Die Autoren bedanken sich bei Dr. Stephen Kingsmore und die Kinderradiologie Genome Medicine Center im Kinderkrankenhaus Mercy Krankenhäuser und Kliniken danken für die Nutzung ihrer Computing-Cluster für unsere Datenanalyse, Illumina Außendienst (Elizabeth Boyer, Scott Cook und Mark Cook) und technische Berater-Team für die schnellen Antworten und Anregungen auf dem Lauf der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Instrument, HiScanSQ und Datenqualität Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil von den National Institutes of Health Grants HL080042 (um SQY) unterstützt und Start-up-Fonds und Ausstattung der Kinder Mercy Krankenhäuser und Kliniken, University of Missouri in Kansas City (auf SQY).

<html> Ein Flussdiagramm, dieses Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Ein. Behandlung der Zellen mit Thrombin, RNA Isolation, Quality Assessment und Quantifizierung von RNA <ol><li> Kultur Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC-LBL) 90-100% Konfluenz in 6-Well-Platten in EGM-2-Medium mit 5% FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika (Lonza, cat # CC-3202). </li><li> Anderer Medien zu den Hungermedium (0% FBS) 30 min vor der Behandlung mit Thrombin. </li><li> Behandlung der Zellen mit 0,05 U / ml Thrombin oder lassen unbehandelten als Kontrolle für 6 h bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Isolieren der Gesamt-RNA aus den behandelten und Kontroll-Zellen unter Verwendung des Ambion mir Vana Kit nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Bewerten Sie die Qualität der RNA mit einer Experion StdSense eukaryotischen RNA-Chip nach dem Standard-Protokoll auf dem Experion Automatisierte Elektrophorese Station (= &quot;_blank&quot;&gt; Www.bio-rad.com). </li><li> Quantifizierung der RNA mit einem Standard-spektrophotometrische Methode. </li></ol> 2. Library Construction und Sequenzierung <ol><li> Verwenden Sie 1 ug von hoher Qualität Gesamt-RNA pro Probe als Ausgangsmaterial. </li><li> Um die Bibliothek zu bauen, folgen Sie den Standard-Verfahren von Illumina (Protokoll # 15008136 Rev. A). In diesem Protokoll zwei Runden von Poly (A) enthaltende mRNA Auswahlen werden durchgeführt, um zu entfernen, um die rRNA rRNA-Sequenzierung zu minimieren. </li><li> Bewerten Sie die Qualität der Bibliotheken mit einem Experion DNA 1K-Chip nach dem Standard-Protokoll auf dem Experion Automatisierte Elektrophorese Station ( <a href="http://www.bio-rad.com" target="_blank">www.bio-rad.com</a> ). </li><li> Quantifizierung der Bibliothek mit qPCR: Verwenden Sie eine Bibliothek, die zuvor als Standardkurve und spezifische Primer für die ligierten Adapter wurde sequenziert. Verwenden Sie eine Reihe von Verdünnungen der unbekannten Bibliotheken (dh 1:100, 1:500 und 1:1000). Führen Sie die qPCR according der SyberGreen MM-Protokoll und berechnen den ursprünglichen Bestand Konzentration von jeder Bibliothek. </li><li> Verdünnen Sie die Bibliotheksbestände bis 10 nm und bei -20 ° C bis zum Cluster eine Durchflusszelle. </li><li> Wenn Sie bereit sind Cluster eine Durchflusszelle, auftauen der CBOT Reagenz Platte in einem Wasserbad. CBOT ist eine Illumina Instrument benutzt, um die Cluster-Generation zu rationalisieren. </li><li> Waschen Sie die CBOT Instrument. </li><li> Denaturierung der Bibliotheken: Kombinieren Sie 13 ul 1x TE und 6 ul 10 uM Bibliothek und an der Seite des Rohres, fügen Sie 1 ul 1 N NaOH (von Illumina). Vortex, Spin-down, Inkubation bei Raumtemperatur für 5 min und legen die denaturierten Bibliotheken auf Eis. </li><li> Verdünnt den Bibliotheken: Verdünnen der denaturierten Bibliotheken mit vorgekühlten Hybridisierungspuffer (HT1, bereitgestellt durch Illumina) durch Kombinieren 996 ul HT1 und 4 ul denaturierten Bibliothek nach einer Endkonzentration von 12 pM. Legen Sie die denaturiert und verwässert Bibliotheken auf Eis. </li><li> Invert jede Zeile der Rohre der CBOT Platte,sicherzustellen, dass alle Reagenzien aufgetaut werden. Spin-Down der Platte entfernen / Punktion der Folie Dichtungen und laden auf der CBOT. </li><li> Aliquot 120 ul der verdünnten, denaturierten Bibliotheken auf einen Streifen Gefäß mit der Beschriftung 1-8. Mit 1,2 ul verdünnte, vergällt PhiX Control-Bibliothek (von Illumina) in jedes Röhrchen als spike-Kontrolle. Vortex und Spin-down der Rohre und laden Sie sie an der CBOT in der richtigen Ausrichtung (Röhrchen Nr. 1 auf der rechten Seite). </li><li> Legen Sie eine Durchflusszelle und vielfältig auf die CBOT. </li><li> Füllen Sie die Strömung zu überprüfen und beginnen das Clustering Lauf. </li><li> Nach dem Lauf abgeschlossen ist, überprüfen Reagenz Lieferung in allen Gassen. Notieren Sie alle Auffälligkeiten. Entweder starten die Sequenzierung Lauf sofort oder lagern Sie die Durchflusszelle in der mitgelieferten Röhrchen bei 4 ° C. </li><li> Tauen die Sequenzierung durch Synthese (SBS, Illumina) Reagenzien. </li><li> Legen Sie die Reagenzien zu den entsprechenden Stellen auf den Reagenzgefäße, was sicher nicht zu den anderen Reagenzien nach dem Berühren der Spaltung Mix berühren. </li><li> Verwendung eines nichtn-Sequenzierung Durchflusszelle (dh eine, die zuvor wurde sequenziert), prime die Reagenzleitungen zweimal. </li><li> Reinigen Sie die