Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation unter dem Förderkennzeichen # IOS-1025627 unterstützt und von den National Institutes of Health unter dem Förderkennzeichen # 1R21NS078582-01 bis JAW

Dieses Protokoll verwendet zwei Setups (Abbildung 1) zu vier verschiedenen Anzeigen von Fliegen, die einer bakteriellen Infektion gesammelt erwerben. Diese Ausgänge sind 1) Schlaf / Wach-Verhalten; 2) das Überleben Ergebnis; 3) Keimbelastung in der Fliege, und 4) Echtzeit-Messung von NFKB Reporter Aktivität in vivo. In Kombination mit den genetischen Werkzeuge, die verfügbar sind in Drosophila, bieten diese Messungen mechanistischen Einblick in die molekulare Verbindung zwischen Immunfunktion und Verhalten. Ein. Measure Bewegungsaktivität und Hotels in Flies <ol><li> Das Setup verwendet, um Bewegungsaktivität zu messen und Hotels in Fliegen, die auch die Drosophila Activity Monitoring System (DAM2, Trikinetics), Inkubatoren, dunklen Raum, und die Vorbereitung der Versuchstiere und Aktivität Röhren, wurde bereits 6 beschrieben. Der gleiche Ansatz wird hier, mit einigen geringfügigen Änderungen verwendet. <ol class="lalpha"><li&gt; Die Beleuchtung des Inkubators durch den Inkubator selbst gesteuert. Daher ist es wichtig, die Zeit Einstellung bei Computer-und Gründerzentren synchronisieren. </li><li> Aktivität Röhrchen werden zur Wiederverwendung durch Kochen auf einer Heizplatte in entionisiertem Wasser gereinigt. Eine geringe Menge an Detergens für das erste Kochen zugesetzt werden Rohre gut gespült und kochte noch zweimal. Wenn Garn verwendet wird, um das Rohr anschließen, können verwendet Aktivität Rohre (Aufnahme von Lebensmitteln, Wachs, Fliegen und Garne) ohne vorherige Entfernung des Garns gereinigt werden. </li></ol></li><li> Vor Beginn eines Experiments, inszeniert Ort Kulturen mit späten Puppenstadium Fliegen in Inkubatoren für drei bis vier Tage an experimentelle Beleuchtung und andere Umweltbedingungen anzupassen. Light: dunkel oder konstanten Bedingungen wurden häufig verwendet, um das Schlafverhalten messen. In diesem Beispiel werden entfernt, um konstantes Licht, um den Einfluss der circadianen Uhr auf die Immunantwort und Verhalten 2,7,8 eliminieren akklimatisiert. Wie in 1A beschriebenen </strong&gt;, Load 1-4 Tage alten Fliegen in der Trikinetics DAM2 Tätigkeit überwacht als 6 und Rekord für ein Minimum von drei Tagen beschrieben vor der Infektion. </li></ol> 2. Infect Fliegen mit einem pathogenen Stamm von Bakterien <ol><li> Das hier beschriebene Protokoll ist spezifisch für S. marcescens, die einfach zu züchten und zu warten sind. Protokolle für Langzeitspeicherung und Kulturbedingungen für andere bakterielle Spezies variieren. S. marcescens in 15-50% Glycerin bei -80 ° C gelagert Um für die langfristige Lagerung vorbereiten, mischen 2 Volumina Nacht Bakterienkultur (OD 600 = 0,5 - 1,0) bis 1 Volumen autoklavierten 50% Glycerin in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Diese werden in einem abschließenden Glycerinkonzentration von 17% führen. Röhrchen bei -80 ° C. Um einen kurzfristigen in-use Quelle von Bakterien vorzubereiten, kratzen die gefrorenen Aktie mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze und führen eine Drei-Wege-Streifen auf einer LB-Agarplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 &amp; dzB, C, um isolierte Kolonien zu erhalten. Bewahren Sie die Platte bei 4 ° C. Einen Tag vor der geplanten Infektion, wählen Sie eine einzelne Kolonie von der LB-Agar-Platte mit einem sterilen 200 ul Pipettenspitze und tauchen die Spitze in einer Kultur Röhrchen mit 5 ml LB-Medium. Bakterien wachsen über Nacht, oder bis zu 16 Stunden innerhalb eines Inkubationsschüttler bei 37 ° C und 250 rpm bis zum Erreichen der exponentiellen Wachstumsphase. Messen der Konzentration mit einem Spektrophotometer bei OD 600. Die Konzentration in dieser Phase im Bereich von 0,5 zu 1 beträgt. Ist die Konzentration zu hoch ist, subkultivieren Bakterien und wachsen noch mehrere Stunden, um eine optimale Konzentration zu erhalten. Führen Sie das Verfahren in der Nähe einer Flamme Quelle. Einige Bakterienstämme für Antibiotikaresistenz konstruiert und gezüchtet werden und ausgewählt geeigneten Antibiotika zu dem Medium hinzugefügt. S. marcescens (ATCC # 8100) sind keine Antibiotika-resistente und werden daher in sterilen Medium ohne Antibiotikum gezüchtet. Um sterile Technik überprüfen, gehen Sie ein Mock cultuerneut ohne Bakterien als Kontrolle. Die Lösung, um Fliegen zu infizieren enthält Bakterien (verdünnt auf OD 600 = 0,1) und 1% Lebensmittelfarbe (Brilliant Blue FCF) in PBS. Bereiten Sie eine Lösung zur Injektion Kontrolle, indem äquivalente Menge LB-Medium in Infektion Lösung und 1% blaue Lebensmittelfarbe in PBS verwendet. Store Solutions auf Eis. </li><li> Bereiten Glasnadeln zum Einspritzen die Fliegen. Ziehen Sie Glaskapillaren (od = 1 mm, id = 0,58 mm, WPI) zu einer feinen Spitze mit einem Feinpipettenziehvorrichtung (Narishige). Unter einem Präpariermikroskop, verwenden feinen Pinzette zum Abbruch der Spitze der Nadel, so daß die Öffnung groß genug ist, um mit Injektionsflüssigkeit durch Saugwirkung mit einer Spritze zu füllen, aber klein genug, um eine Beschädigung der Fliege während der Injektion zu minimieren. Nach dem Bruch der Spitze, sollte die Spitze Größe ca. 40-50 um betragen. Das Glas Nadel wird zu einer 3 cc-Kunststoffspritze mit einem Länge Rohr befestigt. Der Fluss der Injektion Medium manuell gesteuert Anwendung Überdruck oder suction mit der Spritze. Vermeiden Sie Verschmutzung der Gummischlauch mit Injektionsflüssigkeit, wie die Spritze Gerät sowohl für Infektionen und Kontrolle Injektionen verwendet wird. </li><li> Anesthetize Fliegen, indem sie auf eine CO 2-Pad. CO 2 wird durch einen abgedichteten Behälter mit Wasser geleitet, um das Kissen zu befeuchten und um statische Elektrizität, die Manipulation der Fliegen an den Pad kann verkomplizieren reduzieren. Injizieren Fliegen durch Stossen das Glas Nadel in den Bereich oberhalb des Scutellum des dorsalen Thorax. Die Weitergabe der Injektion Medium in-the-fly durch die Lebensmittelfarbe überprüft - Fliegen drehen blau wie die Lebensmittelfarbe Spreads durch das System. Die Dosis von Bakterien, die Fliegen empfangen kann quantifiziert, wie in Abschnitt 3 beschrieben, weiter unten. Einige experimentelle Designs gehören eine Kontrollgruppe, die aseptische Verletzungen erhält durch die Injektion Fliegen mit PBS und Lebensmittelfarbe aber ohne Bakterien. </li></ol> 3. Bestimmen Sie die bakterielle Belastung Ein Ansatz zur evaluating die Immunantwort gegen eine bakterielle Infektion ist, um die bakterielle Belastung nach der Infektion bestimmt. D. melanogaster ist ein großes Vorbild, um diesen Parameter zu bestimmen, weil die ganze Fliege kann homogenisiert, um die Summe der Keimzahlen innerhalb eines einzelnen zu schätzen. Das Grundprinzip hinter diesem Protokoll ist, wenn sie auf einem festen Medium wie Luria Broth (LB)-Agar in einer Petrischale (LB-Platte) gezüchtet, ein einzelnes Bakterium eine sichtbare unterscheidbare Kolonie bildet. Daher kann durch Homogenisieren infizierten Fliegen in LB-Flüssigmedium, Erzeugen von seriellen Verdünnungen des Homogenats und Spreizen des verdünnten Homogenat auf LB-Platten, kann die Anzahl der Bakterienzellen Infizieren einer Fliege bestimmt werden. Eine Kontrollgruppe von Fliegen mit PBS und Lebensmittelfarbe, aber ohne Bakterien injiziert sollte verwendet werden, um sicherzustellen, dass die Infektion nicht mit anderen bakteriellen Spezies kontaminiert werden. Es sollte keine Kolonien auf der LB-Agar-Platte in diesem Zustand sein. <ol><li> Autoklavieren alle Materialien, die dafür verwendet werden sollenVerfahren vor Durchführung der eigentlichen Homogenisierung Schritt. Dazu gehören 200 ul Pipettenspitzen mit einer Schere, LB Medien und Stößel für die Homogenisierung verwendet geschnitten. Bereiten Platten durch Gießen autoklavierten LB / Agar-Medium in 10 cm sterile Petrischalen mindestens 1 Tag vor Homogenisieren Fliegen. </li><li> Anesthetize sammeln und fliegt in 1,5 ml Reaktionsgefäße und Shop Röhrchen auf Eis. </li><li> Führen Sie die Homogenisierung in der Nähe einer Flamme, um eine Kontamination zu verhindern. Eine Steuerung Homogenisierung mit Fliegen ohne Infektion wird empfohlen, insbesondere bei Verwendung eines Bakterienstamm wie S. marcescens, die nicht Antibiotikum resistent. Homogenisieren ein Minimum von 2 Gruppen von 10 Fliegen pro Tier experimentellen Zustand. Die Zahl der Fliegen pro Homogenat verwendet wird vom Experimentator bestimmt. Einige Gruppen haben eine Fliege pro Homogenat verwendet, was nützlich ist, zum Auswerten Variation zwischen einzelnen bakteriellen Belastung entfernt 8, während andere 3-10 Fliegen pro Homogenat verwendet habenum über Genotyp oder experimentelle Bedingung 9-12 vergleichen. <ol class="lalpha"><li> Fügen Sie 400 ul LB-Medium zu jedem Mikrozentrifugenröhrchen mit Fliegen und homogenisieren mit einem kleinen Motor und Stößel (Kontes). </li><li> Mit sterilisiert geschnitten Pipettenspitzen verdünnen serielle das Homogenat 1.10 durch Zugabe von 20 ul homogenisierte LB / bakterielle mittel-bis 1,5 ul Mikrozentrifugenröhrchen mit 180 ul LB-Medium. Schneiden Pipettenspitzen verhindert das Blockieren von fly Schutt und stellt sicher, dass ein geeignetes Volumen wird übertragen. </li><li> Verdünnungsfaktor wird empirisch bestimmt und hängt von der Genotyp des fliegen, der Bakterienstamm verwendet, und experimentellen Bedingungen. Für Wildtyp Fliegen mit S. infiziert marcescens, verwenden Verdünnungen von 1:10 oder 1:10 3 2 für Fliegen sofort nach der Infektion homogenisiert und Verdünnungen von 1:10 oder 1:10 4 5 für Fliegen homogenisiert 24 h nach der Infektion. </li><li> Fügen Sie 100 ul LB / bakterielle Medium aus der microcentrifuge Röhrchen mit dem Endverdünnung und verteilt das Medium auf einer LB-Platte unter Verwendung von Glaskugeln (VWR), um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. </li><li> Entsorgen Sie die Glaskugeln in 100% EtOH Lösung. Legen Sie die LB-Platten in einem 37 ° C Inkubator über Nacht. </li><li> Als optionaler Schritt, verwenden ein Abbildungssystem mit sichtbarem Licht, um ein Bild der LB-Platten (FluorChem 8900; Alpha Innotech) zu erhalten. Zählen der Anzahl von Kolonien entweder auf der Platte selbst oder aus dem Bild der Platte mit dem Werkzeug auf das Zählen Photoshop Software (Adobe Photoshop CS3). </li><li> Berechnen der Anzahl der Kolonie-bildenden Einheiten pro Fliege unter Verwendung der Formel: [n / (N * T * v)] * V, wobei n = Anzahl der Kolonien auf dem LB-Platte gezüchtet, N = die Anzahl der Fliegen in einem gepoolten Mikrozentrifugenröhrchen, D = Verdünnungsfaktor, und v = Volumen der Lösung auf jeder Platte zu verbreiten; V = ursprüngliches Volumen der Homogenat. </li></ol></li></ol> 4. Bewerten Sleep and Survival-Dauer nach der Infektion <ol><li> FürFliegen, die nicht für die Messung bakterielle Belastung geerntet werden, weiterhin überwachen Verhalten für weitere 7-10 Tage. Überlebensdauer von Genotyp der Fliege, die Umgebungsbedingungen beeinflusst und Bakterienarten für die Infektion verwendet. </li><li> Nach ca. 10 Tagen zu kündigen das Experiment, herunterzuladen und zu verarbeiten Verhaltensdaten wie zuvor 6 beschrieben. Insomniac2 kundenspezifische Software, die in Matlab basiert, wird verwendet, um Schlaf-Parameter zu analysieren. Es ist wichtig zu toten Fliegen aus der Verhaltensanalyse eliminieren. Normalerweise schränkt dies Analysen innerhalb der ersten Tage nach der Infektion, je nach Art der Infektion und Fliege Genotyp. Tod im Assay wird durch die Zeit alle Aktivitäten zählt Null erreicht angegeben haben. Um die Analyse des Überlebens zu erleichtern, Drosonex, kundenspezifische Software in Microsoft Visual C + + 6.0, wird verwendet, um Rohdaten aus dem Trikinetics DAM-System zu verarbeiten. Die Software-Berichte als Excel-Dateien, Überleben Dauer jedes fly (in Stunden), kompiliert Aktivität data von allen Monitoren in einer einzigen Tabelle, und meldet die prozentuale fliegt überlebende im Laufe der Zeit, wie sie durch den Benutzer. Die Excel-Dateien sind zum Einbau in andere statistische Software-Pakete für die weitere Analyse zu integrieren. </li></ol> 