Wir danken den Labormitgliedern von Prof. Junhai Han für ihre Diskussionen und Kommentare. Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China 32170970 an Y.T und dem "Cyanine Blue Project" der Provinz Jiangsu an Z.C.Z.

Dieses Protokoll verwendet die 30 Tage alten w1118 Fliegen aus dem Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, siehe Materialtabelle).
1. Zubereitung der gereiften Fruchtfliegen
<ol><li>Zubereitung von Speisen<ol><li>Bereiten Sie Standard-Maisstärke-Nährmedium vor, indem Sie 50 g/l Cornflakes, 110 g/l Zucker, 5 g/l Agar und 25 g/l Hefe mischen. Die Cornflakes und die Hefe mit Wasser erhitzen, um sie zu verkleistern, und dann alle Substanzen vollständig auflösen.</li>
		<li>Wenn das Medium auf 50-60 °C abgekühlt ist, fügen Sie 6 ml/l Propionsäure hinzu und verpacken Sie sie sofort in Kulturflaschen.</li>
	</ol></li>
	<li>Fliegenaufzucht und Vorbereitung von gealterten Fliegen<ol><li>Züchten Sie den Fliegenstamm w1118in Flaschen, die ein Standard-Maisstärke-Nährmedium enthalten, und legen Sie die Flaschen in einen Inkubator mit konstanter Temperatur bei 25° C, 68% relativer Luftfeuchtigkeit, 500-1000 Lux Lichtverhältnissen und einem 12 h:12 h Hell-Dunkel-Zyklus.</li>
		<li>Setzen Sie die Fliegen alle 7 Tage entsprechend dem Wachstumszyklus der Fliegen in eine neue Flasche um, um das Alter der Individuen in derselben Flasche konstant zu halten.</li>
		<li>Sammeln Sie die neue Ladung Fliegen, die 3 Tage nach dem Umfüllen aus der ursprünglichen Flasche schlüpfen, und legen Sie sie in eine neue Flasche. Nach dem Prinzip, die Flasche alle 7 Tage zu wechseln, werden sie kultiviert, bis sie etwa 30 Tage alt sind.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Zubereitung von Arzneinahrung und Glasröhrchen für die Überwachung
ANMERKUNG: Das Verfahren zur Herstellung von Glasröhrchen folgt der Arbeit von Jin et al. mit Modifikationen34.
<ol><li>Reinigung und Trocknung von Glasrohren<ol><li>Das Glasröhrchen (5 mm Durchmesser x 65 mm Länge, siehe Materialtabelle) in ein großes Becherglas geben, einweichen und mit doppelt destilliertem Wasser 20 Minuten kochen. Wiederholen Sie dies 3 Mal.</li>
		<li>Entfernen und bündeln Sie das Glasröhrchen, spülen Sie das Innere 3-5 Mal mit doppelt destilliertem Wasser ab und legen Sie es zum Trocknen in einen Ofen.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung eines einfachen Nährmediums (100 ml)<ol><li>1,5 g Agar und 5 g Saccharose in doppelt destilliertem Wasser auflösen, erhitzen und auf 100 ml konzentrieren.</li>
		<li>Wenn das Medium auf ca. 70 °C abgekühlt ist, werden 600 μl Propionsäure zugegeben, um ein Erstarren durch ein Wasserbad mit konstanter Temperatur zu verhindern.</li>
		<li>Geben Sie ca. 4 ml einfaches Medium und Reserpin (siehe Materialtabelle) in ein kleines 10-ml-Becherglas, bis das Arzneimittel 20 μM oder 50 μM erreicht.</li>
	</ol></li>
	<li>Herstellung der Glasröhrchen mit dem Medikament<ol><li>Um das Fließen des Mediums zu erleichtern, führen Sie vorsichtig ein geeignetes Stück Glasröhrchen in ein kleines Becherglas ein. Das Medium gelangt aufgrund des atmosphärischen Drucks auf natürliche Weise in die Glasröhre.</li>
		<li>Ziehen Sie das Glasröhrchen heraus, wenn das Nährmedium vollständig erstarrt ist, und wischen Sie die Außenwand ab, um ein Überwachungsglasröhrchen mit einem Nährmedium zu erhalten, das an einem Ende Arzneimittel enthält.</li>
		<li>Das feste Paraffin in einem Becherglas erhitzen, bis es bei 70 °C schmilzt, das Ende des Glasröhrchens in der Nähe des Lebensmittels ca. 5 mm in die Paraffinflüssigkeit stecken und schnell entfernen. Warten Sie, bis das Paraffin erstarrt ist, um das Ende des Glasröhrchens zu versiegeln.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Versuchsplanung und Fliegenbehandlung
<ol><li>Entwerfen Sie das Experiment für die Fliegenbehandlung gemäß Tabelle 1.</li>
</ol>4. Drosophila-Assemblierung und Schlafüberwachung
ANMERKUNG: Das Verfahren für die Drosophila-Assemblierung folgt der Arbeit von Jin et al.34 mit Modifikationen.
<ol><li>Betäuben Sie Fliegen mit CO 2 -Gas, geben Sie sie in paraffinversiegelte Glasröhrchen (eines pro Röhrchen) und blockieren Sie dasNon-Food-Ende mit einem saugfähigen Wattebausch, um das Entweichen von Fliegen zu verhindern und die Luftzirkulation zu gewährleisten.</li>
	<li>Laden Sie Röhrchen auf den Infrarot-Monitor, um sie zu überwachen.<ol><li>Montieren Sie die Glasröhrchen mit den Fliegen auf einem Infrarotmonitor in der gleichen Richtung und notieren Sie die Monitornummer und die Lochnummer, die jedem Medikament entsprechen.</li>