Sequenzierung Durchflusszelle mit 70% EtOH und Kimwipes, um 70% EtOH und Brillenputztuch gefolgt. Überprüfen Sie die Durchflusszelle für alle Streifen. Re-Reinigung, wenn nötig. </li><li> Laden die Flußzelle auf dem Sequenzer und führen einen Strom überprüfen, um sicherzustellen, dass die Dichtung zwischen dem Verteiler und der Durchflusszelle dicht ist. </li><li> Starten Sie die Sequenzierung Lauf. </li><li> Bewerten Sie die Qualität Metriken (zB die Cluster-Dichte, Clustern vorbei Filter, Q30, Intensität), sobald sie verfügbar während des Laufs werden. </li><li> Überwachen Intensität über die gesamte Auflage. </li><li> Nach 101 Zyklen abgeschlossen sind, führen Turnaround Chemie zur Vollendung des zweiten lesen: Tauen Sie die Paired-End-Reagenzien und die zweite Lese Incorporation Buffer (ICB, eine Komponente des SBS Reagenzien, Illumina) und laden Sie die Reagenzien. </li><li> Fahren Sie mit der Sequenzierung Lauf Beurteilung 2 nd lesen Intensität, Q30 einnd anderen Qualitätsmetriken als Lauf fortschreitet. </li></ol> 3. Data Analysis <ol><li> Verwenden Sie die neueste Version von Casava (Illumina, derzeit 1.8.2), um die Basis-Call-Dateien (. Bcl) Dateien. Fastq Dateien zu konvertieren, setzen fastq-cluster-count auf 0, um die Schaffung eines einheitlichen fastq Datei für jede Probe zu gewährleisten . Entpacken Sie die fastq Dateien für nachgeschaltete Analyse. </li><li> Führen gepaart Ende Ausrichtung mit den neuesten Versionen von TopHat (1.4.1) 5, die RNA-seq liest Säuger-sized Genome mit dem Ultra-High-Throughput-Kurz read Ausrichter (Bowtie, 0.12.7) 6 und samtools (0,1 ausrichtet. 17) 7. Samtools implementiert verschiedene Dienstprogramme für die Nachbearbeitung Ausrichtungen in der SAM-Format. Der Verweis menschlichen Transkriptom aus iGenomes (heruntergeladen werden <a href="http://www.illumina.com" target="_blank">www.illumina.com</a> ). Im laufenden TopHat, haben wir alle Standard-Parametereinstellungen einschließlich der Bibliothek Typ Option fr-unverseilten (default). </li><li> UnsIng. das Programm CuffDiff ein Teil der Manschettenknöpfe (1.3.0) 8 Softwarepaket, vergleicht die Thrombin-behandelten Zellen zu den Kontrollen Zellen herauszufiltern die differentiell exprimierten Gens Transkripte in der ehemaligen am menschlichen Referenz Transkriptom basiert. Dieser Vergleich ermittelt die differentielle Expression von bekannten Transkripte. Verwenden Sie Microsoft Excel, um das Ergebnis in tabellarischer Form darzustellen. Im laufenden Manschettenknöpfe Programm, haben wir alle Standard-Parametereinstellungen. Diese Gentranskripten mit FPKM &lt;0,05 und p&gt; 0,05 herausgefiltert. </li><li> Um neue Isoformen erkennen, führen Manschettenknöpfe ohne einen Verweis Transkriptom. Vergleichen Sie die Probe transcript Dateien auf den Referenz-Genom mit Cuffcompare und testen Sie die differentielle Expression mit Cuffdiff mit kombiniertem Thrombin transcript-Dateien als Referenz Genom für eine Analyse und die kombinierte Steuerung transcript-Dateien als Referenz Genom für eine zweite Analyse. Verwenden Sie Microsoft Excel, um das Ergebnis in tabellarischer Form darzustellen. Wieder those Gentranskripten mit FPKM &lt;0,05 und p&gt; 0,05 herausgefiltert. Nach diesem Schritt können die Ermittler entscheiden, um eine Liste der neu gemeldeten Transkripte der UCSC Genome Browser Website (Upload <a href="http://genome.ucsc.edu/" target="_blank">http://genome.ucsc.edu/</a> ) auf ihre Gültigkeit durch eine manuelle Inspektion zu überprüfen. </li><li> Senden Listen differentiell exprimierter Gene Ingenuity Pathway Analysis (IPA, <a href="www.ingenuity.com" target="_blank">www.ingenuity.com</a> ) zur Charakterisierung der Gene und Signalwege durch den Thrombin Behandlung nicht beeinflusst. In diesem Schritt kann die Ermittler entscheiden, Kummerbund (verwenden <a href="http://compbio.mit.edu/cummeRbund/" target="_blank">http://compbio.mit.edu/cummeRbund/</a> ), eine R-Paket, das entworfen, um zu helfen und vereinfachen die Aufgabe der Analyse Manschettenknöpfe RNA-seq ausgegeben wird, um die Verwaltung, Visualisierung und Integration aller Daten durch einen Cuffdiff Analyse hergestellt. </li></ol> 4. Validierung der RNA-seq Ergebnisse mittels quantitativer real-time-Polymerase Chain Reaction (qRT-PCR) <ol><li> Führen Gesamt-RNA Isolation von Steuerung und Thrombin behandelten HMVEC-LBL-Zellen, RNA Qualitätsbewertung und RNA-Quantifizierung in den Schritten von 1,4 bis 1,6 beschrieben. </li><li> Generieren komplementäre DNA von 1 pg Gesamt-RNA jeder Probe mit SuperScript III First-Strand Synthesis System RT Kits nach den Anweisungen des Herstellers (Invitrogen, 18080-051). </li><li> Führen qRT-PCR-Analyse auf einem Applied Biosystems VIIa 7 Real-Time PCR System mit TaqMan-Assay-on-Demand entwickelt Oligonukleotide für die Detektion von CUGBP, Elav-likefamilymember1 (CELF1, Hs00198069_m1), Fanconianemia, complementationgroupD2 (FANDCD2, Hs00276992_m1), TNFreceptor -associated factor 1 (TRAF1, Hs01090170_m1) und β-Aktin (ACTB, Hs99999903_m1). Jede Probe wies eine Vorlage entspricht 5 ng Gesamt-RNA. Messen Quantifizierung mit dem DDCt Methode und zu normalisieren, um β-Aktin. Jeder Test wurde über mindestens drei biologischen Replikaten durchgeführt. </li></ol>

