein profiling on microarrays by rolling-circle amplification.</a> Nat. Biotechnol. 20, 359-365 (2002).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Die sequentielle ELISA hier vorgestellte Verfahren erlaubt eine Messung mehrerer Plasmaproteinen auf kleine Volumina von Plasma was schwierig sein kann zu erhalten, und / oder unersetzlichen wie Proben von Probanden mit der seltenen Erkrankungen oder Plasmaproben von Mäusen 9,10 erhalten. Die sequentiellen ELISAs werden typischerweise in der Reihenfolge der zunehmenden Plasmaverdünnung Faktor durchgeführt, mit ELISAs erfordern verdünnte Plasma ≥ 1:10 typischerweise nicht zu müssen aufgearbeitet werden, obwohl dies kann, falls gewünscht. Die Fähigkeit zur sequentiellen ELISA durchzuführen durch ELISA Kits / Protokolle in dem das Plasma mit anderen Reagenzien gemischt wird oder bei denen unterschiedliche Verdünnung Puffer für das Plasma benötigt begrenzt, dies schließt die ablility zur Wiederverwendung einer Probe aufgrund von Bedenken, dass eine inkompatible Puffer / Reagenz wird mit der Leistung eines bestimmten Tests stören. Bei sorgfältiger Planung kann 10 oder mehr ELISAs auf der gleichen Plasmaprobe durchgeführt werden. ent &quot;&gt; Individuelle Labors müssen möglicherweise Plasmaverdünnungen anzupassen, um interpretierbare Ergebnisse auf erwartete Plasma-Konzentrationen des Proteins von Interesse in den Proben aus der Probanden basiert. Unterschiede in der Laborausrüstung kann in der Notwendigkeit führen, um die Inkubation und kolorimetrischen Entwicklung zu optimieren Zeiten, Anzahl der Wäschen und / oder waschen Haltezeiten um jede gegebene ELISA optimieren. Um hohe Durchsatzleistung und die Genauigkeit zu erhöhen und eine Untersuchung in kostengünstiger Weise durchzuführen, ist die Verwendung eines robotischen Liquid Handling Plattform fähig Analyse auf 384 Well Platten und einem automatisierten Tellerscheibe mit Stapeleinheit empfohlen. Dieses Gerät kann die Genauigkeit und Präzision der Analyse von mehreren Benutzern durchgeführt und helfen Konsistenz der Analyse inter-und intra-Assay-Variation zu reduzieren. Wir verwendeten sequenziellen ELISA über verfügbare Multiplex-Plattformen für zwei Gründe: 1) Die meisten derAntikörper-Paare für neue Proteine ​​können nicht leicht konjugiert werden auf Kügelchen oder einem anderen Material als auch zeitaufwendig und teuer, 2) einzelne ELISAs sind genauer als Multiplex-Mikroarray oder Kügelchen, sekundär zu einer Abwesenheit von Kreuzreaktivität 11. Wenn eine zuverlässige Methode hergestellt in gemultiplexte, wulst-basierten Microarrays durchzuführen, kann es in der Lage sein, um die sequentielle ELISA-Verfahren zu ersetzen, sondern kann durch die Möglichkeit, die Antikörper an Kügelchen und / oder konjugiert mit der Anzahl der gewünschten Proteine ​​zu begrenzen analysiert.