		<li>Passen Sie die Ausrichtung jedes Tubus an und lassen Sie die Infrarotstrahlen vertikal durch die Mitte des Aktivitätsbereichs der Fliege gehen.</li>
		<li>Stellen Sie den Monitor in einen 25 °C warmen Inkubator in der Fliegenschlaf-Dunkelkammer und befolgen Sie die angegebenen Einstellungen: 25 °C Temperatur, Zeitgeber 12 (ZT12) (entspricht Ortszeit 20:00 Uhr) und ZT24 (entspricht Ortszeit 08:00 Uhr). Dieser Aufbau sorgt dafür, dass die Fliegen abwechselnd 12 Stunden Licht und Dunkelheit erleben. HINWEIS: Versuchen Sie, die Tür erst zu öffnen, wenn die Erfassung der Überwachungsdaten abgeschlossen ist, um während der Überwachung eine stabile Umgebung im Inkubator aufrechtzuerhalten.</li>
		<li>Starten Sie die Überwachung mit dem DAM2-System (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Sobald die Überwachung abgeschlossen ist, laden Sie die gesammelten Daten im .txt-Format aus dem System herunter.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Datenverarbeitung
HINWEIS: Die Datenverarbeitung mit dem DAM-System, DAMFileScan107 und SCAMP erfolgte gemäß den Anweisungen auf deren offiziellen Websites (siehe Materialtabelle).
<ol><li>Importieren Sie die obige txt-Datei zum Scannen in die DAMFileScan107-Software und teilen Sie sie nach Bedarf auf, um Schlafdaten zu erhalten.<ol><li>Stellen Sie die Startzeit der Segmentierungsdaten auf 8:01 Uhr (1-minütige Segmentierung) oder 8:00 Uhr (30-minütige Segmentierung) am dritten Morgen nach dem Start der Monitore ein, und die Beendigungszeit ist 8:00 Uhr drei Tage nach der Startzeit (Abbildung 2A1). HINWEIS: Fliegen müssen sich mindestens einen Tag lang an die Überwachungsumgebung anpassen. So kann man die Startzeit der geteilten Daten am dritten Tag nach Beginn des Monitors auf 8 Uhr morgens einstellen.</li>
		<li>Teilen Sie die Daten in Intervallen von 1 Minute und 30 Minuten auf. Ändern Sie die Option "Papierkorblänge" auf 1 Minute, ändern Sie die Option "Ausgabedateityp" in Kanaldateien, benennen Sie sie um und geben Sie sie aus. Die 30-minütige Datensegmentierungsmethode ist die gleiche wie oben (Abbildung 2A2-5). HINWEIS: Wenn Sie die Datensegmentierung in Intervallen von 1 Minute und 30 Minuten durchführen, sollte die endgültige Umbenennung der beiden Dateien konsistent sein. Andernfalls kann es bei der nachfolgenden Matlab-Verarbeitung unlesbar sein. Bei Bedarf kann der Dateiname nach der Ausgabe geändert werden, um die Unterscheidung zu erleichtern.</li>
	</ol></li>
	<li>Datenverarbeitung mittels SCAMP2020<ol><li>Öffnen Sie das Programmpaket SCAMP2020 in Matlab, und doppelklicken Sie auf Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Abbildung 2B).</li>
		<li>Fügen Sie dem Pfad den Unterordner "Vecsey SCAMP Scripts" hinzu, suchen Sie die Datei "scamp.m" in diesem Ordner und führen Sie sie aus. Wählen Sie im folgenden Popup-Fenster nacheinander die Prozessordner 1 min und 30 min aus (Abbildung 2C,D).</li>
		<li>Wählen Sie einen Monitor aus, klicken Sie auf Einzelne anzeigen Siehe Plots zur Vorschau (Abbildung 3A1) und überprüfen Sie das angezeigte Bild. Deaktivieren Sie den entsprechenden Kanal für tote Fliegen (Abbildung 3A2, Abbildung 3B).</li>
		<li>Wiederholen Sie die obigen Schritte, um alle Monitore zu überprüfen.</li>
		<li>Benennen Sie jeden Kanal in jedem Monitor basierend auf dem entsprechenden zu testenden Medikament um (Abbildung 3A3), wählen Sie alle Monitore aus und klicken Sie auf AUSGEWÄHLTE Daten für die Analyse analysieren (Abbildung 3A4).</li>
		<li>Standardmäßig auf die ausgewählte Option klicken, klicken Sie auf Analysieren für ausgewählten Abschnitt, aktivieren Sie Daten exportieren und klicken Sie schließlich auf GRAPH 30 min Datentypen für alle Tage für ausgewählte Gruppen und EXPORT Alle Daten , um die Ergebnisse auszugeben (Abbildung 3C).</li>
	</ol></li>
	<li>Wählen Sie die Datei mit dem Namen s30 aus der CSV-Datei aus, suchen Sie den entsprechenden Mittelwert und die Standardfehlerdaten für jeden Monitor, sichern Sie sie zur Änderung und Anpassung in Excel und fügen Sie sie in GraphPad Prism ein (siehe Materialtabelle), um ein Schlafstatusdiagramm zu zeichnen (Abbildung 4A,B).</li>
	<li>Suchen Sie die Datei mit dem Namen "stdur" und berechnen Sie die Durchschnittswerte für Tag, Nacht und Gesamtschlaf für jede Fliege innerhalb von drei Tagen (Abbildung 4A,C). Fügen Sie die Daten in die Prism-Software ein, um den Differenztest abzuschließen und ein Diagramm zu zeichnen.</li>
</ol>

