This research was supported in part by NSF grant CHE-1229562 (VDGM), the Office of Undergraduate Research at Elon University, the Elon Chemistry Department, and the Elon Lumen Prize (TL and TAD), the Elon College Fellows Program (JAC), and the Elon College Honors Program (TAD).

Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren. 1. Modelle zur Untersuchung <ol><li> Zellkultur <ol><li> Pflege der menschlichen embryonalen Nierenzellen (HEK-T293) Zellen in DMEM mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum, 1% Penicillin-Streptomycin und 1% L-Glutamin ergänzt, bei 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> Wachsen Zellen in T75-Flaschen und lassen Sie sie 90% Konfluenz erreichen. </li><li> Durchführung Zellteilung über Trypsinisierung (0,25% Trypsin-EDTA) für 3-5 Minuten bei 37 ° C in 5% CO 2 </sub&gt; Inaktivierung von Trypsin mit gleichen Volumen von Zellmedium und Zentrifugation der Zellen 5 min bei 700 × g bei 4 ° C. </li><li> Saugen Sie die Medien und Zellpellet in Kulturmedien. </li><li> Samenzellen in der entsprechenden Kolben oder der Platte 7 × 10 4 Zellen in einer T75-Flasche 48 Stunden vor der Behandlung Zytokin. Dies sollte bei der Behandlung zu geben ~ 70% Dichte. </li><li> Serum verhungern Zellen 24 h später durch Ansaugen der Medien und mit dem gleichen Volumen von Serum-freien Medien (DMEM, steril) ersetzen. </li><li> Bereiten TNF-α, IL1-β und IFN-γ aus lyophilisierten Pulvers mit ultrareinem Wasser bei Arbeitskonzentrationen von 5 pg / ul, 10 ng / &amp; mgr; l, und 10 ng / ul, jeweils und sie in die Vertiefungen / Kolben. </li><li> Treat Serum ausgehungert Zellen durch die Zugabe von solubilisiertem Cytokine direkt an den Zellkulturmedien der entsprechenden Kolben. Die Behandlungen bestanden aus einzelnen Cytokine, einen Cocktail aus allen 3 (bezeichnet als &quot;* 3&quot;) oder sterile Wasser als Kontrolle (als &quot;0&quot; bezeichnet). </li><li> Vor Beurteilung und Ernte inkubieren behandelten Zellen für 24, 48 oder 72 Std. </li></ol></li><li> Die Lebensfähigkeit der Zellen Bewertung <ol><li> Eine 5 mg / ml Lösung von 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) in 1x PBS. </li><li> Für 12-Well-Platten, fügen Sie 100 ul der MTT-Lösung in jede Vertiefung und leicht schwenken, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Platten für 15 min-1 h bei 37 ° C in 5% CO 2, und prüfen unter einem Mikroskop auf die Anwesenheit von Purpurfärbung. Wenn keine vorhanden ist lila, wirbeln wieder und erlauben Zellen in 5-Minuten-Intervallen inkubieren, bis lila beobachtet. Die Menge an Zeit, die notwendig ist, indem jeder Untersuchenden bestimmt werden. </li><li> Mit einem Wiederholungspipette 700 ul der MTT Lösungsmittel (4 mM HCl und 0,1% NP40 in Isopropanol) in jede Vertiefung und Rock die Platte (n) bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten, oder bis alle lila Farbe hatten die Zellen links . Wenn lilaFarbe nicht aus den Zellen kommen, fügen Sie zusätzliche 200 ul des Lösungsmittels und weiter zu wirbeln. </li><li> Für die Analyse nehmen 100 ul aus jeder Vertiefung und in einen 96-Lochplatte und auf einem Plattenlesegerät mit 570 nm und einer Referenzwellenlänge von 630 nm, 595 nm jedoch auch so lange akzeptabel, da Messwerte werden auf konsistente Einstellungen übernommen. </li></ol></li><li> Tiermodell der ALS <ol><li> Alle Tierversuchen entsprach National Institutes of Health Leitlinien und wurden von der Wake Forest University Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. Brutpaare für SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] Maus-Modell wurden von The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Nicht-transgenen Wildtyp (WT) Frauen und Männer SOD1G93A [B6SJL-TgN (SOD1-G93A) 1Gur] wurden gezüchtet, um SOD1G93A Mäusen und nicht transgenen WT Geschwistern, die in den Experimenten verwendet wurden zu generieren. </li><li> Führen Sie die Genotypisierung mit Standard Primer gegen mutierte SOD1 25. </li></ol></li></ol> 2. Isolierung von Mitochondrien HINWEIS: Es ist wichtig, schnell zu arbeiten und alles auf Eis zu halten während des gesamten Verfahrens. <ol><li> Vorbereitung der mitochondrialen Isolierungspuffer (MIB), Rückenmark Isolierungspuffer (SC MIB) und experimentellen Puffer (EB) <ol><li> Die folgenden Stammlösungen vorbereitet vor der Zeit für MIB und EB. </li><li> Auffüllen auf 1 M Tris / MOPS durch Lösen 12,1 g Tris-Base in 70 ml H 2 O. In trockenen MOPS pH 7,4 erhalten. Stellen Sie die Lautstärke auf 100 ml endgültig. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C. </li><li> Auffüllen auf 1 M Kphos durch Mischen von 80,2 ml der K 2 HPO 4 und 19,8 ml KH 2 PO 4. Lagerung bei Raumtemperatur. </li><li> Make 0,2 M EGTA / Tris durch Zugabe von 3,8 g von EGTA zu 10 ml H 2 O. 1 M Tris / MOPS bis gelöst, ~ 30-40 ml. Passen Sie bis 50 ml, Sterilfilter und bei Raumtemperatur lagern. Man beachte, dass der pH-Wert wird ~ 6,7. </li><li> Stellen Sie 1 M Glutamat, indem 10 ml1 M Lösung von Glutaminsäure. Filter zu sterilisieren und zu speichern 4 ° C. </li><li> Auffüllen auf 1 M Malate, indem 10 ml einer 1 M Lösung von Äpfelsäure. Hinzufügen Tris / MOPS 50 mM. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C. </li><li> Make MIB in einer Konzentration von 200 mM Saccharose, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, und 1 mM EGTA / Tris. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C. </li><li> Make SC MIB in einer Konzentration von 250 mM Saccharose, 20 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM DTT und Proteaseinhibitor-Cocktail. </li><li> Make EB in einer Konzentration von 125 mM KCl, 10 mM Tris / MOPS, pH 7,4, 5 mM Glutamat, 2,5 mM Malat, 1 mM K-Phosphat, pH 7,4, und 10 mM EGTA / Tris. Filter zu sterilisieren und bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Ausrüstung Vorbereitung vor der Ernten der Zellen. <ol><li> Spülen Sie ein kleines Glasgefäß und Homogenisierung Stößel dreimal mit sterilem Wasser und setzen auf Eis. </li><li> Gather notwendigen Gegenstände wie ein Standard-Bohrmaschine, Zell scraPersonen, 1,5 ml, 15 ml und 50 ml-Röhrchen und Lösungen. </li></ol></li><li> Mitochondrien Isolation <ol><li> Kultivierten Zellen <ol><li> Für jeden Probentyp, verwenden Sie zwei T175-Flaschen von Zellen. </li><li> Sicherzustellen, dass die Zelle in ~ 90% konfluent und Verwendung in Kontrollversuchen oder Platte und zu behandeln, wie oben in Schritt 1.2 beschrieben. </li><li> Auf der Tischplatte, absaugen Medien und waschen Sie die anhaftenden Zellen zweimal mit 15 ml 1x PBS jeder Zeit. </li><li> Saugt den Puffer und schaben Kolben die anhaftenden Zellen vom Boden des Kolbens zu entfernen. </li><li> 15 ml 1x PBS in jeden Kolben, Wirbel, und übertragen auf einzelne 15 ml konische Röhrchen und auf Eis. </li><li> Sobald Kratzen wird, Zentrifuge die Röhrchen für 5 Minuten bei 700 × g, 4 ° C durchgeführt unter Verwendung einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor. </li><li> Aspirat Ständen und Resuspendieren jedes Pellet in 1 ml MIB. </li><li> Kombinieren Sie beide Suspensionen und Transfer zu einem kleinen Glasgefäß zur Homogenisierung. </li><li> Fügen MIBzu dem Behälter, bis Puffer erreicht die erste Zeile. Homogenisieren Zellen mit den Stößel auf einen Bohrer bei mittlerer Geschwindigkeit für drei Durchgänge verbunden ist. Sicherzustellen, dass der Behälter auf Eis während diesem Schritt nicht die Stößel über der Flüssigkeit zu entfernen und um eine konstante Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchläufen zu verwenden. </li><li> Übertragen der homogenisierten Lösung zu einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Zeichnen Sie die Lösung in eine 3-ml-Spritze mit einer 18-Gauge-1 ½-Zoll-Nadel und vertreiben sie zurück in die konische Röhrchen auf Eis mit einer 27 G ½-Zoll-Nadel. Kümmern, um die Lösung an der Innenwand des Rohrs auszustoßen, um diese Kraft für Zellmembran Unterbrechungen zu nutzen. </li><li> Wiederholen der Spritzenschritte für insgesamt fünfmal. </li><li> Wird die Lösung in einem 15 ml konischen Röhrchen und zentrifugiere für 5 Minuten bei 600 × g, 4 ° C in einer Tischzentrifuge mit einem Schwingbecher-Rotor. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und verteilt auf drei 1,5-ml-Röhrchen. HINWEIS: Mitochondria sind in dem Überstand nach dieser ersten Niedergeschwindigkeits Spin, während Zellmembranen und aufgebrochene Zellen pelletiert werden. </li><li> Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Saugen Sie die Überstände und kombinieren Sie die Pellets in 100 ul MIB und sofort auf Eis legen. HINWEIS: Mitochondrien sind im Pellet nach dieser Hochgeschwindigkeits-Spin. Mitochondrien werden in der Regel behalten ihre Membranpotential für ~ 2-3 Ionen Eis nach der Isolierung und stabilsten als konzentrierte Stammlösung in MIB. </li></ol></li><li> Mitochondrien isoliert von Mausgewebe <ol><li> Betäuben die Maus nach IACUC Protokoll. Legen Sie einen Verdampfer bei 5,0% auf die Anästhesie zu induzieren. Bestätigt, dass das Tier durch einen Mangel an Reflex Fuß Prise oder Blinkreflex betäubt, wenn das Auge nähert oder mit einem Wattestäbchen erschlossen. Halten Sie die Maus unter Narkose für den gesamten chirurgischen Eingriff, indem der Verdampfer zwischen 1,5% und 2,0%. </li><li> Excise die Leber und des Rückenmarks von jedem Tier und Ort separat in eiskaltem 1x PBS - / -, um wegspülen kein Blut. </li><li> Für die Leber, übertragen das Gewebe zu einer Wiegeschale auf Eis und hacken in feine Stücke mit einer frischen Rasierklinge für 1 min. </li><li> Fügen Sie Gewebe und geeigneten Puffer (MIB für Leber oder SC MIB für das Rückenmark) von der Behälterpuffer bis die erste Zeile erreicht. Homogenisieren Gewebe mit dem Stößel mit der Hand für fünf Durchgängen. Sicherzustellen, dass der Behälter auf Eis während diesem Schritt nicht die Stößel über der Flüssigkeit zu entfernen und um eine konstante Geschwindigkeit mit kontinuierlichen Durchläufen zu verwenden. </li><li> Übertragen Sie die Homogenate zu reinigen 15 ml Tuben. </li><li> Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 750 × g, 4 ° C für 10 min. </li><li> Speichern Sie die Überstände in saubere Rohre und legen Sie sie auf Eis. HINWEIS: Die Mitochondrien befinden sich im Überstand nach dieser ersten Niedergeschwindigkeits Spin, während Zellmembranen und aufgebrochene Zellen pelletiert werden. </li><li> Re-suspendieren die Rückenmarks Pellets in 500 ul SC MIB. </li><li> Re-homogenisieren je dreimal, nur Befüllen des Behälters zur Hälfte mit SC MIB diesmal. </li><li> Übertragen Sie die neue Homogenat in ein frisches Röhrchen. </li><li> Zentrifuge die in einem Festwinkelrotor bei 750 × g, 4 ° C für 10 min. </li><li> Kombinieren dieser neuen Überstände, die mehr