Akute Graft-versus-Host-Krankheit (GVHD), eine führende Ursache von Nicht-Rückfall Mortalität (NRM) nach allogener Stammzelltransplantation (HSCT), wird durch eine Dysfunktion in drei Organsysteme gemessen: die Haut, Leber und Magen-Darm-(GI) Trakt 4. Akute GvHD tritt typischerweise zwischen zwei und acht Wochen nach der Transplantation kann aber später auftreten und ist oft klinisch nicht von anderen post-HSCT Komplikationen wie Konditionierung Toxizität, Infektionen oder Medikamente Nebenwirkungen. Durch den Einsatz von Proteom Strategien und Hochdurchsatz-Validierung mit sequentiellen ELISA haben wir 6 Proteine, deren Konzentrationen an dem Einsetzen der klinischen Manifestationen von GVHD erhöht identifiziert. IL-2Rα, TNFR1, HGF und IL-8, wenn sie in einem 4-Biomarker-Panel kombiniert werden zu Beginn der klinischen Symptome GVHD zu diagnostizieren und kann post-HSCT Überleben unabhängig von GVHD Schweregrad 1 vorherzusagen. Elafin, ein Biomarker für GVHD der skin, zwischen GVHD Ausschlag und Ausschlag von anderen Ursachen wie Arzneimittelexantheme diskriminieren und Transplantation das Überleben 2 vorherzusagen. Wir haben vor kurzem identifizierten REG3α als Biomarker von GVHD des unteren Gastrointestinaltrakt, das Zielorgan meisten mit NRM verbunden. Plasma REG3α Konzentration zuverlässig zu identifizieren GVHD als Ursache für post-HSCT Durchfall und korrelieren mit histologischen Schwere der GvHD auf diagnostische Darmbiopsien. REG3α Konzentrationen an GI GVHD Ausbruch kann auch vorhersagen, Reaktionsfähigkeit auf GVHD Therapie und NRM 3. Der Einbau dieser validierten GVHD Biomarker in der klinischen Versorgung wird derzeit in klinischen Studien untersucht. Diese Experimente wurden auf kleinen Plasma-Aliquots von Patienten HSCT zwischen 2000 und 2010 bei der GVHD Auftreten, die unersetzlich und von begrenzter Menge sind gesammelt wurden. Aufgrund der wertvollen Natur dieser Proben haben wir eine met entwickelthod der Messung mehrere Plasma-Protein-Konzentrationen in einer effizienten, reproduzierbar, um überschüssige Gefrier-Auftau-Zyklen, Auftauzeit und Plasma Nutzung zu beseitigen. Diese Technik kann angewendet ELISAs für mehrere Proteine ​​/ Zytokine von Interesse an der gleichen Probe durchzuführen (e) sofern die Proben müssen nicht mit anderen Reagenzien gemischt werden. Wenn ELISA Kits nicht mit Pre-beschichtete Platten, 96-well half-well Platten oder 384-Well-Platten kommst können zur weiteren Reduzierung der Verwendung von Proben / Reagenzien werden. Dieses Manuskript konzentriert sich auf die technologischen Aspekte der Messung von GVHD Biomarkern.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Menschliches IL-2 R alpha Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY223 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche HGF Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY294 </td><td></td></tr><tr><td> Human IL-8 OptEIA KIT II </td><td> Becton Dickinson </td><td> 550999 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match ASSEMBLY Menschliche PAP1 (REG3α) Kit </td><td> MBL International </td><td> 5323 </td><td></td></tr><tr><td> Ab-Match UNIVERSAL Kit </td><td> MBL International </td><td> 5310 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche sTNFRI/TNFRSF1A Duoset </td><td> R &amp; D Systems </td><td> DY225 </td><td></td></tr><tr><td> Menschliche Trappin-2/Elafin Duoset </td><td> R &amp; D Systammt </td><td> DY1747 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Polystyrol konischen Boden Platten </td><td> Thermo Scientific </td><td> 249570 </td><td> Wird für Plasmaquelle Platten </td></tr><tr><td> Costar half-well high-bindenden 96-Well-Platten </td><td> Corning </td><td> 3690 </td><td> Für IL-2Rα, HGF, TNFR1 und Elafin ELISAs </td></tr><tr><td> Nunc 384-well Platten MaxiSorp </td><td> Nunc </td><td> 464718 </td><td> Für REG3α Elisa </td></tr><tr><td> HyClone Phosphate Buffered Saline, 1x </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30256.02 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin, Fraktion V, Heat Shock Behandelte </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP1600-100 </td><td></td></tr><tr><td> Blocker BLOTTO in TBS </td><td> Thermo Scientific </td><td> 37530 </td><td> Blockierungsmittel für IL-2Rα HGF und TNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> DulbeccosPhosphat-gepufferte Kochsalzlösung </td><td> Gibco </td><td> 21600-069 </td><td> Waschpuffer für IL-2Rα, HGF, Elafin und TNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> TMB Peroxide Susbtrate </td><td> Kirkegaard und Perry Laboratories </td><td> 50-76-00 </td><td></td></tr><tr><td> Tween 20 </td><td> Acros Organics </td><td> 233362500 </td><td> Waschpuffer für IL-2Rα, HGF, Elafin und TNFR1 ELISAs </td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84720 </td><td> (Verdünnt auf 2N) für Stop-Lösung </td></tr></tbody></table>