Advancing Sleep Disorder Treatments: A &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt;-Based Screening Approach

<ol>
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A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronobiotics+KL001+and+KS15+extend+lifespan+and+modify+circadian+rhythms+of+Drosophila+melanogaster.">Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster.</a> Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).</li><li>Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+effects+of+dimethyl+sulfoxide+(DMSO):+changes+in+sleep+architecture+in+rats.">Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats.</a> Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).</li><li>Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Locomotor+activity+level+monitoring+using+the+Drosophila+Activity+Monitoring+(DAM)+System.">Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).</li><li>Gilestro, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Video+tracking+and+analysis+of+sleep+in+Drosophila+melanogaster.">Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster.</a> Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).</li><li>Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+ethomics+in+large+groups+of+Drosophila.">High-throughput ethomics in large groups of Drosophila.</a> Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).</li><li>Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JAABA:+interactive+machine+learning+for+automatic+annotation+of+animal+behavior.">JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior.</a> Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).</li><li>Donelson, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+positional+tracking+for+long-term+analysis+of+Drosophila+sleep+and+locomotion+using+the+&amp;#34;tracker&amp;#34;+program.">High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the &amp;#34;tracker&amp;#34; program.</a> Plos One. 7 (5), e37250 (2012).</li><li>Cichewicz, K., Hirsh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ShinyR-DAM:+a+program+analyzing+Drosophila+activity,+sleep+and+circadian+rhythms.">ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms.</a> Communications Biology. 1, 25 (2018).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden Interessen gibt.

Die beschriebene Methode eignet sich für ein schnelles Screening von kleinen und mittelgroßen Schlafmitteln. Derzeit basieren die meisten gängigen Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening-Methoden auf biochemischer und zellulärer Ebene. So werden beispielsweise die Struktur und die Eigenschaften des Rezeptors untersucht, um nach spezifischen Liganden zu suchen, die an ihn binden können22. Ein weiterer Ansatz besteht darin, den Bindungsmodus und die Stärke molekularer Fragmente ausgewählter Wirksto...