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	<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq:+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics.">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 57-63 (2009).</li><li>Shendure, J., Ji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+DNA+sequencing.">Next-generation DNA sequencing.</a> Nat. Biotechnol. 26, 1135-1145 (2008).</li><li>Marioni, J. C., Mason, C. E., Mane, S. M., Stephens, M., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+an+assessment+of+technical+reproducibility+and+comparison+with+gene+expression+arrays.">RNA-seq: an assessment of technical reproducibility and comparison with gene expression arrays.</a> Genome Res. 18, 1509-1517 (2008).</li><li>Zhang, L. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq+Reveals+Novel+Transcriptome+of+Genes+and+Their+Isoforms+in+Human+Pulmonary+Microvascular+Endothelial+Cells+Treated+with+Thrombin.">RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin.</a> PLoS One. 7, e31229 (2012).</li><li>Trapnell, C., Pachter, L., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TopHat:+discovering+splice+junctions+with+RNA-Seq.">TopHat: discovering splice junctions with RNA-Seq.</a> Bioinformatics. 25, 1105-1111 (2009).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25, 2078-2079 (2009).</li><li>Trapnell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcript+assembly+and+quantification+by+RNA-Seq+reveals+unannotated+transcripts+and+isoform+switching+during+cell+differentiation.">Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation.</a> Nat. Biotechnol. 28, 511-515 (2010).</li><li>Khatri, P., Sirota, M., Butte, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ten+years+of+pathway+analysis:+current+approaches+and+outstanding+challenges.">Ten years of pathway analysis: current approaches and outstanding challenges.</a> PLoS Comput. Biol. 8, e1002375 (2012).</li><li>Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Working+with+RNA.">Working with RNA.</a> Methods. Mol. 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G., Guttman, M., Trapnell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computational+methods+for+transcriptome+annotation+and+quantification+using+RNA-seq.">Computational methods for transcriptome annotation and quantification using RNA-seq.</a> Nat. Methods. 8, 469-477 (2011).</li><li>Martin, J. A., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+transcriptome+assembly.">Next-generation transcriptome assembly.</a> Nat. Rev. Genet. 12, 671-682 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Wichtige Schritte RNA Handhabung: RNasen sogar verschlechtern die meisten hochwertigen RNA, daher muss darauf bei der Isolierung, Lagerung und Verwendung von RNA 10 entnommen werden. Handschuhe sind immer getragen werden, um Verschmutzungen durch RNasen auf die menschliche Hände fanden verhindern. Handschuhe sollten häufig gewechselt werden, insbesondere nach dem Berühren der Haut, Türklinken oder anderen gängigen Oberflächen. Eine Reihe von Pipetten sollten au...