high throughput sequential elisa for validation of biomarkers of acute graft-versus-host disease

Unvoreingenommene Entdeckung Proteomics-Strategien haben das Potenzial, eine große Zahl von neuen Biomarkern, die diagnostische und prognostische Tests in einem klinischen Umfeld zu verbessern und kann möglicherweise Guide therapeutische Interventionen zu identifizieren. Wenn eine große Zahl von Kandidaten Proteine ​​identifiziert werden, kann es schwierig sein, Biomarker-Kandidaten in einer zeitgerechten und effizienten Weise aus Patientenplasmaproben, die event-driven, der Finite-Volumen-und unersetzlich sind, wie zu Beginn der akuten validieren Graft-versus- host disease (GVHD), eine potenziell lebensbedrohliche Komplikation der allogenen hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT). Hier beschreiben wir die Verfahren zur Durchführung der im Handel erhältlichen ELISA-Tests für sechs validiert GVHD Proteine: IL-2Rα 5, 6 TNFR1, HGF 7, IL-8 8, Elafin 2 und REG3α 3 (auch als PAP1 bekannt) in einer sequentiellen Weise zu minimieren Frost-Tau-Zyklen, Aufgetaut Plasma-Zeit und Plasma-Nutzung. Bei diesem Verfahren führen wir die ELISAs in Reihenfolge wie Probenverdünnungsfaktor bestimmt, wie in unserem Labor mit der Hersteller ELISA Kits und Protokolle mit geringfügigen Anpassungen, um eine optimale sequentielle ELISA Leistung erleichtert wird. Die resultierende Plasma-Biomarker-Konzentrationen können dann zusammengestellt und analysiert werden signifikante Ergebnisse innerhalb einer Patientengruppe. Während diese Biomarker derzeit nur für Forschungszwecke, wird ihre Einbeziehung in klinische Versorgung derzeit in klinischen Studien untersucht. Diese Technik kann angewendet ELISAs für mehrere Proteine ​​/ Zytokine von Interesse an der gleichen Probe durchzuführen (e) sofern die Proben müssen nicht mit anderen Reagenzien gemischt werden. Wenn ELISA Kits nicht mit Pre-beschichtete Platten, 96-well half-well Platten oder 384-Well-Platten kommst können zur weiteren Reduzierung der Verwendung von Proben / Reagenzien werden.