Schlaf, eines der wesentlichen Verhaltensweisen, die für das menschliche Überleben notwendig sind, ist durch zwei Hauptzustände gekennzeichnet: REM-Schlaf (Rapid Eye Movement) und NREM-Schlaf (Non-Rapid Eye Movement)1. Der NREM-Schlaf besteht aus drei Phasen: N1 (der Übergang zwischen Wachheit und Schlaf), N2 (leichter Schlaf) und N3 (Tiefschlaf, langsamer Wellenschlaf), die den Übergang vom Wachschlaf zum Tiefschlaf darstellen1. Schlaf spielt eine entscheidende Rolle für die körperliche und geistige Gesundheit2. Das Altern reduziert jedoch die Gesamtschlafdauer, die Schlafeffizienz, den Prozentsatz des Slow-Wave-Schlafs und den Prozentsatz des REM-Schlafs bei Erwachsenen3. Ältere Menschen neigen dazu, mehr Zeit im leichten Schlaf zu verbringen als im Slow-Wave-Schlaf, was sie empfindlicher auf nächtliches Erwachen macht. Mit zunehmender Anzahl des Erwachens nimmt die durchschnittliche Schlafzeit ab, was bei älteren Menschen zu einem fragmentierten Schlafmuster führt, das bei Mäusen mit einer übermäßigen Erregung von Hcrt-Neuronen verbunden sein kann4. Darüber hinaus trägt ein altersbedingter Rückgang der zirkadianen Mechanismen zu einer früheren Verschiebung der Schlafdauer bei 5,6. In Kombination mit körperlichen Erkrankungen, psychischem Stress, Umweltfaktoren und Medikamenteneinnahme machen diese Faktoren ältere Erwachsene anfälliger für Schlafstörungen wie Schlaflosigkeit, REM-Schlaf-Verhaltensstörung, Narkolepsie, periodische Beinbewegungen, Restless-Legs-Syndrom und schlafbezogene Atmungsstörungen 7,8.
Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Schlafstörungen eng mit chronischen Krankheiten bei älteren Menschen verbunden sind9, darunter Depressionen10, Herz-Kreislauf-Erkrankungen 11 und Demenz12. Die Behandlung von Schlafstörungen spielt eine entscheidende Rolle bei der Verbesserung und Behandlung chronischer Krankheiten und der Verbesserung der Lebensqualität älterer Erwachsener. Derzeit verlassen sich Patienten hauptsächlich auf Medikamente wie Benzodiazepine, Nicht-Benzodiazepine und Melatoninrezeptoragonisten, um die Schlafqualität zu verbessern13. Benzodiazepine können jedoch nach langfristiger Anwendung zu einer Herunterregulierung der Rezeptoren und einer Abhängigkeit führen, was nach Absetzen zu schweren Entzugserscheinungen führt14,15. Nicht-Benzodiazepin-Medikamente bergen ebenfalls Risiken, darunter Demenz 16, Frakturen17 und Krebs18. Der häufig verwendete Melatoninrezeptor-Agonist Ramelteon reduziert die Schlaflatenz, verlängert aber nicht die Schlafdauer und hat aufgrund der umfangreichen First-Pass-Eliminierung Bedenken hinsichtlich der Leberfunktion19. Agomelatin, ein Melatoninrezeptor-Agonist und Serotoninrezeptor-Antagonist, verbessert depressionsbedingte Schlaflosigkeit, birgt aber auch das Risiko von Leberschäden20. Folglich besteht ein dringender Bedarf an sichereren Medikamenten zur Behandlung oder Linderung von Schlafstörungen. Derzeitige Strategien zur Überprüfung von Arzneimitteln, die auf molekularen und zellulären Experimenten in Kombination mit automatisierten Systemen und Computeranalysen basieren, sind jedoch teuer und zeitaufwändig21. Strukturbasierte Strategien zur Entwicklung von Arzneimitteln, die sich auf die Struktur und die Eigenschaften von Rezeptoren stützen, erfordern ein klares Verständnis der dreidimensionalen Struktur von Rezeptoren und verfügen nicht über Vorhersagefähigkeiten für Arzneimittelwirkungen22.
Im Jahr 2000 etablierten Forscher auf der Grundlage der von Campbell und Tobler 1984 vorgeschlagenen Schlafkriterien23 einfache Tiermodelle, um den Schlaf zu untersuchen 24, darunter Drosophila melanogaster, das schlafähnliche Zustände aufwies25,26. Trotz der anatomischen Unterschiede zwischen Drosophila und dem Menschen sind viele neurochemische Komponenten und Signalwege, die den Schlaf in Drosophila regulieren, im Schlaf von Säugetieren konserviert, was die Untersuchung menschlicher neurologischer Erkrankungen erleichtert27,28. Drosophila wird auch in großem Umfang in zirkadianen Rhythmusstudien verwendet, trotz der Unterschiede in den Kernoszillatoren zwischen Fliegen und Säugetieren 29,30,31. Daher dient Drosophila als wertvoller Modellorganismus für die Untersuchung des Schlafverhaltens und die Durchführung schlafbezogener Wirkstoffscreenings.
Diese Studie schlägt einen kostengünstigen und einfachen phänotypbasierten Ansatz für das Screening von niedermolekularen Medikamenten zur Behandlung von Schlafstörungen mit gealterten Fliegen vor. Die Schlafregulation in Drosophila ist hochkonserviert25, und die mit zunehmendem Alter beobachtete Abnahme des Schlafes kann durch die Verabreichung von Medikamenten reversibel sein. Somit kann diese auf Schlafphänotyp basierende Screening-Methode intuitiv die Wirksamkeit von Medikamenten widerspiegeln. Wir füttern die Fliegen mit einer Mischung aus dem zu untersuchenden Medikament und Futter, überwachen und zeichnen das Schlafverhalten mit dem Drosophila Activity Monitor (DAM)32 auf und analysieren die gewonnenen Daten mit dem Open-Source-Datenpaket SCAMP2020 in MATLAB (Abbildung 1). Die statistische Analyse wird mit Hilfe von Statistik- und Grafiksoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle). Als Beispiel demonstrieren wir die Wirksamkeit dieses Protokolls, indem wir experimentelle Daten zu Reserpin präsentieren, einem niedermolekularen Inhibitor des vesikulären Monoamintransporters, von dem berichtet wird, dass er den Schlaf erhöht33. Dieses Protokoll bietet einen wertvollen Ansatz zur Identifizierung von Medikamenten zur Behandlung altersbedingter Schlafprobleme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ager</td>
			<td>BIOFROXX</td>
			<td>8211KG001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial Climate Box</td>
			<td>PRANDT</td>
			<td>PRX-1000A</td>
			<td>official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM2 Drosophila Activity Monitor</td>
			<td>TriKineics</td>
			<td>DAM2</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAM2system</td>
			<td>TriKineics</td>
			<td>version:v3.03</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAMFileScan</td>
			<td>TriKineics</td>
			<td>version:1.0.7.0</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl Sulfoxide</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Activity Monitoring Incubator</td>
			<td>Tritech Research</td>
			<td>DT2-CIRC-TK</td>
			<td>official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila Bottles</td>
			<td>Biologix</td>
			<td>51-17720</td>
			<td>official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drosophila: w1118</td>
			<td>Bloomington Drosophila Stock Center&#160;</td>
			<td>BDSC_3605</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td>version:Excel 2016</td>
			<td>official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass tubes</td>
			<td>TriKinetics</td>
			<td>PPT5x65</td>
			<td>official website:https://www.trikinetics.com/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MATLABR2022b</td>
			<td>MathWorks</td>
			<td>version:9.13.0.2049777</td>
			<td>official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version:Prism 8.0.1</td>
			<td>official website:https://www.graphpad.com/features</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reserpine</td>
			<td>MACKLIN</td>
			<td>R817202-1g</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saccharose</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>1245GR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SCAMP</td>
			<td>Vecsey Lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput small molecule drug screening for age-related sleep disorders using drosophila melanogaster