Mitochondrien enthalten, wobei der erste Überstand von jeder Probe. </li><li> Zentrifugenröhrchen in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Saugen Sie die Überstände und Resuspendieren der Leber Pellets in 500 ul MIB und der Rückenmarks Pellets in 50 ul SC MIB und sofort auf Eis legen. HINWEIS: Mitochondrien sind im Pellet nach dieser Hochgeschwindigkeits-Spin. Mitochondrien werden in der Regel behalten ihre Membranpotential für ~ 2-3 Ionen Eis nach der Isolierung und stabilsten als konzentrierte Stammlösung in MIB. </li><li> Durchführen einer Proteinkonzentration Assay, um die Konzentration von Mitochondrien in Lösung zu schätzen. Befolgen Sie die Anweisungens für die Verwendung eines kommerziellen Protein Assay Kit oder ähnliche Verfahren 26. Typische Konzentrationen von Mitochondrien sind: 2 T175-Flaschen Ausbeuten ~ 2 mg / ml, 1 Mausleber ~ 3-5 mg / ml und 1 Rückenmark der Maus ~ 1-3 mg / ml. </li></ol></li></ol></li><li> Cytochrom-c-Assay mit einem F &amp; E-Ratte / Maus Cytochrom c Quantikine ELISA Kit (aus dem Protokoll des Herstellers angepasst). <ol><li> Unmittelbar vor der Einrichtung der Reaktionen, verdünnte Mitochondrien zu 0,5 mg / ml Arbeitskonzentration mit EB und zu verteilen verdünnt Mitochondrien in 1,5-ml-Röhrchen für die Reaktionen (in der Regel 30 bis 50 &amp; mgr; l der Mitochondrien pro Röhrchen). </li><li> Fügen Sie entweder EB oder DMSO, bei 1% des Gesamtvolumens, dem verwässerten Mitochondrien und bebrüten die Reaktionen auf der Tischplatte für 7-10 min. Diese Reaktionen sind bei Raumtemperatur für bis zu 30 Minuten stabil ist, wenn ein längerer Zeitraum erforderlich ist. </li><li> Pellet Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min und sorgfältigely trennen Sie den Überstand und legen Sie jeweils in einem separaten 1,5 ml-Röhrchen. HINWEIS: Die Schläuche können entweder bei -20 ° C für die spätere Analyse eingefroren oder sofort verwendet werden. </li><li> Bestimmen Freisetzung von Cytochrom c durch ein Vergleichen der Konzentration an Cytochrom c im Pellet und der Überstand 27. <ol><li> Vorbereitung der Proben, die durch Solubilisierung der Pellets in dem ursprünglichen Volumen der Reaktion mit 0,5% TX-100 in 1 × PBS. </li><li> Für jede Probe wurden 2 Vertiefungen Vorbereitung auf die ELISA-Platte, eines für die jetzt solubilisierten Pellets und einer für den Überstand aus der Reaktion durch Zugabe von 100 ul von Cytochrom c-Konjugat (verwenden gerade aus Flasche) plus 100 ul 0,5% Tx- 100 in 1x PBS, und dann alle der Pellets oder Überstandsprobe. </li><li> Vortexen Sie vorsichtig die Platte eine niedrige Einstellung (Stufe 2-4) für 20 Sekunden zu mischen, abdecken und inkubieren für 1 h, 37 ° C. </li><li> Anschließend waschen Sie die Platte viermal mit Waschpuffer nach dem HerAnweisungen Witwer. Entfernen Sie das überschüssige Lösung durch Antippen der Brunnen auf Papiertuch. </li><li> Als Nächstes fügen Sie 150 ul von 1: 1 A + B Entwicklerlösung in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte für 20 bis 30 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. </li><li> Schließlich, fügen Sie 50 ul Stopplösung in jede Vertiefung geben und nehmen Absorptionswerte bei 540 nm mit einem Mikroplatten-Reader. Berechnen der Menge an Cytochrom c-Freisetzung durch den Vergleich der Menge an Cytochrom c in der Pellet vs. Stand für jede Reaktion. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. Bewertung der Mitochondrien (Dys) Funktion <ol><li> Unmittelbar vor Reaktionen eingerichtet sind, zu verdünnen Mitochondrien zu 0,5 mg / ml Arbeitskonzentration mit EB und in 1,5 ml Röhrchen für Reaktionen gelegt (in der Regel 30 bis 50 &amp; mgr; l der Mitochondrien pro Röhrchen verwendet wird). </li><li> Mitochondriale Behandlungen <ol><li> In geeigneten Behandlungen (EB Kontrolle, 1 uM FCCP mit 50 nM Valinomycin gemischt, 10 uM Rotenon, 5 &amp; mgr; M Oligomycin, 2 mM KCN oder 200 uM ADP, Endkonzentrationen) Reaktionen bei 1/10 trennen th des Gesamtvolumens des verdünnten Mitochondrien. Die Reaktionen auf der Bank oben inkubieren 7 min. HINWEIS: Vorsicht beim Umgang mit diesen Stoffen als versehentlicher Einnahme oder Absorption durch die Haut schädlich sein könnte entnommen werden. </li><li> Verdünne TMRE, in sterilem Wasser in einer Arbeitskonzentration von 100 &amp; mgr; M und bei -20 ° C gelagert, bis 2 &amp; mgr; M und fügen ein Volumen gleich der mitochondrialen Reaktionsvolumen. </li><li> Die Reaktionen auf der Bank oben inkubieren 7 min. </li><li> Pellet Mitochondrien durch Zentrifugation in einem Festwinkelrotor bei 10.000 × g, 4 ° C für 5 min. </li><li> Laden Sie die Hälfte der überstehenden Volumen jeder Probe auf eine 396-Well-Platte und lesen Fluoreszenz. HINWEIS: Anregungs- und Emissionswellenlängen des TMRE sollte nach den Anweisungen des Herstellers mit dem Volumen und Platte, die verwendet werden soll optimiert werdenAssays. Mit einem Standard-384-Well-schwarze Platte mit 25 ul von 1 uM TMRE (endgültige Reaktionskonzentration) das stärkste Signal erhalten wurde unter Verwendung von Anregungs- / Emissionswellenlängen &#160; 485 nm / 535 nm. </li><li> Berechnen der Wand Differenz in der Fluoreszenz zwischen Kontrolle (EB) und jede Behandlung durch Dividieren der relativen Fluoreszenzwert (RFU) aus dem Plattenleser für die Versuchsprobe von der RFU von der Kontrollprobe erhalten. </li></ol></li></ol>