<html> Der Biomarker Workflow und Timeline sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 aufgeführt sind. Einmal vollendet, Konzentrationen von 6 verschiedenen Proteinen sind jetzt auf dem gleichen Plasmaprobe quantifiziert worden mit insgesamt 150 ul des Plasmas. Ausplattieren der Proben im Doppelansatz pro Test ermöglicht für die interne Qualitätssicherung, mit CV weniger als 10% als optimal. Wenn die Durchführung der sequenziellen ELISA auf mehreren Platten, konsistente optische Dichten von dem hohen Standard bevorzugt und ermöglichen eine bessere inter-Platte Zuverlässigkeit der Messungen; Standardkurve ODs können zwischen den Platten verglichen werden, um zu sehen zu beurteilen für Inkonsistenz in ELISA Leistung (Abbildung 2). Entwicklungszeiten mit Tetramethylbenzidin kolorimetrischen Substrat und hohe Konzentration ODs beobachtet für jede Biomarker in unserem Labor sind in Tabelle 3 aufgeführt. tp_upload/4247/4247fig1.jpg &quot;alt =&quot; Abbildung 1 &quot;/&gt; Abbildung 1. Workflow für IL-2Rα, REG3α und HGF ELISAs. Nachdem die Plasmaproben auf die IL-2Rα ELISA Testplatten überzogen worden sind sie zurückgefordert zu einer Verwässerung Quelle Platten für andere ELISAs machen. Für die HGF ELISA wird das Plasma zurückgefordert, um die 1:6 Verdünnung Platte für IL-8 vorzubereiten. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4247/4247fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung</a> . <img src="/files/ftp_upload/4247/4247fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. Optische Dichten für die Standardkurve von 7 verschiedenen ELISA-Platten messen REG3α Konzentrationen entsprechend den 1084 Patienten für die erste REG3α GI GVHD Biomarker Bericht 3 getestet. Konsequente ODs zwischen den Platten zu gewährleisten konsistente Proteinkonzentration Messungen zwischen den Platten. Konzentrationen von Proteinenin Plasmaproben Probe durch Vergleichen der optischen Dichten Standardkurve optischen Dichten berechnet. <table border="1"><tbody><tr><td> Experiment Tag 0 </td><td> Ein. Bereiten Sie die Proben </td></tr><tr><td></td><td> 2. IL-2Rα, HGF und REG3α capture Ab </td></tr><tr><td> Experiment Tag 1 </td><td> Ein. IL-2RαELISA </td></tr><tr><td></td><td> 2. REG3αELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. HGF ELISA (durch die Probe plating) </td></tr><tr><td></td><td> 4. Elafin und TNFR capture Ab </td></tr><tr><td> Experiment Tag 2 </td><td> Ein. HGF ELISA Abschluss </td></tr><tr><td></td><td> 2. Elafin ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 3. TNFR1 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 4. IL-8 ELISA </td></tr><tr><td></td><td> 5. Auffrieren ungenutztenPlasma </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. GVHD Biomarker Workflow-Übersicht <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Tag 0 </td><td colspan="3"> Probenvorbereitung und Übernachtung capture Körper Inkubationszeit </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> ELISA </td><td> IL-2Rα </td><td> REG3α </td><td> HGF </td><td> Elafin </td><td> TNFR1 </td><td> IL-8 </td></tr><tr><td> Zeit (hr) </td><td> 0,0 </td><td> Blockierung </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td> Proben Plated </td><td></td><td></td><td></td><td></td> &lt;td&gt; </td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td> Reclaim Plasmaproben; Erkennung Ab </td><td> Blocking; Prepare Samples (1:10 Verdünnung) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td> Proben plated (1:10) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td> Streptavidin-HRP </td><td> Erkennung Ab </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td> TMB </td><td> Streptavidin-HRP </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td> Platte Lesen </td><td> TMB </td><td> Blocking; Prepare Proben (1:2 Verdünnung) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,5 </td><td></td><td> Platte Lesen </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td> Proben plated (1:2) </td><td> Erfassen Ab (Inkubation über Nacht) </td><td> Erfassen Ab (Inkubation über Nacht) </td><td></td></tr><tr><td> Tag 2 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Zeit (hr) </td><td> 0,0 </td><td></td><td></td><td> Reclaim Plasma-Erkennung Ab </td><td> Blocking; Prepare Proben (1:20) </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 1,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Beispiel plating (1:2) </td><td> Blocking; weitere Verdünnung von 1:20 Proben bis 1:25 Verdünnung </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,0 </td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td> Beispiel plating (1:25) </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 2,5 </td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,0 </td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td><td> Erkennung Ab </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Bereiten Sie die Proben (1:6 Verdünnung) </td></tr><tr><td></td><td> 4,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Erkennung Ab </td><td> Beispiel plating (1:6) </td></tr><tr><td></td><td> 5,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> HRP </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5,5 </td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 6,0 </td><td></td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td&gt; <td> HRP </td><td> Erkennung Ab </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> TMB </td><td></td></tr><tr><td></td><td> 7,0 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td><td> TMB </td></tr><tr><td></td><td> 7,5 </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> Platte Lesen </td></tr><tr><td colspan="2"> Nach Beendigung </td><td colspan="6"> Ersetzen Source Plasma in Aliquots und einfrieren für eine spätere Verwendung </td></tr></tbody></table> Tabelle 2. Zeitplan für die Durchführung ELISAs. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Plasma Verdünnungsfaktor </td><td> High Standard Concentration </td><td> Substrat Entwicklungszeit (min) </td><td> Hohe OD </td><td> Kurve </td></tr><tr><td> IL-2Rα </td><td> 01.01 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 5 </td><td> 1 </td><td> Linear </td></tr><tr><td> HGF </td><td> 01.02 </td><td> 4.000 pg / ml </td><td> 22 </td><td> 2,1 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> IL-8 </td><td> 01.06 </td><td> 200 pg / ml </td><td> 12 </td><td> 2,7 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> REG3α </td><td> 01.10 </td><td> 100 ng / ml </td><td> 12 </td><td> 1,7 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> Elafin </td><td> 01.20 </td><td> 2000 pg / ml </td><td> 20 </td><td> 1,9 </td><td> 4-Parameter </td></tr><tr><td> TNFR1 </td><td> 01.25 </td><td> 800 pg / ml </td><td> 8 </td><td> 2,7 </td><td> Linear </td></tr></tbody></table> Tabelle 3. ELISA Details für 6 GVHD Biomarker.