Schlaf, ein wesentlicher Bestandteil der Gesundheit und des allgemeinen Wohlbefindens, stellt ältere Menschen, die häufig unter Schlafstörungen leiden, die durch eine verkürzte Schlafdauer und fragmentierte Muster gekennzeichnet sind, oft vor Herausforderungen. Diese Schlafstörungen korrelieren auch mit einem erhöhten Risiko für verschiedene Krankheiten bei älteren Menschen, darunter Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und psychische Störungen. Leider sind bestehende Medikamente gegen Schlafstörungen mit erheblichen Nebenwirkungen wie kognitiven Beeinträchtigungen und Sucht verbunden. Folglich ist die Entwicklung neuer, sichererer und wirksamerer Medikamente gegen Schlafstörungen dringend erforderlich. Die hohen Kosten und die lange Versuchsdauer der derzeitigen Drogenscreening-Methoden bleiben jedoch limitierende Faktoren.
Dieses Protokoll beschreibt eine kostengünstige und durchsatzfähige Screening-Methode, die Drosophila melanogaster verwendet, eine Spezies mit einem im Vergleich zu Säugetieren hochkonservierten Schlafregulationsmechanismus, was sie zu einem idealen Modell für die Untersuchung von Schlafstörungen bei älteren Menschen macht. Durch die Verabreichung verschiedener kleiner Substanzen an gealterte Fliegen können wir deren Auswirkungen auf Schlafstörungen beurteilen. Das Schlafverhalten dieser Fliegen wird mit einem Infrarot-Monitoring-Gerät aufgezeichnet und mit dem Open-Source-Datenpaket Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020) analysiert. Dieses Protokoll bietet einen kostengünstigen, reproduzierbaren und effizienten Screening-Ansatz für die Schlafregulation. Fruchtfliegen eignen sich aufgrund ihres kurzen Lebenszyklus, ihrer geringen Haltungskosten und ihrer einfachen Handhabung hervorragend für diese Methode. Zur Veranschaulichung zeigte Reserpin, eines der getesteten Medikamente, die Fähigkeit, die Schlafdauer bei älteren Fliegen zu verlängern, was die Wirksamkeit dieses Protokolls unterstreicht.