5. Messen NFKB Aktivität während der Infektion mit einem Luciferase Reporter Assay Transgene Fliegen kappaB-luc in diesem Test verwendet wurden erzeugt, wie in vorher Kuo et al., 2010 2. Kurz gesagt, enthält die KB-luc Reporter 8 Wiederholungen einer NFKB Bindungssequenz, die in einen Promotor eingefügt wurden stromaufwärts eines Luciferase offenen Leserahmens. <ol><li> Passen Fliegen zu experimentellen Lichtverhältnissen, wie in Abschnitt 1.2 beschrieben. In diesem Beispiel sind 1-4 Tage alte kappaB-luc Fliegen in Fläschchen, die eine 5% Saccharose, 2% Agar Nährboden und in Gleichlicht (LL) für 2 Tage, um die gleiche Alter als andere während der Infektion entfernt erreichen untergebracht. </li><li> Bereiten Sie eine 96-well Mikrotiterplatten für Fliegen. Jede Vertiefung enthält 2 Schichten von Lebensmitteln Medium (Abbildung 2), die obere Schicht enthält Luciferin, das Substrat der Luciferase. Fügen Sie 300 ul einer 5% Saccharose, 2% Agar-Lösung in jede Vertiefung und lassen Sie sich zu verfestigen. Weiter, einen 50 ul Deckschicht zu jedem Well, enthaltend 5% Sucrose, 1% Agar, und 2 mM Luciferin (Gold Biotechnology, Inc.). Luciferin Konzentrationen für Mess-Reporter-Aktivität in Drosophila verwendet wurden in der Literatur unterschiedlich und haben so niedrig wie 100 uM 13 gewesen. Die erforderliche Konzentration kann empirisch ermittelt werden. Zwischen Abgabe der Lebensmittel Schichten, decken Sie die Platte mit einem feinmaschigen Gewebe zu erleichtern Trocknen unter Beibehaltung Sterilität. Die Platte sollte gründlich trocknen gelassen werden, bis zu einer Stunde, um Fliegen aus immer in Kondensationstropfen steckenbleiben. Da Luciferin ist lichtempfindlich, vermeiden Platten mehr als nötig leuchten. </li><li> Tragen Sie eine klare Klebefolie (Top-Seal-A; Perkin Elmer) in eine 96-well-Mikrotiterplatte und perforierten mit einer feinen Nadel in einer Menge von 2 Löcher pro Vertiefung. Diese Löcher werden nicht nur ermöglichen Luftaustausch in jede Vertiefung, sondern auch eine Möglichkeit, um Fliegen auf einer individuellen Basis zu betäuben. Mit einem scharfen Messer und Lineal, stellen einen Schnitt zwischen den einzelnen Spalten. Dies wird eine einfache Möglichkeit zum Laden / Entladen Fliegen in Gruppen von 8 zu einem Zeitpunkt. Um Fliegen in die Mikrotiterplatte zu laden, entfernen Sie die Fläschchen aus dem Inkubator und betäuben Fliegen auf einen CO 2-Pad. Last fliegt ein-by-one zu jeder Vertiefung Spalte für Spalte. Sollte ein Versehen fliegen Klebe-/Dichtungsmasse stecken, lassen die Fliege allein, wie sie oft in der Lage, sich ohne Intervention befreien. Bringen Sie die Mikrotiterplatte in den Inkubator in LL für 8-24 Stunden an die neue Umgebung anzupassen und die Luciferinsubstrat verbrauchen. </li><li> Kultur Bakterien, S. marcescens, und bereiten eine Lösung für eine Infektion wie oben beschrieben. </li><li> Betäuben tfliegt er mit einer Mikropipette Spitze an einer Niederdruck-CO 2-Leitung. Legen Sie die Mikropipettenspitze direkt über den Lüftungsöffnungen für jeden gut gemacht. Vorsicht geboten, um zu gewährleisten, dass der CO 2-Druck hoch genug, um die Fliege betäuben, aber niedrig genug, um eine Verletzung des fly vermeiden. In Gruppen von acht einzeln übertragen jede Fliege zu einer CO 2-Pad, und infizieren wie oben beschrieben. Nach der Infektion wieder jede Fliege auf seine ursprüngliche gut und versiegeln Sie den Mikroplatten. </li><li> Maßnahme Lumineszenz (TopCount NXT-Lumineszenz und Scintillation Counter; Perkin-Elmer). Die Lumineszenz TopCount Zähler enthält eine Stapelkassette für Platten, die für den programmierten und automatisierte Messungen ermöglicht kontinuierlich an gewünschten Inkremente für längere Zeit (in der Regel bis zu fünf Tagen). Diese Funktion ist nicht auf allen Instrumenten und Datenerfassung für Experimente mit anderen Instrumenten durchgeführt werden daher seltener. Die Lumineszenz-Zähler in einem ro untergebrachtom mit einer kontrollierten Temperatur und Beleuchtung Zeitplan. Beim Laden Platten in die Stapelkassette, stapeln Sie die Platten mit den Fliegen zwischen klaren Blindplatten um sicherzustellen, dass Fliegen Licht zu empfangen. Programm das Luminometer nach den Angaben des Herstellers zu sammeln Lesungen jede Stunde für ein Minimum von 24 Stunden. In diesem Beispiel werden die Detektoren programmiert, um alle Vertiefungen für 10 sec zu lesen und das Ergebnis als Zählungen (willkürliche Einheiten) pro Sekunde abzugeben. Dieser Wert wird auf 3 Lesungen pro Vertiefung gemittelt. Exportieren Sie die Dateien in ein Tabellenkalkulationsprogramm und führen Sie eine Standard-Analyse, grafische Darstellung der Ergebnisse der Lumineszenz. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+differences+in+sleep+and+other+pathophysiological+sequelae+of+influenza+virus+infection+in+naive+and+immunized+mice.">Strain differences in sleep and other pathophysiological sequelae of influenza virus infection in naive and immunized mice.</a> J. Neuroimmunol. 58, 89-99 (1995).</li><li>Hendricks, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rest+in+Drosophila+is+a+sleep-like+state.">Rest in Drosophila is a sleep-like state.</a> Neuron. 25, 129-138 (2000).</li><li>Wu, M. N., Koh, K., Yue, Z., Joiner, W. J., Sehgal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+screen+for+sleep+and+circadian+mutants+reveals+mechanisms+underlying+regulation+of+sleep+in+Drosophila.">A genetic screen for sleep and circadian mutants reveals mechanisms underlying regulation of sleep in Drosophila.</a> Sleep. 31, 465-472 (2008).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dieses Protokoll beschreibt einen Ansatz zu untersuchen, wie Verhalten, insbesondere schlafen, um die Immunantwort Parametern verknüpft. Zu diesen Parametern gehören bakterielle Belastung, Überleben Ergebnis und NFkB-Aktivität, wie durch eine Luciferase-Reporter in vivo gemessen. Zusammen stellen diese Parameter liefern Informationen darüber, wie gut eine Fliege kann eine Infektion zu bekämpfen. Bakterielle Belastung und Überleben Ergebnis sind Immunantwort Parameter, die eine einfache Messung in Dro...