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High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

Hoher Durchsatz Validierung mehrerer Biomarker-Kandidaten können durch sequentielle ELISA durchgeführt werden, um Einfrieren / Auftauen zu minimieren und die Nutzung von wertvollen Plasmaproben. Hier zeigen wir, wie man nacheinander durchführen ELISAs für sechs verschiedene validierte Plasma-Biomarker<sup&gt; 1-3</sup&gt; Of graft-versus-host disease (GVHD)<sup&gt; 4</sup&gt; Auf dem gleichen Plasmaprobe.

High Throughput Sequential ELISA zur Validierung von Biomarkern des akuten Graft-Versus-Host Disease

Unbiased discovery proteomics strategies have  the potential to identify large numbers of novel biomarkers that can improve  diagnostic and prognostic ...

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Medicine

15.7K Aufrufe.  University of Michigan. Hoher Durchsatz Validierung mehrerer Biomarker-Kandidaten können durch sequentielle ELISA durchgeführt werden, um Einfrieren / Auftauen zu minimieren und die Nutzung von wertvollen Plasmaproben. Hier zeigen wir, wie man nacheinander durchführen ELISAs für sechs verschiedene validierte Plasma-Biomarker 1-3 Of graft-versus-host disease (GVHD) 4 Auf dem gleichen Plasmaprobe.

Serie: High Throughput Sequential ELISA for Validation of Biomarkers of Acute Graft-Versus-Host Disease

A High-throughput Automated Platform for the Development of Manufacturing Cell Lines for Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing requirement for drug supplies. The generation of production cell lines has traditionally involved manual operations that are labor-intensive, low-throughput and vulnerable to human errors. We report here an integrated high-throughput and automated platform for development of manufacturing cell lines for the production of protein therapeutics.
The combination of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has enabled a high-throughput and more efficient cell line development process. In this operation, production host cells are first transfected with an expression vector carrying the gene of interest 1, followed by the treatment with a selection agent. The stably-transfected cells are then stained with fluorescence-labeled anti-human IgG antibody, and are subsequently subject to flow cytometry analysis 2-4. Highly productive cells are selected based on fluorescence intensity and are isolated by single-cell sorting on a BD FACSAria. Colony formation from single-cell stage was detected microscopically and a series of time-laps digital images are taken by CloneSelect Imager for the documentation of cell line history. After single clones have formed, these clones were screened for productivity by ELISA performed on a TECAN Freedom EVO liquid handling system. Approximately 2,000 - 10,000 clones can be screened per operation cycle with the current system setup.
This integrated approach has been used to generate high producing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines for the production of therapeutic monoclonal antibody (mAb) as well as their fusion proteins. With the aid of different types of detecting probes, the method can be used for developing other protein therapeutics or be applied to other production host systems. Comparing to the traditional manual procedure, this automated platform demonstrated advantages of significantly increased capacity, ensured clonality, traceability in cell line history with electronic documentation and much reduced opportunity in operator error.