Sleep, one of the essential behaviors necessary for human survival, is characterized by two main states: rapid eye movement (REM) sleep and non-rapid eye movement (NREM) sleep1. NREM sleep comprises three stages: N1 (the transition between wakefulness and sleep), N2 (light sleep), and N3 (deep sleep, slow wave sleep), representing the progression from wakefulness to deep sleep1. Sleep plays a crucial role in both physical and mental health2. However, aging reduces total sleep duration, sleep efficiency, slow-wave sleep percentage, and REM sleep percentage in adults3. Older individuals tend to spend more time in light sleep compared to slow-wave sleep, making them more sensitive to nocturnal awakenings. As the number of awakenings increases, average sleep time decreases, resulting in a fragmented sleep pattern in the elderly, which may be associated with excessive excitation of Hcrt neurons in mice4. Additionally, age-related declines in circadian mechanisms contribute to an earlier shift in sleep duration5,6. In combination with physical illness, psychological stress, environmental factors, and medication use, these factors make older adults more susceptible to sleep disorders, such as insomnia, REM sleep behavior disorder, narcolepsy, periodic leg movements, restless legs syndrome, and sleep-disordered breathing7,8.
Epidemiological studies have shown that sleep disorders are closely linked to chronic diseases in the elderly9, including depression10, cardiovascular disease11, and dementia12. Addressing sleep disorders plays a crucial role in improving and treating chronic diseases and enhancing the quality of life for older adults. Currently, patients primarily rely on drugs such as benzodiazepines, non-benzodiazepines, and melatonin receptor agonists to enhance sleep quality13. However, benzodiazepines can lead to downregulation of receptors and dependence after long-term use, causing severe withdrawal symptoms upon discontinuation14,15. Non-benzodiazepine drugs also carry risks, including dementia16, fractures17, and cancer18. The commonly used melatonin receptor agonist, ramelteon, reduces sleep latency but does not increase sleep duration and has hepatic function-related concerns due to extensive first-pass elimination19. Agomelatine, a melatonin receptor agonist and serotonin receptor antagonist, improves depression-related insomnia but also poses a risk of liver damage20. Consequently, there is an urgent need for safer drugs to treat or alleviate sleep disorders. However, current drug screening strategies, based on molecular and cellular experiments combined with automated systems and computer analysis, are expensive and time-consuming21. Structure-based drug design strategies, relying on receptor structure and properties, require a clear understanding of receptor three-dimensional structure and lack predictive capabilities for drug effects22.
In 2000, based on the sleep criteria proposed by Campbell and Tobler in 198423, researchers established simple animal models to study sleep24, including Drosophila melanogaster, which exhibited sleep-like states25,26. Despite anatomical differences between Drosophila and humans, many neurochemical components and signaling pathways regulating sleep in Drosophila are conserved in mammalian sleep, facilitating the study of human neurological diseases27,28. Drosophila is also extensively used in circadian rhythm studies, despite differences in core oscillators between flies and mammals29,30,31. Therefore, Drosophila serves as a valuable model organism for studying sleep behavior and conducting sleep-related drug screening.
This study proposes a cost-effective and simple phenotype-based approach for screening small-molecule drugs to treat sleep disorders using aged flies. Sleep regulation in Drosophila is highly conserved25, and the decline in sleep observed with age may be reversible through drug administration. Thus, this sleep phenotype-based screening method can intuitively reflect drug efficacy. We feed the flies with a mixture of the drug under investigation and food, monitor and record sleep behavior using the Drosophila Activity Monitor (DAM)32, and analyze the acquired data using the open-source SCAMP2020 data package in MATLAB (Figure1). Statistical analysis is performed using statistics and graphing software (see Table of Materials). As an example, we demonstrate the effectiveness of this protocol by presenting experimental data on Reserpine, a small-molecule inhibitor of the vesicular monoamine transporter reported to increase sleep33. This protocol provides a valuable approach to identify drugs for treating age-related sleep problems.