<table border="1"><tbody><tr><td> Material Name </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Inkubatoren </td><td> Percival Scientific, Inc. </td><td> I30BLLC8 I36VLC8 </td><td> Jeder Inkubator lauffähig programmierten Licht / Temperatur Zeitpläne angemessen ist. </td></tr><tr><td> Drosophila activitiy Monitore </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> DAM2 </td><td> Wie an anderer Stelle beschrieben 6, erfordert dieses System eine Computer-Schnittstelle, Software und anderes Zubehör. </td></tr><tr><td> Pyrex Glass Tubes </td><td> Trikinetics Inc., Waltham, MA </td><td> PGT-5x65 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Szintillations-und Lumineszenz-Zähler </td><td>Perkin Elmer </td><td> TopCount NXT 12 Detektor </td><td> Jede Mikroplattenleser zum Aufspüren von Lumineszenz kann für diese Art von Reporter-Assay verwendet werden. TopCount enthält mehrere Detektoren und eine automatisierte Stapler, es fähig ist, programmiert, um kontinuierlich ausgelesen aus mehreren Platten. </td></tr><tr><td> FluorChem 8900 </td><td> Alpha Innotech </td><td></td><td> Imaging von Bakterienkulturen ist optional; jede digitale Imaging-System mit sichtbarem Licht Fähigkeit ist ausreichend. </td></tr><tr><td> Feinpipettenziehvorrichtung </td><td> Tritech Research, Inc. </td><td> Narishige PC-10 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Vorräte </td></tr><tr><td> Borosilikatglas Kapillaren </td><td> World Precision Instruments Inc. </td><td> 1B100F-4 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml Spritze </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305482 </td><td></td></tr><tr><td> Syringe Needles </td><td> Fisher Scientific </td><td> BD 305196 </td><td> 18 G - entzieht der Spitze der Nadel, um eine Beschädigung des Schlauches zu verhindern. </td></tr><tr><td> Silikonschlauch, id (0,030 &quot;) od (0,065&quot;) Wandstärke (0,018 &quot;) </td><td> VWR </td><td> 60985-706 </td><td> Gebrauchte zur Befestigung Glaskapillare Nadeln mit einer Spritze </td></tr><tr><td> 3-Wege-Hahn </td><td> Amerikanischen Pharmaseal Unternehmen </td><td> K75 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle Cordless Motor </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749540-0000 </td><td></td></tr><tr><td> Kontes Pellet Pestle </td><td> Fisher Scientific </td><td> K749521-1590 </td><td></td></tr><tr><td> Glaskugeln 3mm </td><td> VWR </td><td> 26396-630 </td><td></td></tr><tr><td> Microplate Microlite 1 + </td><td> Thermo Scientific </td><td> 7571 </td><td> Select 96-Well-Platten, die für Lumineszenz sind - sie sind opak. </td></tr><tr><td> TopSeal-A :96-well Mikrotiterplatten </td><td> PerkinElmer </td><td> 6005185 </td><td> Microplate Press-On Adhesive Sealing Film </td></tr><tr><td> D-Luciferin, Kaliumsalz </td><td> Gold Biotechnology, Inc. </td><td> LUCNA </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Software </td></tr><tr><td> Insomniac2 </td><td> Erhältlich auf Anfrage bei den Autoren </td><td> custom; von Lesley Ashmore, Ph.D. geschrieben (Westminster College) </td><td> Matlab basierte Software, die verwendet wurde routinemäßig zur Analyse des Schlafes 2,6,11 </td></tr><tr><td> Drosonex </td><td> Erhältlich auf Anfrage bei den Autoren </td><td> custom; Thomas Coradetti (Sidewalk Software) geschrieben </td><td> Ein PC MSVC6 Programm für das Überleben Analyse von Rohdaten verwendet mit den gesammeltenTrikinetics System </td></tr><tr><td> Photoshop CS3 </td><td> Lehmziegel </td><td></td><td> Nützlich für den Erhalt Zahl der cfu / Platte aus digitalen Bildern (optional) </td></tr></tbody></table>