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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor-alpha+synergistically+mediate+neurotoxicity:+involvement+of+nitric+oxide+and+of+N-methyl-D-aspartate+receptors.">Interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha synergistically mediate neurotoxicity: involvement of nitric oxide and of N-methyl-D-aspartate receptors.</a> Brain, Behavior, And Immunity. 9, 355-365 (1995).</li><li>Downen, M., Amaral, T. D., Hua, L. L., Zhao, M. L., Lee, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+death+in+cytokine-activated+primary+human+brain+cell+culture:+role+of+tumor+necrosis+factor-alpha.">Neuronal death in cytokine-activated primary human brain cell culture: role of tumor necrosis factor-alpha.</a> Glia. 28, 114-127 (1999).</li><li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Weber, V., Falkenhagen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+endothelial+cell+activation+in+experimental+sepsis+with+a+two-step+cell+culture+model.">Monitoring of endothelial cell activation in experimental sepsis with a two-step cell culture model.</a> Innate Immunity. 16, 278-287 (2010).</li><li>Brown, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nitrogen+disruption+of+synaptoneurosomes:+an+alternative+method+to+isolate+brain+mitochondria.">Nitrogen disruption of synaptoneurosomes: an alternative method to isolate brain mitochondria.</a> Journal Of Neuroscience Methods. 137, 299-303 (2004).</li><li>Wong, A., Cortopassi, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+measurement+of+mitochondrial+membrane+potential+in+a+neural+cell+line+using+a+fluorescence+plate+reader.">High-throughput measurement of mitochondrial membrane potential in a neural cell line using a fluorescence plate reader.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 298, 750-754 (2002).</li><li>Blattner, J. R., He, L., Lemasters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+assays+for+the+mitochondrial+permeability+transition+using+a+fluorescence+multiwell+plate+reader.">Screening assays for the mitochondrial permeability transition using a fluorescence multiwell plate reader.</a> Analytical Biochemistry. 295, 220-226 (2001).</li><li>Kataoka, M., Fukura, Y., Shinohara, Y., Baba, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+mitochondrial+membrane+potential+in+the+cells+by+microchip+flow+cytometry.">Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry.</a> Electrophoresis. 26, 3025-3031 (2005).</li><li>Del Gaizo Moore, V., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transactivator+of+transcription+fusion+protein+transduction+causes+membrane+inversion.">Transactivator of transcription fusion protein transduction causes membrane inversion.</a> The Journal of Biological Chemistry. 279, 32541-32544 (2004).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit rekombinanten Cytokinen verursacht moderate Mengen von Zelltod über 48 h (Figur 1). Die Menge an Zelltod, der durch TNF-alpha-Behandlung induziert wird, ist ähnlich wie die zuvor beschriebenen Studien 30 und die Lebensfähigkeit der Zellen sinkt nach gleichzeitiger Verabreichung von mehreren Cytokinen, die größer als summativen Mengen mit jedem Cytokin allein ist auch im Einklang mit der Literatur 31,32. Die Möglichkeit, die Mengen und A...