A high-throughput, automated platform of manufacturing cell line development for producing protein therapeutics is described. Implementation of BD FACS Aria Cell Sorter, CloneSelect Imager and TECAN Freedom EVO liquid handling system has demonstrated significantly increased processing capacity in cell line development with improved cell line quality and high reproducibility.

Ein automatisiertes Hochdurchsatz-Plattform für die Entwicklung von Manufacturing Zelllinien für Protein Therapeutics

The fast-growing biopharmaceutical industry demands speedy development of highly efficient and reliable production systems to meet the increasing ...

Forschung

Medizin

Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular degeneration, photoreceptor degeneration, cataract, glaucoma, retinoblastoma, and diabetic retinopathy have been recapitulated in transgenic mice.1-5 Most transgenic and knockout mice have been generated by laboratories to study non-ophthalmic diseases, but genetic conservation between organ systems suggests that many of the same genes may also play a role in ocular development and disease. Hence, these mice represent an important resource for discovering new genotype-phenotype correlations in the eye. Because these mice are scattered across the globe, it is difficult to acquire, maintain, and phenotype them in an efficient, cost-effective manner. Thus, most high-throughput ophthalmic phenotyping screens are restricted to a few locations that require on-site, ophthalmic expertise to examine eyes in live mice. 6-9 An alternative approach developed by our laboratory is a method for remote tissue-acquisition that can be used in large or small-scale surveys of transgenic mouse eyes. Standardized procedures for video-based surgical skill transfer, tissue fixation, and shipping allow any lab to collect whole eyes from mutant animals and send them for molecular and morphological phenotyping. In this video article, we present techniques to enucleate and transfer both unfixed and perfusion fixed mouse eyes for remote phenotyping analyses.

The dissection technique illustrates enucleation of the mouse eye for tissue fixation to perform phenotyping in high-throughput screens.

Maus Eye Enukleation für Remote High-throughput Phänotypisierung

The mouse eye is an important genetic model for the translational study of human ophthalmic disease. Blinding diseases in humans, such as macular ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequentiell<em&gt; In-vivo-</em&gt; Imaging von osteogenen Stammzellen / Vorläuferzellen während Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Minimal-invasive chirurgische Verfahren zur Induktion Myokardinfarkt in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to develop strategies for treating a variety of diseases. The purpose of this study was to develop and characterize MSCs as cellular vehicles engineered for delivery of therapeutic factors as part of a neuroprotective strategy for rescuing the damaged or diseased nervous system. In this study we used mouse MSCs that were genetically modified using lentiviral vectors, which encoded brain-derived neurotrophic factor (BDNF) or glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF), together with green fluorescent protein (GFP). 
Before proceeding with in vivo transplant studies it was important to characterize the engineered cells to determine whether or not the genetic modification altered aspects of normal cell behavior. Different culture substrates were examined for their ability to support cell adhesion, proliferation, survival, and cell migration of the four subpopulations of engineered MSCs. High content screening (HCS) was conducted and image analysis performed. 
Substrates examined included: poly-L-lysine, fibronectin, collagen type I, laminin, entactin-collagen IV-laminin (ECL). Ki67 immunolabeling was used to investigate cell proliferation and Propidium Iodide staining was used to investigate cell viability. Time-lapse imaging was conducted using a transmitted light/environmental chamber system on the high content screening system.
Our results demonstrated that the different subpopulations of the genetically modified MSCs displayed similar behaviors that were in general comparable to that of the original, non-modified MSCs. The influence of different culture substrates on cell growth and cell migration was not dramatically different between groups comparing the different MSC subtypes, as well as culture substrates. 
This study provides an experimental strategy to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

This study describes an experimental platform to rapidly characterize engineered stem cells and their behaviors before their application in long-term in vivo transplant studies for nervous system rescue and repair.