quantitative measurement of the immune response and sleep in drosophila

Eine komplexe Wechselwirkung zwischen der Immunantwort und Host Verhalten wurde in einer Vielzahl von Arten beschrieben worden. Überschüssiges Schlaf, insbesondere, ist bekannt, als Reaktion auf eine Infektion in Säugern 1 auftreten und kürzlich auch in Drosophila melanogaster 2 beschrieben. Es ist allgemein anerkannt, daß der Schlaf nützlich zum Host während einer Infektion ist, und dass es für die Beibehaltung einer robusten Immunsystems 3,4 wichtig. Jedoch gibt experimentelle Hinweise, dass diese Hypothese unterstützt begrenzte 4, und die Funktion des Schlafes Überschuß bei einer Immunantwort bleibt unklar. Wir haben einen multidisziplinären Ansatz verwendet, um dieses komplexe Problem anzugehen, und habe durchgeführten Studien in der einfachen genetischen Modellsystem der Fruchtfliege Drosophila melanogaster. Wir verwenden eine Standard-Test zur Messung lokomotorische Verhalten und schlafen in Fliegen, und zeigen, wie dieser Test verwendet wird, um das Verhalten der Fliegen infecte messend mit einem pathogenen Stamm von Bakterien. Dieser Assay ist auch nützlich zur Überwachung der Dauer des Überlebens in einzelnen Fliegen während einer Infektion. Zusätzliche Maßnahmen der Immunfunktion umfassen die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion und die Aktivierung von NFkB, ein wichtiger Transkriptionsfaktor, der von zentraler Bedeutung für die angeborene Immunantwort in Drosophila ist klar. Sowohl das Überleben Ergebnis und bakterielle Clearance während der Infektion zusammen sind Indikatoren für Widerstand und Toleranz gegenüber Infektionen. Widerstand bezieht sich auf die Fähigkeit der Fliegen, um eine Infektion zu löschen, während Toleranz als die Fähigkeit des Wirts, um eine Beschädigung von einer Infektion zu begrenzen und dadurch trotz hoher Pathogen innerhalb des Systems 5 überleben definiert ist. Echtzeit-Überwachung von NFKB Aktivität während der Infektion gibt einen Einblick in einen molekularen Mechanismus des Überlebens während der Infektion. Die Verwendung von Drosophila in diesen einfachen Tests erleichtert die genetische und molekulare Analysen des Schlafesund die Immunantwort und wie diese beiden komplexen Systemen wechselseitig beeinflusst.

<ol><li> Infektion fördert den Schlaf. In diesem Beispiel, Canton-S (CS) Wildtyp Mutante Fliegen und Fliegen fehlt ein NFKB Gens, Relish (Rel E20) 14 wurden in zwei DAM2 Aktivitätsmonitore geladen (n = 32 für jeden Genotyp) infiziert und, wie oben beschrieben. Fliegen wurden in konstantes Licht, um den Einfluss der circadianen Uhr auf Verhalten und Infektion zu eliminieren 2,7,8 aufrechterhalten. Die Rel E20 Mutanten wurden CS isogenized wie zuvor beschrieben 11. Beide S?...

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Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Um eine Verbindung zwischen der Immunantwort und Verhalten zu verstehen, beschreiben wir eine Methode, um Bewegungs-Verhalten zu messen<em&gt; Drosophila</em&gt; Während bakterielle Infektion als auch die Fähigkeit der Fliegen, um eine Immunantwort durch Überwachung Überleben, bakterielle Belastung und Echtzeit-Aktivität eines zentraler Regulator der angeborenen Immunität, NFKB montieren.