<table border="1"><tbody><tr><td width="183"> Reagenzien oder Ausrüstungen </td><td width="85"> Firma </td><td width="185"> Katalognummer </td><td width="359"> Kommentare </td></tr><tr><td> Human Lung mikrovaskulären Endothelzellen </td><td> Lonza </td><td> CC-2815 </td><td></td></tr><tr><td> Lonza, Bullet Kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3202 </td><td> EGM-2 enthält, FBS, Wachstumsfaktoren und Antibiotika </td></tr><tr><td> Thrombin </td><td> Sigma </td><td> T4393 </td><td></td></tr><tr><td> Ambion mir Vana Kit </td><td> Life Technologies </td><td> AM 1560 </td><td></td></tr><tr><td> RNase-Zap </td><td> Life Technologies </td><td> AM9782 </td><td></td></tr><tr><td> Experion StdSens RNA </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7103 </td><td></td></tr><tr><td> TruSeq RNA-PräparationSatz </td><td> Illumina </td><td> FC-122-1001 </td><td></td></tr><tr><td> AMPureXP Beads </td><td> Beckman Coulter </td><td> A63881 </td><td></td></tr><tr><td> Superscript Reverse Transkriptase II </td><td> Life Technologies </td><td> 18064-014 </td><td></td></tr><tr><td> Experion DNA 1K </td><td> Bio-Rad </td><td> 700-7107 </td><td></td></tr><tr><td> QuantiTect SyberGreen </td><td> Qiagen </td><td> 204163 </td><td></td></tr><tr><td> PE Cluster-Generation Kit </td><td> Illumina </td><td> PE-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> PhiX Control Kit </td><td> Illumina </td><td> FC110-301 </td><td></td></tr><tr><td> 200 Zyklus SBS Kit </td><td> Illumina </td><td> FC-401-3001 </td><td></td></tr><tr><td> HiScanSQ * </td><td> Illumina </td><td> SY-103-2001 </td><td></td></tr><tr><td> CBOT </td><td> Illumina </td><td> SY-301-2002 </td><td></td></tr><tr><td> qPCR Maschine - Viia7 </td><td> Life Technologies </td><td> Model # VIIA7 / Equipment # 10631261 </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td> Experion-System </td><td> Bio Rad </td><td> 7007001 </td><td> Bioanalyzer ist ein alternatives System </td></tr><tr><td> Spektrophotometer </td><td> Bio-Tek </td><td> Epoch Mikroplatten-Spektralphotometer </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td> Zentrifuge - Sorvall Legend XTR </td><td> Thermo Scientific </td><td> 75004521 </td><td> Oder gleichwertig </td></tr><tr><td> Magnetfuß </td><td> Life Technologies </td><td> AM10027 </td><td></td></tr><tr><td> 96-well Thermocycler </td><td> General Lab Lieferant </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 3. Liste der Key Reagenzien und Major Equipment. *, In dem Video wurde HiSeq1000 statt HiScanSQ demonstriert. </td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of transcriptomes in thrombin-treated and control human pulmonary microvascular endothelial cells