Hochdurchsatz-Charakterisierung von adulten Stammzellen für die Zuführung von therapeutischen Faktoren für neuroprotektive Strategien Engineered

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in experimental models of synucleopathies. A transgenic mouse line (M83) over-expressing the human A53T &#945;S and spontaneously developing a dramatic clinical phenotype between eight and 22 months of age, characterized by symptoms including weight loss, prostration, and severe motor impairment, was used in this study. For molecular analyses of &#945;SD (disease-associated &#945;S) in these mice, an ELISA was designed to specifically quantify &#945;SD in sick mice. Analysis of the central nervous system in this mouse model showed the presence of &#945;SD mainly in the caudal brain regions and the spinal cord. There were no differences in &#945;SD distribution between different experimental conditions leading to clinical disease, i.e., in uninoculated and normally aging transgenic mice and in mice inoculated with brain extracts from sick mice. The specific detection of &#945;SD immunoreactivity using an antibody against Ser129 phosphorylated &#945;S by ELISA essentially correlated with that obtained by Western blot and immunohistochemistry. Unexpectedly, similar results were observed with several other antibodies against the C-terminal part of &#945;S. The propagation of &#945;SD, suggesting the involvement of a &#8220;prion-like&#8221; mechanism, can thus be easily monitored and quantified in this mouse model using an ELISA approach.

Detection of Disease-associated &amp;#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &amp;#945;-synuclein

An ELISA offering a novel quantitative approach is described. It specifically detects disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) in a transgenic mouse model (M83) of synucleinopathy using several antibodies against either the Ser129 phosphorylated &#945;S form or the C-terminal part of the protein.

Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein durch verbesserte ELISA im Gehirn von transgenen Mäusen Expression Menschen A53T Mutierte α-Synuclein

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

An Organotypic High Throughput System for Characterization of Drug Sensitivity of Primary Multiple Myeloma Cells

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and heterogeneity of patient-derived multiple myeloma (MM) cells. This approach consists in seeding primary MM cells freshly extracted from bone marrow aspirates into microfluidic chambers implemented in multi-well plates, each consisting of a reconstruction of the bone marrow microenvironment, including extracellular matrix (collagen or basement membrane matrix) and stroma (patient-derived mesenchymal stem cells) or human-derived endothelial cells (HUVECs). The chambers are drugged with different agents and concentrations, and are imaged sequentially for 96 hr through bright field microscopy, in a motorized microscope equipped with a digital camera. Digital image analysis software detects live and dead cells from presence or absence of membrane motion, and generates curves of change in viability as a function of drug concentration and exposure time. We use a computational model to determine the parameters of chemosensitivity of the tumor population to each drug, as well as the number of sub-populations present as a measure of tumor heterogeneity. These patient-tailored models can then be used to simulate therapeutic regimens and estimate clinical response.

We describe a high-throughput drug sensitivity assay for primary multiple myeloma cells. It consists of a reconstruction of the bone marrow microenvironment (including extracellular matrix and stroma) in multi-well plates, and a non-invasive method for longitudinal quantification of cell viability.

Ein organ High Throughput-System zur Charakterisierung von Arzneimittelempfindlichkeit von Primary Multiple Myelomzellen

In this work we describe a novel approach that combines ex vivo drug sensitivity assays and digital image analysis to estimate chemosensitivity and ...