Quantitative Messung der Immunantwort und Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

quantitative-measurement-immune-response-sleep

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

15.3K Aufrufe.  University of Pennsylvania Perelman School of Medicine. Um eine Verbindung zwischen der Immunantwort und Verhalten zu verstehen, beschreiben wir eine Methode, um Bewegungs-Verhalten zu messen Drosophila Während bakterielle Infektion als auch die Fähigkeit der Fliegen, um eine Immunantwort durch Überwachung Überleben, bakterielle Belastung und Echtzeit-Aktivität eines zentraler Regulator der angeborenen Immunität, NFKB montieren.

Serie: Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development of vaccines and therapeutics1,2,3. Here, we describe a method for the detailed phenotypic and functional analyses of cellular immune responses, specifically intracellular cytokine production by CD4+ and CD8+ T cells as well as the individual memory subsets. We obtained precise quantitative and qualitative measures for the production of interferon gamma (INF-) and interleukin (IL) -2 in both CD4+ and CD8+ T cells from the rhesus macaque PBMC stimulated with PMA plus ionomycin (PMA+I). The cytokine profiles were different in the different subsets of memory cells. Furthermore, this protocol provided us the sensitivity to demonstrate even minor fractions of antigen specific CD4+ and CD8+ T cell subsets within the PBMC samples from rhesus macaques immunized with an HIV envelope peptide cocktail vaccine developed in our laboratory. The multicolor flow cytometry technique is a powerful tool to precisely identify different populations of T cells 4,5 with cytokine-producing capability6 following non-specific or antigen-specific stimulation 5,7.

We demonstrate the utility of multicolor flow cytometry for detailed phenotypic and functional characterization of total as well as memory subsets of CD4+ and CD8+ T cells in rhesus macaques, the ideal model for HIV/AIDS vaccine studies.

Multicolor Durchflusszytometrie Analysen der zellulären Immunantwort in Rhesusaffen

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Forschung

Immunologie und Infektion

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. 1A-C), females of the genus Leptopilina (Fig. 1D, 1F, 1G) and Ganaspis (Fig. 1E) attack the larval stages. We use these parasites to study the molecular basis of a biological arms race. Parasitic wasps have tremendous value as biocontrol agents. Most of them carry virulence and other factors that modify host physiology and immunity. Analysis of Drosophila wasps is providing insights into how species-specific interactions shape the genetic structures of natural communities. These studies also serve as a model for understanding the hosts' immune physiology and how coordinated immune reactions are thwarted by this class of parasites.
The larval/pupal cuticle serves as the first line of defense. The wasp ovipositor is a sharp needle-like structure that efficiently delivers eggs into the host hemocoel. Oviposition is followed by a wound healing reaction at the cuticle (Fig. 1C, arrowheads). Some wasps can insert two or more eggs into the same host, although the development of only one egg succeeds. Supernumerary eggs or developing larvae are eliminated by a process that is not yet understood. These wasps are therefore referred to as solitary parasitoids.
Depending on the fly strain and the wasp species, the wasp egg has one of two fates. It is either encapsulated, so that its development is blocked (host emerges; Fig. 2 left); or the wasp egg hatches, develops, molts, and grows into an adult (wasp emerges; Fig. 2 right). L. heterotoma is one of the best-studied species of Drosophila parasitic wasps. It is a "generalist," which means that it can utilize most Drosophila species as hosts1. L. heterotoma and L. victoriae are sister species and they produce virus-like particles that actively interfere with the encapsulation response2. Unlike L. heterotoma, L. boulardi is a specialist parasite and the range of Drosophila species it utilizes is relatively limited1. Strains of L. boulardi also produce virus-like particles3 although they differ significantly in their ability to succeed on D. melanogaster1. Some of these L. boulardi strains are difficult to grow on D. melanogaster1 as the fly host frequently succeeds in encapsulating their eggs. Thus, it is important to have the knowledge of both partners in specific experimental protocols.
In addition to barrier tissues (cuticle, gut and trachea), Drosophila larvae have systemic cellular and humoral immune responses that arise from functions of blood cells and the fat body, respectively. Oviposition by L. boulardi activates both immune arms1,4. Blood cells are found in circulation, in sessile populations under the segmented cuticle, and in the lymph gland. The lymph gland is a small hematopoietic organ on the dorsal side of the larva. Clusters of hematopoietic cells, called lobes, are arranged segmentally in pairs along the dorsal vessel that runs along the anterior-posterior axis of the animal (Fig. 3A). The fat body is a large multifunctional organ (Fig. 3B). It secretes antimicrobial peptides in response to microbial and metazoan infections.
Wasp infection activates immune signaling (Fig. 4)4. At the cellular level, it triggers division and differentiation of blood cells. In self defense, aggregates and capsules develop in the hemocoel of infected animals (Fig. 5)5,6. Activated blood cells migrate toward the wasp egg (or wasp larva) and begin to form a capsule around it (Fig. 5A-F). Some blood cells aggregate to form nodules (Fig. 5G-H). Careful analysis reveals that wasp infection induces the anterior-most lymph gland lobes to disperse at their peripheries (Fig. 6C, D).
We present representative data with Toll signal transduction pathway components Dorsal and Sp&auml;tzle (Figs. 4,5,7), and its target Drosomycin (Fig. 6), to illustrate how specific changes in the lymph gland and hemocoel can be studied after wasp infection. The dissection protocols described here also yield the wasp eggs (or developing stages of wasps) from the host hemolymph (Fig. 8).

An Introduction to Parasitic Wasps of Drosophila and the Antiparasite Immune Response

Parasitoid (parasitic) wasps constitute a major class of natural enemies of many insects including Drosophila melanogaster. We will introduce the techniques to propagate these parasites in Drosophila spp. and demonstrate how to analyze their effects on immune tissues of Drosophila larvae.