Die Charakterisierung der Genexpression in Zellen über Messung der mRNA ist ein nützliches Werkzeug bei der Bestimmung, wie der transkriptionellen Maschinerie der Zelle von externen Signalen (zB Arzneimittelbehandlung) oder wie Zellen unterscheiden zwischen einem gesunden Zustand und einem erkrankten Zustand ist betroffen. Mit dem Aufkommen und kontinuierliche Weiterentwicklung der nächsten Generation DNA-Sequenzierung Technologie hat RNA-Sequenzierung (RNA-seq) eine zunehmend beliebte Methode der Transkriptom-Analyse, um alle Arten von Transkripten zu katalogisieren, um die transkriptionelle Struktur aller exprimierten Gene zu ermitteln und zu quantifizieren die wechselnden Expressionsniveaus des gesamten Satzes von Transkripten in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Organismus 1,2. RNA-seq ersetzt nach DNA-Mikroarrays als bevorzugte Methode für die Transkriptom-Analyse, da sie die Vorteile der Profilierung eine komplette Transkriptom hat, ein digitales Typ Datum (Kopienzahl jeder transcript) und sich auf keine bekannten genomischen sequence 3. Hier stellen wir eine vollständige und detaillierte Protokoll RNA-seq zum Profil Transkriptomen gelten in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung. Dieses Protokoll basiert auf unseren kürzlich veröffentlichten Studie mit dem Titel basiert &quot;RNA-seq enthüllt Novel Transkriptom von Genen und deren Isoformen in Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin behandelt,&quot; 4, in denen wir erfolgreich durchgeführt die erste komplette Transkriptom-Analyse der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen behandelt mit Thrombin mittels RNA-seq. Es ergab beispiellose Ressourcen für weitere Experimente, um Einblicke in die molekularen Mechanismen, die Thrombin-vermittelte endotheliale Dysfunktion in der Pathogenese von entzündlichen Erkrankungen, Krebs, Diabetes und koronare Herzkrankheit zu gewinnen, und bietet potenziellen neuen Leads für therapeutische Targets zu diesen Krankheiten. Der beschreibende Text des Protokollsist in vier Teile gegliedert. Der erste Teil beschreibt die Behandlung von pulmonaler menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen mit Thrombin und RNA-Isolation, Qualität Analyse und Quantifizierung. Der zweite Teil beschreibt Aufbau der Bibliothek und Sequenzierung. Der dritte Teil beschreibt die Analyse der Daten. Der vierte Teil beschreibt einen RT-PCR Validierung Assay. Repräsentative Ergebnisse von mehreren wichtigen Schritten angezeigt. Nützliche Tipps oder Hinweise auf zu Erfolg in wichtigen Schritten zu steigern sind in der Diskussion Abschnitt. Obwohl dieses Protokoll verwendet menschlichen pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellen mit Thrombin behandelt wird, kann es sein, generalisierte zum Profil Transkriptomen in beiden Säuger und Nicht-Säuger-Zellen und in Geweben mit unterschiedlichen Stimuli oder Inhibitoren oder Transkriptomen in Zellen oder Geweben zwischen einem gesunden Zustand vergleichen behandelten und einen Krankheitszustand.