Author Spotlight: Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System 

Hochdurchsatz-Screening von niedermolekularen Medikamenten für altersbedingte Schlafstörungen mit Drosophila melanogaster

Reserpin ist ein niedermolekularer Inhibitor des vesikulären Monoamintransporters (VMAT), der die Wiederaufnahme von Monoaminen in präsynaptische Vesikel hemmt, was zu einem erhöhten Schlaf führt33. Die schlaffördernde Wirkung von Reserpin wurde an 30 Tage alten Fliegen untersucht, wobei die Kontrollgruppe ausschließlich mit dem Lösungsmittel Dimethylsulfoxid (DMSO) gefüttert wurde. In der Reserpin-Gruppe zeigten ältere Fliegen im Vergleich zur DMSO-Gruppe signifikant mehr Schlaf sowohl t...

Watch this Scientific Journal Video about Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System at JoVE.com

Vorgestellt wird ein Protokoll für das Hochdurchsatz-Wirkstoff-Screening zur Verbesserung des Schlafes durch Überwachung des Schlafverhaltens von Fruchtfliegen in einem älteren Drosophila-Modell .

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders ...

Zu den Wirkstoff-Screening-Techniken gehören das Hochdurchsatz-Screening, das die Automatisierung der Arzneimittelforschung nutzt, strukturbasierte Designs und die Suche nach rezeptorbindenden Molekülen auf der Grundlage der Struktur sowie ein fragmentbasiertes Design, bei dem Kernspinresonanz und Massenspektrometrie verwendet werden, um molekulare Fragmente zu optimieren und die Verbindungen zu identifizieren. Das DAM-System misst den Fliegenschlaf, indem es Infrarotstrahlsteine erkennt. Diese Methode kann jedoch den Schlaf überschätzen, wenn die Fliegen an einem Ende der Röhre statisch bleiben oder wenn die Fliege nicht sehr mobil ist.Darüber hinaus kann sich die Reihenfolge eines getesteten Medikaments auf den Verzehr von Fliegenfrüchten auswirken und möglicherweise die experimentellen Ergebnisse verzerren. Daher wird unser Experiment verschiedene Strecken beinhalten, um diese Faktoren zu mildern und die Genauigkeit zu erhöhen. Im Vergleich zu auf Videoanalyse basierenden Methoden bietet unsere Methode einen hohen Durchsatz, reduziert die Kosten und vereinfacht die Bedienung.Der Prozess der experimentellen Daten ist also auch relativ einfach, wobei das resultierende Diagramm die Wirkungen des Medikaments visuell darstellt.

high-throughput-small-molecule-drug-screening-for-age-related-sleep

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacology

Behavior

High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster

Unit 1

Pharmacotherapy of Depression and Anxiety Disorders

SCIENTISTS IN ACTION

1.5K Aufrufe.  Southeast University. Zu den Wirkstoff-Screening-Techniken gehören das Hochdurchsatz-Screening, das die Automatisierung der Arzneimittelforschung nutzt, strukturbasierte Designs und die Suche nach rezeptorbindenden Molekülen auf der Grundlage der Struktur sowie ein fragmentbasiertes Design, bei dem Kernspinresonanz und Massenspektrometrie verwendet werden, um molekulare Fragmente zu optimieren und die Verbindungen zu identifizieren. Das DAM-System misst den Fliegenschlaf, indem es Infrarotstrahlsteine erkennt. D...

Serie: Author Spotlight: Overcoming Challenges in Drosophila Sleep Measurement Using DAM System 

Sleep, an essential component of health and overall well-being, often presents challenges for older individuals who frequently experience sleep disorders characterized by shortened sleep duration and fragmented patterns. These sleep disruptions also correlate with an increased risk of various illnesses in the elderly, including diabetes, cardiovascular diseases, and psychological disorders. Unfortunately, existing drugs for sleep disorders are associated with significant side effects such as cognitive impairment and addiction. Consequently, the development of new, safer, and more effective sleep disorder medications is urgently needed. However, the high cost and lengthy experimental duration of current drug screening methods remain limiting factors.
This protocol describes a cost-effective and high-throughput screening method that utilizes Drosophila melanogaster, a species with a highly conserved sleep regulation mechanism compared to mammals, making it an ideal model for studying sleep disorders in the elderly. By administering various small compounds to aged flies, we can assess their effects on sleep disorders. The sleep behaviors of these flies are recorded using an infrared monitoring device and analyzed with the open-source data package Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). This protocol offers a low-cost, reproducible, and efficient screening approach for sleep regulation. Fruit flies, due to their short life cycle, low husbandry cost, and ease of handling, serve as excellent subjects for this method. As an illustration, Reserpine, one of the tested drugs, demonstrated the ability to promote sleep duration in elderly flies, highlighting the effectiveness of this protocol.