Eine Einführung in die parasitischen Wespen<em&gt; Drosophila</em&gt; Und die antiparasitäre Immune Response

Most known parasitoid wasp species attack the larval or pupal stages of Drosophila. While Trichopria drosophilae infect the pupal stages of the host (Fig. ...

Quantification of the Respiratory Burst Response as an Indicator of Innate Immune Health in Zebrafish

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ROS are toxic and function to kill phagocytized microorganisms. In vivo quantification of phagocyte-derived ROS provides information regarding an organism's ability to mount a robust innate immune response. Here we describe a protocol to quantify and compare ROS in whole zebrafish embryos upon chemical induction of the phagocyte respiratory burst. This method makes use of a non-fluorescent compound that becomes fluorescent upon oxidation by ROS. Individual zebrafish embryos are pipetted into the wells of a microplate and incubated in this fluorogenic substrate with or without a chemical inducer of the respiratory burst. Fluorescence in each well is quantified at desired time points using a microplate reader. Fluorescence readings are adjusted to eliminate background fluorescence and then compared using an unpaired t-test. This method allows for comparison of the respiratory burst potential of zebrafish embryos at different developmental stages and in response to experimental manipulations such as protein knockdown, overexpression, or treatment with pharmacological agents. This method can also be used to monitor the respiratory burst response in whole dissected kidneys or cell preparations from kidneys of adult zebrafish and some other fish species. We believe that the relative simplicity and adaptability of this protocol will complement existing protocols and will be of interest to researchers who seek to better understand the innate immune response.

The innate immune response protects organisms against pathogen infection. A critical component of the innate immune response, the phagocyte respiratory burst, generates reactive oxygen species that kill invading microorganisms. We describe a respiratory burst assay that quantifies reactive oxygen species produced when the innate immune response is chemically induced.

Die Quantifizierung der Atem Burst Antwort als Indikator für Angeborene Immunsystem Gesundheit in Zebrafisch

The phagocyte respiratory burst is part of the innate immune response to  pathogen infection and involves the production of reactive oxygen species (ROS). ...

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an intricate network of inducers, detectors, and activators rapidly responds to neuron damage, infection or other immune infractions. This inflammation of immune cells is intimately associated with the pathology of neurodegenerative disorders, such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease and ALS. Under compromised disease states, chronic inflammation, intended to minimize neuron damage, may lead to an over-excitation of the immune cells, ultimately resulting in the exacerbation of disease progression. For example, loss of dopaminergic neurons in the midbrain, a hallmark of PD, is accelerated by the excessive activation of the inflammatory response. Though the cause of PD is largely unknown, exposure to environmental toxins has been implicated in the onset of sporadic cases. The herbicide paraquat, for example, has been shown to induce Parkinsonian-like pathology in several animal models, including Drosophila melanogaster. Here, we have used the conserved innate immune response in Drosophila to develop an assay capable of detecting varying levels of nitric oxide, a cell-signaling molecule critical to the activation of the inflammatory response cascade and targeted neuron death. Using paraquat-induced neuronal damage, we assess the impact of these immune insults on neuroinflammatory stimulation through the use of a novel, quantitative assay. Whole brains are fully extracted from flies either exposed to neurotoxins or of genotypes that elevate susceptibility to neurodegeneration then incubated in cell-culture media. Then, using the principles of the Griess reagent reaction, we are able to detect minor changes in the secretion of nitric oxide into cell-culture media, essentially creating a primary live-tissue model in a simple procedure. The utility of this model is amplified by the robust genetic and molecular complexity of Drosophila melanogaster, and this assay can be modified to be applicable to other Drosophila tissues or even other small, whole-organism inflammation models.

Novel Whole-tissue Quantitative Assay of Nitric Oxide Levels in Drosophila Neuroinflammatory Response

Levels of the inflammatory cell-signaling molecule nitric oxide (NO) are commonly assayed using Griess reagent. In this protocol, we have created a modified Griess assay utilizing live Drosophila brain tissue in order to detect the secretion of NO in a simple, quantifiable and highly repeatable method.

Neuroinflammation is a complex innate immune response vital to the healthy function of the central nervous system (CNS). Under normal conditions, an ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Macrophages are key phagocytic innate immune cells. When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the pathogen, produce various cytokines and chemokines to recruit and stimulate other immune cells, and present antigens to stimulate the adaptive immune response. Thus, being able to efficiently manipulate macrophages with techniques such as RNA-interference (RNAi) is critical to our ability to investigate this important innate immune cell. However, macrophages can be technically challenging to transfect and can exhibit inefficient RNAi-induced gene knockdown. In this protocol, we describe methods to efficiently transfect two mouse macrophage cell lines (RAW264.7 and J774A.1) with siRNA using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System and describe procedures to maximize the effect of siRNA on gene knockdown. Moreover, the described methods are adapted to work in 96-well format, allowing for medium and high-throughput studies. To demonstrate the utility of this approach, we describe experiments that utilize RNAi to inhibit genes that regulate lipopolysaccharide (LPS)-induced cytokine production.

In this protocol, we describe methods to efficiently transfect murine macrophage cell lines with siRNAs using the Amaxa Nucleofector 96-well Shuttle System, stimulate the macrophages with lipopolysaccharide, and monitor the effects on inflammatory cytokine production.

Mit RNA-Interferenz, um die angeborene Immunantwort in Makrophagen der Maus Untersuchen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

The Utilization of Oropharyngeal Intratracheal PAMP Administration and Bronchoalveolar Lavage to Evaluate the Host Immune Response in Mice

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen interactions take advantage of intraperitoneal injections of select bacteria or pathogen associated molecular patterns (PAMPs) in mice. While these techniques have yielded tremendous data associated with infectious disease pathobiology, intraperitoneal injection models are not always appropriate for host-pathogen interaction studies in the lung. Utilizing an acute lung inflammation model in mice, it is possible to conduct a high resolution analysis of the host innate immune response utilizing lipopolysaccharide (LPS). Here, we describe the methods to administer LPS using nonsurgical oropharyngeal intratracheal administration, monitor clinical parameters associated with disease pathogenesis, and utilize bronchoalveolar lavage fluid to evaluate the host immune response. The techniques that are described are widely applicable for studying the host innate immune response to a diverse range of PAMPs and pathogens. Likewise, with minor modifications, these techniques can also be applied in studies evaluating allergic airway inflammation and in pharmacological applications.