Für Schritt 1: Die 28s: 18s-Verhältnis wird traditionell als Indikator für die RNA-Abbau verwendet. Idealerweise sollte die 28s Peak etwa doppelt der Fläche der 18s Band (ein Verhältnis von 2) aufweisen, wird dies jedoch oft nicht ideale Verhältnis in der Praxis angesehen. Weiterhin 28s: 18s können Verhältnisse von spektrophotometrischen Methoden erhalten unterschätzen die Menge des Abbaus der RNA. Um genauer zu quantifizieren den Abbau und somit die Qualität der RNA-Probe, berechnet das Syste...

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RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

rna-seq-analysis-transcriptomes-thrombin-treated-control-human

Research

JoVE Journal

Biology

21.8K Aufrufe.  Children's Mercy Hospital and Clinics, School of Medicine, University of Missouri-Kansas City. Dieses Protokoll stellt eine vollständige und detaillierte Verfahren zur RNA-seq, eine leistungsstarke Next-Generation-DNA-Sequenzierung Technologie zum Profil Transkriptomen in der menschlichen Lunge mikrovaskulären Endothelzellen mit oder ohne Thrombin Behandlung anzuwenden. Dieses Protokoll ist generalisierbar verschiedenen Zellen oder Geweben von verschiedenen Reagenzien oder Krankheitszuständen befallen.

Serie: RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Die Kultivierung der menschlichen Nasen Epithelzellen an der Air flüssig-Grenzfläche

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic by-products, as exemplified by exercising skeletal muscle. Endothelial cells (ECs) line the intima of all resistance vessels and serve a key role in controlling diameter (e.g.&#160;endothelium-dependent vasodilation) and, thereby, the magnitude and distribution of tissue blood flow. The regulation of vascular resistance by ECs is effected by intracellular Ca2+ signaling, which leads to production of diffusible autacoids (e.g.&#160;nitric oxide and arachidonic acid metabolites)1-3 and hyperpolarization4,5 that elicit smooth muscle cell relaxation. Thus understanding the dynamics of endothelial Ca2+ signaling is a key step towards understanding mechanisms governing blood flow control. Isolating endothelial tubes eliminates confounding variables associated with blood in the vessel lumen and with surrounding smooth muscle cells and perivascular nerves, which otherwise influence EC structure and function. Here we present the isolation of endothelial tubes from the superior epigastric artery (SEA) using a protocol optimized for this vessel.
To isolate endothelial tubes from an anesthetized mouse, the SEA is ligated in situ to maintain blood within the vessel lumen (to facilitate visualizing it during dissection), and the entire sheet of abdominal muscle is excised. The SEA is dissected free from surrounding skeletal muscle fibers and connective tissue, blood is flushed from the lumen, and mild enzymatic digestion is performed to enable removal of adventitia, nerves and smooth muscle cells using gentle trituration. These freshly-isolated preparations of intact endothelium retain their native morphology, with individual ECs remaining functionally coupled to one another, able to transfer chemical and electrical signals intercellularly through gap junctions6,7. In addition to providing new insight into calcium signaling and membrane biophysics, these preparations enable molecular studies of gene expression and protein localization within native microvascular endothelium.

We present a preparation for visualizing and manipulating calcium signaling in native, intact microvascular endothelium. Endothelial tubes freshly isolated from mouse resistance arteries supplying skeletal muscle retain in vivo morphology and dynamic signaling within and between neighboring cells. Endothelial tubes can be prepared from microvessels of other tissues and organs.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Analyse von oxidativem Stress in Zebrafischembryonen

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

Hochauflösende Zeitraffer-Imaging und automatische Analyse von Dynamik der Mikrotubuli in lebenden menschlichen Endothelzellen aus der Nabelvene

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.