Presented is a protocol for high-throughput drug screening to improve sleep by monitoring the sleep behavior of fruit flies in an elderly Drosophila model.

Forschung

Verhalten

Drug Screening Method for Sleep Regulation in an Elderly Drosophila melanogaster Model

Drug Screening Method for Sleep Regulation in an Elderly Drosophila melanogaster Model  

To begin, take a bottle of flies, transfer them into a new bottle every seven days in sync with their growth cycle. Collect the next generation of flies that hatch from the initial bottle three days after transferring, and place them into a fresh bottle. Next, place the glass tube into a large beaker.Fill it with double distilled water and boil for 20 minutes. Then remove and bundle the glass tube. Rinse it three to five times with double distilled water, and place the glass tube in an oven to dry.Using a pipette, add four milliliters of sample buffer and reserpine into a 10 milliliter small beaker. For the negative control group, add dimethyl sulfoxide until the concentration reaches 0.2%Carefully insert an appropriate length of glass tube into a small beaker to facilitate the flow of the medium. Wait for the culture medium to fully solidify.Before removing the glass tube, wipe the outer wall to acquire a monitoring glass tube ensuring that one end contains the culture medium with drugs. Then heat solid paraffin in a beaker at 70 degrees Celsius until it melts. Immerse the glass tube's end in the liquid paraffin for about five millimeters and quickly remove it.Wait for the paraffin to solidify to seal the food end of the glass tube. Put the anesthetized flies into paraffin sealed glass tubes and block the non-food end with an absorbent cotton ball. Load the tubes onto an infrared monitor to keep watch over them.Align each tube so the infrared rays run vertically through the center of the flies active range. Set the monitor inside an incubator housed in the flies sleep darkroom.

Drug-Screening-Methode zur Schlafregulation in einem älteren Drosophila melanogaster-Modell

Analyzing the Effect of Reserpine on the Sleep Behavior of Drosophila melanogaster Using SCAMP2020 Data Package in MATLAB

Analyzing the Effect of Reserpine on the Sleep Behavior of Drosophila melanogaster Using SCAMP2020 Data Package in MATLAB  

To begin, monitor the sleep behaviors of flies using an infrared monitoring device and import the collected data in TXT format into the DAM file scan 107 software for scanning. Set the start time of the segmentation data to either 0800 or 0801 on the third morning after initiating the monitors to obtain one or 30 minute bin length data, respectively. Set the termination time to 8:00 AM on the third day post the set starting time.Adjust the bin length option to one minute and alter the output file type to channel files. Rename the file and generate the output. Now launch the SCAMP 2020 software package in MATLAB.Double click on Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB program. Added it sub-folder titled Vecsey SCAMP Scripts into the path. Locate the SCAMP.m file in that folder and run it. In the subsequent popup window sequentially select the folder named one minute and 30 minute. Then select a monitor and click on load individual C plots to preview.Inspect the image that appears and deselect the corresponding channel of any dead flies. Rename each channel in every monitor based on the corresponding drug to be tested. Select all monitors and click Analyze selected data for the analysis.Select the default option and then click on analyze for chosen bin feature. Check the export data box. Click on graph 30 minute data types for all days for selected groups, and export all data to generate the output of the results.Select the S30 file from the CSV file and locate the corresponding mean value and standard error data for each monitor. Save this data in Excel to make some adjustments before posting it into GraphPad Prism to formulate a sleep status diagram. Afterwards, locate the file named S-T-D-U-R and compute the average values of daytime, nighttime, and total sleep for each fly over three days.Paste data into GraphPad Prism to draw graphs. The sleep patterns of Reserpine and Dimethyl Sulfoxide on female and male flies over three consecutive days are shown. Quantitative analysis of the sleep behavior demonstrates a significant increase in sleep time in aged females fed Reserpine.The experiment on male flies also demonstrates a positive correlation between Reserpine concentration and the promotion of sleep.