The host immune response to pathogen infection is a tightly regulated process. Utilizing a lipopolysaccharide lung exposure model in mice, it is possible to conduct high resolution evaluations of the complex mechanisms associated with disease pathogenesis.

Die Nutzung der Oropharyngeale Intratracheale PAMP Verwaltung und bronchoalveoläre Lavage, um die Immunantwort in Mäusen Bewerten

The host immune response to pathogens is a complex biological process. The majority of in vivo studies classically employed to characterize host-pathogen ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

In-vitro-Analyse Myd88-vermittelte zelluläre Immunantwort gegen das West-Nil-Virus-Infektion Mutantenstamm

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of causing systemic disease in both fish and humans. A better understanding of S. iniae disease pathogenesis requires an appropriate model system. The genetic tractability and the optical transparency of the early developmental stages of zebrafish allow for the generation and non-invasive imaging of transgenic lines with fluorescently tagged immune cells. The adaptive immune system is not fully functional until several weeks post fertilization, but zebrafish larvae have a conserved vertebrate innate immune system with both neutrophils and macrophages. Thus, the generation of a larval infection model allows the study of the specific contribution of innate immunity in controlling S. iniae infection.
The site of microinjection will determine whether an infection is systemic or initially localized. Here, we present our protocols for otic vesicle injection of zebrafish aged 2-3 days post fertilization as well as our techniques for fluorescent confocal imaging of infection. A localized infection site allows observation of initial microbe invasion, recruitment of host cells and dissemination of infection. Our findings using the zebrafish larval model of S. iniae infection indicate that zebrafish can be used to examine the differing contributions of host neutrophils and macrophages in localized bacterial infections. In addition, we describe how photolabeling of immune cells can be used to track individual host cell fate during the course of infection.

Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Nicht-invasive Bildgebung von der angeborenen Immunantwort in einem Zebrafisch-Larven Modell<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infektions

The aquatic pathogen, Streptococcus iniae, is responsible for over 100 million dollars in annual losses for the aquaculture industry and is capable of ...

Qualitative and Quantitative Analysis of the Immune Synapse in the Human System Using Imaging Flow Cytometry

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins towards the immune synapse to assure a stable binding and signal exchange. Classical confocal, TIRF, or super-resolution microscopy have been used to study the immune synapse. Since these methods require manual image acquisition and time-consuming quantification, the imaging of rare events is challenging. Here, we describe a workflow that enables the morphological analysis of tens of thousands of cells. Immune synapses are induced between primary human T cells in pan-leukocyte preparations and Staphylococcus aureus enterotoxin B (SEB)-loaded Raji cells as APCs. Image acquisition is performed with imaging flow cytometry, also called In-Flow microscopy, which combines features of a flow cytometer and a fluorescence microscope. A complete gating strategy for identifying T cell/APC couples and analyzing the immune synapses is provided. As this workflow allows the analysis of immune synapses in unpurified pan-leukocyte preparations and hence requires only a small volume of blood (i.e., 1 mL), it can be applied to samples from patients. Importantly, several samples can be prepared, measured, and analyzed in parallel.

Here, we describe a complete workflow for the qualitative and quantitative analysis of immune synapses between primary human T cells and antigen-presenting cells. The method is based on imaging flow cytometry, which allows the acquisition and evaluation of several thousand cell images within a relatively short period of time.

Qualitative und Quantitative Analyse der immun Synapse im menschlichen System mit Hilfe von Imaging Durchflusszytometrie

The immune synapse is the area of communication between T cells and antigen-presenting cells (APCs). T cells polarize surface receptors and proteins ...

Two-photon Intravital Imaging of Leukocytes During the Immune Response in Lipopolysaccharide-treated Mouse Liver

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are extremely high, no direct treatment or organ-related mechanism has been examined in detail in real time. The liver is the key organ that manages toxins and infections in the human body. Herein, we aimed to perform intravital imaging of mouse liver after induction of endotoxemia in order to track the motility of immune cells, such as neutrophils and liver capsular macrophages (LCMs). Accordingly, we designed a novel surgical method for exposure of the liver with minimally invasive surgery. Mice were intraperitoneally injected with lipopolysaccharide (LPS), a common endotoxin. Using our novel surgical approach for exposure and intravital imaging of the mouse liver, we found that neutrophil recruitment in LPS-treated LysM-green fluorescent protein (GFP) mouse liver was increased compared with that in phosphate-buffered saline-treated liver. After LPS treatment, the number of neutrophils increased significantly with time. Additionally, using CX3Cr1-GFP mice, we successfully visualized liver resident macrophages called LCMs. Therefore, to investigate the efficacy of new reagents to control immune mobility in vivo, determining the motility and morphology of neutrophils and LCMs in the liver may allow us to identify therapeutic effect in organ failure and tissue damage caused by leukocytes activation in sepsis.

We established a novel surgical protocol for two-photon imaging of live mice liver with minimal invasion. With this technique, we identified the detailed structure of the liver during lipopolysaccharide-induced endotoxemia. We anticipate that this method may be utilized to determine the effectiveness of various reagents treatment to hepatic leukocyte migration.

Zwei-Photon intravitalen Bildgebung der Leukozyten im Rahmen der Immunantwort in Lipopolysaccharid behandelt Maus Leber

Sepsis is a type of severe infection that can cause organ failure and tissue damage. Although the mortality and morbidity rates associated with sepsis are ...