Lebende Zellen Bank Stoffwechselenergie in Form von Fetten und Kohlenhydraten und die Nutzung dieser Energie für Biosynthese, Membrantransport und Bewegung. Etwas Energie wird in das Cytosol durch die Umwandlung von diätetischen Zuckern direkt in ATP während Glykolyse erhalten. Jedoch ist die Hauptquelle für die ATP-Produktion in einer Zelle, in die Mitochondrien über das mitochondriale Atmungskette 1 genutzt. Die Architektur der Mitochondrien liefert die notwendige räumliche Orientierung für die effektive und effiziente Produktion von ATP. Mitochondrien besitzen ein Doppelmembran von einem Intermembranraum und zusammen mit der Matrix, dem innersten mitochondrialen Raum, Haus der Komponenten getrennt und zu koordinieren, die chemischen Reaktionen in ATP-Generation beteiligt. Die innere Membran enthält eine Reihe von membrangebundenen Proteinkomplexe der Atmungskette als auch die ATP-Synthase, den Proteinkomplex, ADP und Pi für die Bildung von ATP vereint umfassen. Das Gasthauser Membran in Cristae gefaltet und Elektronen entlang der Atmungskette Komplexe durch das Cytochrom c, einem löslichen Elektronenüberträger, die zwischen Komplexen im Intermembranraum bewegt sich übergeben. Elektronen bewegen, Oxidation von Reduktionsäquivalenten eintritt und Wasserstoffionen werden aus der Matrix in den Intermembranraum gepumpt. Als Folge der hohen Ionenkonzentration innerhalb des Intermembranraum, baut sich ein elektrochemischer Gradient was zu einem Membranpotential über die innere Mitochondrienmembran (Δψ) 2. Sauerstoff ist das endgültige Elektronenakzeptor der Elektronentransportkette, und Wasserstoffionen strömen durch die ATP-Synthase aus dem Intermembranraum zurück in die Matrix und in so direkt tun ATP-Bildung führen. Das Verfahren in seiner Gesamtheit beschrieben wird als oxidative Phosphorylierung bekannt. Die Falten der Cristae vergrößern die Oberfläche der inneren Membran, so dass für maximale Elektronentransport und die ATP-Produktion imjedes Mitochondrium. Die Proteine, Enzyme und andere Moleküle in der oxidativen Phosphorylierung beteiligt sind sowohl aus Kern- und mitochondrialen Genen abgeleitet. Mitochondrien ihre eigene kreisförmige DNA, kodierend für 13 Proteine ​​sowie tRNAs und mRNAs für die ATP-Produktion 3 notwendig. Jedoch sind viele andere Proteine ​​erforderlich ist, und somit sind nukleär kodierten. Die meisten dieser kerncodierte Proteine ​​an der mitochondrialen Matrix durch Verwendung Präsequenzen am N-Terminus des Vorläuferproteins gezielt und deren Import wird teilweise durch Δψ 4,5 angetrieben. Über die zur Erreichung der bioenergetischen einer Zelle, Mitochondrien beeinflussen ebenfalls wichtige Wechselprozessen wie TCA und beta-Oxidation, zelluläre Signalwege, durch Regulieren Calcium, sowie eine zentrale Rolle bei der Apoptose. 6 Insbesondere in Zeiten der zellulären Stress, BCL-2-Familie Proteine, die am Wohnsitz oder die Interaktion an der mitochondrialen Außenmembran der Mitochondrien verursachenPermeabilität der äußeren Membran (MOMP) 7,8. Während MOMP sind Cytochrom c und anderen Proteinen in das Cytosol mit mehreren cytosolischen Proteine ​​freigesetzt, und bilden zusammen einen Komplex genannt apoptosome 9,10. Die Apoptosom aktiviert Caspasen, die gehen an zelluläre Proteine ​​und DNA während der Ausführungsphase der Apoptose zu spalten. Sobald MOMP auftritt, ΔΨ ist zusammengebrochen und die ATP-Produktion gestoppt. Somit ist, wie die Apoptose ausgelöst wird die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt und Veränderungen in ΔΨ können mitochondriale und Zellgesundheit 12 korreliert werden. Während die Apoptose ist ein Endpunkt in vielen Krankheitsmodelle, die Funktion der Mitochondrien und Änderungen ΔΨ können auch wertvolle Informationen über die Krankheit Entstehung und / oder Progression ergeben. Zum Beispiel haben die mitochondriale strukturelle und funktionelle Veränderungen im Verlauf von neurodegenerativen Erkrankungen 13,14 dokumentiert. Im ersten Teil des Protokolls, isonung intakter Mitochondrien, die ihre ΔΨ behalten beschrieben. HEK-293T-Zellen wurden verschiedenen Konzentrationen und Kombinationen von rekombinanten TNF-α, IL1-β und IFN-γ ausgesetzt, um die Apoptose zu induzieren. Diese Zytokine wurden ausgewählt, weil sie häufig berichteten hohen in primären humanen septischen Proben 15 und dem extrinsischen Weg der Apoptose kann durch die Wechselwirkung von TNF-α-Bindung an seinen Rezeptor 6 ausgelöst werden. Da es subtile Variationen notwendig funktionelle Mitochondrien aus primären Geweben zu isolieren, verglichen mit kultivierten Zellen und weil viel Forschung verwendet Tieren, beschreibt das Protokoll auch, wie Mitochondrien aus Leber und Rückenmark von anteriore laterale Sklerose (ALS) Mausmodell zu isolieren. Der zweite Teil des Protokolls wurde entwickelt, um Störungen des mitochondrialen Membranpotenzials überwacht unter Verwendung eines potentialsensitiven Fluoreszenzfarbstoffes mit einem Fluoreszenzplattenlesegerät. Unterschieds zwischen zellulären Status (dh gesunden vs. ungesunden) durch Quantifizieren der Stärke der ΔΨ von isolierten Mitochondrien in Verbindung mit Trennmitteln, die Atmungsketteninhibitoren, Komplex Inhibitoren und Ionophore, die alle Abfuhr des mitochondrialen Membranpotentials verursachen differenziert. Desto gesünder die Mitochondrien, je größer die Änderung ΔΨ bei Behandlung mit mitochondrialen Inhibitoren, damit die Reaktion von Mitochondrien kann als Indikator für die mitochondriale (Dysfunktionen) Funktion verwendet werden. Die Verwendung von isolierten Mitochondrien statt in situ Einschätzung Funktion bietet endgültigen Beweise dafür, dass eine Pathologie oder Behandlung Änderungen an der Organelle 16-18 direkt moduliert. Es gibt zwar Methoden, die in der Literatur zu den Mitochondrien aus kultivierten Zellen zu isolieren, vage sind sie 17 ab und / oder Spezialausrüstung 16. Dieses Protokoll beschreibt im Detail die Isolierungsmethode undleicht an andere Zelllinien, einschließlich der Primärgewebe und Kulturen 13,14,19,20. Viele isolierte Mitochondrien Untersuchungen verwenden die gleichen mitochondrialen Entkuppler und Inhibitoren in diesem