A High Throughput, Multiplexed and Targeted Proteomic CSF Assay to Quantify Neurodegenerative Biomarkers and Apolipoprotein E Isoforms Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be important in the development of future novel therapies. Often&#160;potential new biomarkers do not make it&#160;into the clinic&#160;due to limitations&#160;in their development and&#160;high costs.&#160;However,&#160;targeted proteomics using Multiple Reaction Monitoring Liquid Chromatography-tandem/Mass Spectrometry (MRM LC-MS/MS), specifically using triple quadrupole mass spectrometers, is one method that can be used to rapidly evaluate and validate biomarkers&#160;for clinical translation into diagnostic laboratories. Traditionally, this platform has been used extensively for measurement of small molecules&#160;in clinical laboratories, but it is the potential to analyze proteins, that makes it an attractive alternative to ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)-based methods. We describe here how targeted proteomics can be used to measure multiplexed markers of dementia, including the detection and quantitation of the known risk factor apolipoprotein E isoform 4 (ApoE4).
In order to make the assay suitable for translation, it is designed to be rapid, simple, highly specific and cost effective. To achieve this, every step in the development of the assay must be optimized for the individual proteins and tissues they are analyzed in. This method describes a typical workflow including various tips and tricks to developing a targeted proteomics MRM LC-MS/MS for translation.
The method development is optimized using custom synthesized versions of tryptic quantotypic peptides, which calibrate&#160;the MS for detection and then spiked into CSF to determine correct identification of the endogenous peptide in the chromatographic separation prior to analysis in the MS. To achieve absolute quantitation, stable isotope-labeled internal standard versions of the peptides with short amino acid sequence tags and containing a trypsin cleavage site, are included in the assay.

We describe a high-throughput, multiplex, and targeted proteomic cerebrospinal fluid (CSF) assay developed with potential for clinical translation. The test can quantitate potential markers and risk factors for neurodegeneration, such as the apolipoprotein E variants (E2, E3 and E4), and measure their allelic expression.

Ein hoher Durchsatz, Multiplexed und Proteom-CSF-Assay Gezielte Quantifizieren Neurodegenerative Biomarkers und Apolipoprotein E Isoformen-Status

Many neurodegenerative diseases are&#160;still lacking effective treatments. Reliable biomarkers for identifying and classifying these diseases will be ...

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test (OGTT) and Insulin Tolerance Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to insulin-stimulated glucose uptake and a gross decompensation of systemic glucose metabolism. Despite considerable progress in the understanding of glucose metabolism, the molecular mechanisms of its regulation in health and disease remain under-investigated, while novel approaches to prevent and treat diabetes are urgently needed. Diet derived glucose stimulates the pancreatic secretion of insulin, which serves as the principal regulator of cellular anabolic processes during the fed-state and thus balances blood glucose levels to maintain systemic energy status. Chronic overfeeding triggers meta-inflammation, which leads to alterations in peripheral insulin receptor-associated signaling and thus reduces the sensitivity to insulin-mediated glucose disposal. These events ultimately result in elevated fasting glucose and insulin levels as well as a reduction in glucose tolerance, which in turn serve as important indicators of insulin resistance. Here, we present a protocol for the generation and metabolic characterization of high-fat diet (HFD)-fed mice as a frequently used model of diet-induced insulin resistance. We illustrate in detail the oral glucose tolerance test (OGTT), which monitors the peripheral disposal of an orally administered glucose load and insulin secretion over time. Additionally, we present a protocol for the insulin tolerance test (ITT) to monitor whole-body insulin action. Together, these methods and their downstream applications represent powerful tools to characterize the general metabolic phenotype of mice as well as to specifically assess alterations in glucose metabolism. They may be especially useful in the broad research field of insulin resistance, diabetes and obesity to provide a better understanding of pathogenesis as well as to test the effects of therapeutic interventions.

Study of In Vivo Glucose Metabolism in High-fat Diet-fed Mice Using Oral Glucose Tolerance Test OGTT and Insulin Tolerance Test ITT

The current article describes the generation and metabolic characterization of high-fat diet-fed mice as a model of diet-induced insulin resistance and obesity. It further features detailed protocols to perform the oral glucose tolerance test and the insulin tolerance test, monitoring whole-body alterations of glucose metabolism in vivo.

Studie von In Vivo Metabolismus von Glukose in fettreichen Diät gefüttert Mäuse mit oralen Glukosetoleranztest (OGTT) und Insulin-Toleranz-Test (ITT)

Obesity represents the most important single risk factor in the pathogenesis of type 2 diabetes, a disease which is characterized by a resistance to ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Digitale PCR zur Quantifizierung der zirkulierenden MicroRNAs in akuten Myokardinfarkt und kardiovaskulären Erkrankungen

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...