Protokoll, jedoch mit einer Clark-Elektrode verwendet wird (21 ist ein repräsentatives Beispiel für viele Arbeiten in der Literatur), die wiederum eine sehr spezifische und Spezialmaschine. Darüber hinaus hat diese traditionelle Methode Einschränkungen wie geringe Durchsatz und hohe Komplexität 22,23 und erfordert eine erhebliche Menge an Mitochondrien (~ 500 ug / Reaktion). In diesem Protokoll wird die Leuchtstoffmembran-Sensing-Potentialsonde TMRE in Verbindung mit einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät, das eine Standardmaschine in vielen Labors ist eingesetzt. TMRE ist weithin angesehen, da es schnell geht Zellen und Mitochondrien isoliert und kann bei niedrigen Konzentrationen 24 verwendet werden. Mehrere Umsetzungen können schnell hintereinander gesetzt werden und Batch analysiert mit diesem Protokoll. Weiterhin wird die Reaktions erfordern eine wesentlich geringe Menge an isolierten Mitochondrien (~ 10 &amp; mgr; g / Reaktion). Um weniger Material erfordern können kleinere Gewebe- oder Zellkulturproben als Ausgangspunkt für Mitochondrien Isolierung verwendet werden, mehrere Wiederholungen oder Reaktionen können möglicherweise genügend Material für die anderen isolierten Mitochondrien Experimente wie die ATP-Produktion, der Sauerstoffverbrauch oder Importieren eingestellt werden, und Assays sind möglich.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:209px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:137px;">Company</td>
			<td style="width:163px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:179px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G1251</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">malic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8304</td>
			<td>Can use the potassium salt instead.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0662</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EGTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trisma base</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MOPS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M3183</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CCCP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C2920</td>
			<td>Dilute down to 100uM as a working stock in ethanol and store at -20C.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Valinomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>V0627</td>
			<td>Make in DMSO and use as a 5uM working stock. Store at -20C.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">sucrose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S5-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KCN</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td align="right">6379</td>
			<td>Make a concentrated stock in ethanol and then dilute with water&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">rotenone</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8875</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">oligomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O4876</td>
			<td>Highly toxic. Made in ethanol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ADP</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TMRE</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>8717-25mg</td>
			<td>Dilute 100uM stock with EB immediatley before use.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11965-084</td>
			<td>1x regular (high glucose).</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pen/Strep</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15140-155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-glutamine</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH3002101</td>
			<td>Store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FBS</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>14-501F</td>
			<td>US origin, premium quality. Heat inactivate and store aliquots at -20</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>SIgma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Protien Assay Dye (5x)</td>
			<td style="width:137px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:163px;">500-0006</td>
			<td>Any protein assay can substitute.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">BSA</td>
			<td style="width:137px;">Fisher</td>
			<td style="width:163px;">BP1600-100</td>
			<td>Make 2mg/mL stock in water for protein assay.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MTT powder</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2128</td>
			<td>Filter sterlize 5mg/mL stock made in PBS. Store aliquots at -20C; store at 4C for up to 1 week.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tergitol solution (NP-40)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NP40S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human IL-1B</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PCH08014</td>
			<td>Once opened store aliquots at -20C</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Recombinant Human TNF-alpha</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>PHC3015L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Recombinant Human IFN-gamma</td>
			<td style="width:137px;">Gibco</td>
			<td>PHC4031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:209px;">Dulbeccos PBS (-/-)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td style="width:163px;">D8537</td>
			<td>Make sure it is without Mg2+ and Ca2+ ions.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cytochrom c ELISA kit</td>
			<td>R&#38;D systems</td>
			<td>DTC0</td>
			<td>Human for HEK-293T cells.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Behandlung von HEK-293T-Zellen, die mit 200 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ (* 3) für 24-48 h führt zu einer fort Mengen von Zelltod (1A ). Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit MTT-Assays untersucht und durchgängig zeigt, daß es ~ 10% ige Abnahme in der Lebensfähigkeit der Zellen bei 24 Stunden Behandlung und ~ 20% ige Abnahme bei 48 Stunden Behandlung. Zellen, die mit ähnlichen Konzentrationen (100 pg / ml TNF-α, 40 ng / ml IL1-β, und 75 ng / ml IFN-γ) zu ergeben ...

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Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Isolierung und funktionale Analyse von Mitochondrien aus kultivierten Zellen und Maus-Gewebe

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...

isolation-functional-analysis-mitochondria-from-cultured-cells-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

39.2K Aufrufe.  Elon University. Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress. 

Serie: Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Forschung

Biologie

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

Reinigung von Mitochondrien aus Hefezellen

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

Dissection of Hippocampal Dentate Gyrus from Adult Mouse

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its remarkable neuronal cell plasticity, and its involvement in epilepsy, neurodegenerative diseases, and psychiatric disorders. The hippocampus is composed of distinct regions; the dentate gyrus, which comprises mainly granule neurons, and Ammon's horn, which comprises mainly pyramidal neurons, and the two regions are connected by both anatomic and functional circuits. Many different mRNAs and proteins are selectively expressed in the dentate gyrus, and the dentate gyrus is a site of adult neurogenesis; that is, new neurons are continually generated in the adult dentate gyrus. To investigate mRNA and protein expression specific to the dentate gyrus, laser capture microdissection is often used. This method has some limitations, however, such as the need for special apparatuses and complicated handling procedures. In this video-recorded protocol, we demonstrate a dissection technique for removing the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope. Dentate gyrus samples prepared using this technique are suitable for any assay, including transcriptomic, proteomic, and cell biology analyses. We confirmed that the dissected tissue is dentate gyrus by conducting real-time PCR of dentate gyrus-specific genes, tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) and desmoplakin (Dsp), and Ammon's horn enriched genes, Meis-related gene 1b (Mrg1b) and TYRO3 protein tyrosine kinase 3 (Tyro3). The mRNA expressions of TDO2 and Dsp in the dentate gyrus samples were detected at obviously higher levels, whereas Mrg1b and Tyro3 were lower levels, than those in the Ammon's horn samples. To demonstrate the advantage of this method, we performed DNA microarray analysis using samples of whole hippocampus and dentate gyrus. The mRNA expression of TDO2 and Dsp, which are expressed selectively in the dentate gyrus, in the whole hippocampus of alpha-CaMKII+/- mice, exhibited 0.037 and 0.10-fold changes compared to that of wild-type mice, respectively. In the isolated dentate gyrus, however, these expressions exhibited 0.011 and 0.021-fold changes compared to that of wild-type mice, demonstrating that gene expression changes in dentate gyrus can be detected with greater sensitivity. Taken together, this convenient and accurate dissection technique can be reliably used for studies focused on the dentate gyrus.

A dissection technique for removal of the dentate gyrus from adult mouse under a stereomicroscope was demonstrated in this video-recorded protocol.

Dissection der hippocampalen von erwachsenen Maus

The hippocampus is one of the most widely studied areas in the brain because of its important functional role in memory processing and learning, its ...

Isolation of Primary Myofibroblasts from Mouse and Human Colon Tissue

The myofibroblast is a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining considerable attention for its critical role in many GI functions. While several myofibroblast cell lines are commercially available to study these cells in vitro, research results from a cell line exposed to experimental cell culture conditions have inherent limitations due to the overly reductionist nature of the work. Use of primary myofibroblasts offers a great advantage in terms of confirming experimental findings identified in a cell line. Isolation of primary myofibroblasts from an animal model allows for the study of myofibroblasts under conditions that more closely mimic the disease state being studied. Isolation of primary myofibroblasts from human colon tissue provides arguably the most relevant experimental data, since the cells come directly from patients with the underlying disease. We describe a well-established technique that can be utilized to isolate primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue. These isolated cells have been characterized to be alpha-smooth muscle actin and vimentin-positive, and desmin-negative, consistent with subepithelial intestinal myofibroblasts. Primary myofibroblast cells can be grown in cell culture and used for experimental purposes over a limited number of passages.

The myofibroblast is an influential stromal cell of the gastrointestinal tract that regulates important physiologic processes in both normal and disease states. We describe a technique that allows for the isolation of primary myofibroblasts from both mouse and human colon tissue, which can be utilized for in vitro experimentation.

Isolierung von Primär Myofibroblasten aus Maus und Mensch Colon Tissue

The myofibroblast is  a stromal cell of the gastrointestinal (GI) tract that has been gaining  considerable attention for its critical role in many GI ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Schnelle Isolierung und Reinigung von Mitochondrien für die Transplantation von Gewebe-Dissoziation und Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolierung von Mitochondrien von minimalen Mengen an Maus-Skelettmuskel für die Hochdurchsatz-Mikroplatten-Atemmessungen

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolierung von hochwertigen atrialen und ventrikulären Myozyten der Maus für die simultane Messung von Ca2+ Transienten und L-Typ Calciumstrom

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Isolation of Mitochondria from Mouse Skeletal Muscle for Respirometric Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) system, which is regulated in response to cellular demands. The lipid molecule Coenzyme Q (CoQ) is essential in this process by transferring electrons to complex III in the electron transport chain (ETC) through constant oxidation/reduction cycles. Mitochondria status and, ultimately, cellular health can be assessed by measuring ETC oxygen consumption using respirometric assays. These studies are typically performed in established or primary cell lines that have been cultured for several days. In both cases, the respiration parameters obtained may have deviated from normal physiological conditions in&#160;any given organ or tissue.
Additionally, the intrinsic characteristics of cultured single fibers isolated from skeletal muscle impede this type of analysis. This paper presents an updated and detailed protocol for the analysis of respiration in freshly isolated mitochondria from mouse skeletal muscle. We also provide solutions to potential problems that could arise at any step of the process. The method presented here could be applied to compare oxygen consumption rates in diverse transgenic mouse models and study the mitochondrial response to drug treatments or other factors such as aging or sex. This is a feasible method to respond to crucial questions about mitochondrial bioenergetics metabolism and regulation.

Here, we describe a detailed method for mitochondria isolation from mouse skeletal muscle and the subsequent analysis of respiration by Oxygen Consumption Rate (OCR) using microplate-based respirometric assays. This pipeline can be applied to study the effects of multiple environmental or genetic interventions on mitochondrial metabolism.

Isolierung von Mitochondrien aus der Skelettmuskulatur der Maus für respirometrische Assays

Most of the cell&#39;s energy is obtained through the degradation of glucose, fatty acids, and amino acids by different pathways that converge on the ...

Isolation and Functional Analysis of Arteriolar Endothelium of Mouse Brain Parenchyma

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow increases with decreasing diameter from arteries to arterioles that ultimately feed into capillaries. Due to their smaller size and location in the parenchyma, arterioles have been relatively understudied and with less reproducibility in findings than surface pial arteries. Regardless, arteriolar endothelial cell structure and function&#8212;integral to the physiology and etiology of chronic degenerative diseases&#8212;requires extensive investigation. In particular, emerging evidence demonstrates that compromised endothelial function precedes and exacerbates cognitive impairment and dementia.
In the parenchymal microcirculation, endothelial K+ channel function is the most robust stimulus to finely control the spread of vasodilation to promote increases in blood flow to areas of neuronal activity. This paper illustrates a refined method for freshly isolating intact and electrically coupled endothelial &#34;tubes&#34; (diameter, ~25 &#181;m) from mouse brain parenchymal arterioles. Arteriolar endothelial tubes are secured during physiological conditions (37 &#176;C, pH 7.4) to resolve experimental variables that encompass K+ channel function and their regulation, including intracellular Ca2+ dynamics, changes in membrane potential, and membrane lipid regulation. A distinct technical advantage versus arterial endothelium is the enhanced morphological resolution of cell and organelle (e.g., mitochondria) dimensions, which expands the usefulness of this technique. Healthy cerebral perfusion throughout life entails robust endothelial function in parenchymal arterioles, directly linking blood flow to the fueling of neuronal and glial activity throughout precise anatomical regions of the brain. Thus, it is expected that this method will significantly advance the general knowledge of vascular physiology and neuroscience concerning the healthy and diseased brain.

Intensive preparation of intact mouse cerebral endothelial &#34;tubes&#34; from cerebral parenchymal arterioles is illustrated for studying cerebral blood flow regulation. Further, we demonstrate the experimental strengths of this endothelial study model for fluorescence imaging and electrophysiology measurement of key cellular signaling pathways, including changes in intracellular [Ca2+] and membrane potential.

Isolierung und funktionelle Analyse des arteriolären Endothels des Hirnparenchyms der Maus

Cerebral blood flow is conveyed by vascular resistance arteries and downstream parenchymal arterioles. Steady-state vascular resistance to blood flow ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Maus-Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrien

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...