Die Autoren danken Dr. Pooneh Bagher und Dr. Erika Westcott für redaktionelle Kommentare bei der Erstellung des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der National Heart, Lung and Blood Institute der National Institutes of Health unter preisNummern R37-R01-und HL041026 HL086483 SSS und F32-HL107050 zu MJS unterstützt. Dieser Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health.

1. Vorbereitung der Ausrüstung: Flusskammer, Pipetten und Lösungen <ol><li> Flusskammer: Verwenden Sie eine Strömungskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas auf dem Boden, die isolierten Endothelzellen Rohre (siehe Abbildung 1A) superfuse. Vor der Montage der Kammer, waschen Sie die Deckgläser mit beiden 3% HCl und 70% Ethanol gründlich mit Reinstwasser und trocken mit Stickstoffgas. </li><li> Pipetten: Drei verschiedene Arten von Pipetten werden in der Protokoll: Zugänge, Zerreiben und Pinning. Sowohl der Kanülierung und Pinning Pipetten vor dem Tag des Experiments werden, aber das Verreiben Pipette sollte der Tag, wie es die Kenntnis der Durchmesser des Behälters erfordert, um die Größe des Lumens geeignet gemacht werden. <ol><li> Kanülierung Pipetten: Um rote Blutzellen aus dem Lumen spülen, Borosilikatglas Kapillaren mit einer Mikropipette Puller, lange, sich verjüngende Enden zu ziehen. Brechen die Enden mit einer Pinzette an einem Außendurchmesser ca. 30% less als die der Arterien (~ 50-80 um), und Feuerpolitur die Spitze glatt zu sein (siehe Abbildung 1B). Es ist hilfreich, auch Winkel der Spitzen der Pipetten auf etwa 45 °. </li><li> Verreiben Pipetten: Um mechanisch distanzieren die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von den Endothelzellen Rohre, stellen Verreiben Pipetten aus Borosilikatglas Kapillaren. Bereiten Kapillaren, wie oben, und brechen Sie das Ende mit einer Pinzette. Tipp: Verwenden Sie ein Glas Scoring-Gerät zu erleichtern, um die dickere Wand der Glaspipette Verreiben sauber brechen. Brechen die Pipette an den Innendurchmesser am Tag des Experiments etwa 10-20 um größer als die des äußeren Durchmessers des Gefäßes aus dem Endothel-Röhrchen isoliert werden bestimmt. Feuerpolitur die Bruchenden bis glatt (siehe Abbildung 1C). </li><li> Pinning Pipetten: Zur Stabilisierung der endothelialen Rohr innerhalb der Durchflusskammer, stellen Pinning Pipetten, um die endotheliale t sichernUBE gegen das Deckglas Boden der Kammer. Ziehen Glaskapillaren in der gleichen Weise wie die Kanülierung Pipetten. Dann brechen die Enden mit einer Zange zu einem Durchmesser von ~ 100 um, und Feuerpolitur bis die Spitzen versiegelt sind, rund und glatt (siehe Abbildung 1D). Hinweis: Wenn die Spitze des Pinning Pipette nicht vollständig abgedichtet ist, wird Flüssigkeit in das Lumen eingeben kann und auch experimentelle Ergebnisse zu verwechseln. </li></ol></li><li> Lösungen: Alle Lösungen in hochreinem (18,2 M &amp;OHgr;) H 2 O und sterilisieren durch einen 0,2 &amp;mgr; m Filter. Stellen Sie sicher, die Osmolalität der Lösungen liegt zwischen 285-300 mOsm. Lösungen gut bleiben für etwa zwei Wochen bei 4 ° C gelagert <ol><li> Dissection Lösung: Die bei der Präparation der A. epigastrica superior verwendet Salzlösung wird von (in mmol / L) zusammen: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 N-2-Hydroxyethyl-N&#39;-2-ethansulfonsäure ( HEPES), 10 Glucose, 0,01 Natriumnitroprussid (SNP), eind 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) mit einem pH-Wert von 7,4. Der NO-Donor SNP ist eingeschlossen, um zu entspannen glatten Muskelzellen, wodurch sie leichter, um die Arterie kanülieren und glatte Muskelzelle Entfernung während Verreiben erleichtern. </li><li> Dissoziation Lösung: Das bei der Spaltung des endothelialer Gefäße verwendet Salzlösung von (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose, 2 CaCl 2 und 0,1% BSA, mit ein pH-Wert von 7,4. In ein 1 ml-Aliquot dieser Puffer hinzuzufügen: 0,62 mg / ml Papain, 1,5 mg / ml Kollagenase und 1,0 mg / ml Dithioerythritol. Da Enzyme, die von verschiedenen Lieferanten unterschiedlichem enzymatische Aktivität haben, sind die Produktnummern der für diese Arbeit verwendet als Referenz in der Tabelle von Materialien enthalten. Hinweis: Während der Protokoll sowohl Dissoziationspuffer und Dissoziationspuffer mit Enzymen an verschiedenen Schritten verwendet. </li><li> Superfusion Lösung: Die physiologische Salzlösung (PSS) für superfusin verwendetg der isolierten Endothelzellen Rohr aus (in mmol / l) besteht aus: 137 NaCl, 5 KCl, 1 MgCl 2, 10 HEPES, 10 Glucose und 2 CaCl 2, mit einem pH-Wert von 7,4. </li><li> Bereiten Puffer und Lösungen vor Beginn der chirurgischen Eingriffen. Entfernen Sie die Lösungen von 4 ° C und 50 ml Aliquot Dissection Puffer in einem 200 ml-Erlenmeyerkolben und legen Sie es auf Eis. Zusätzlich aliquote 50 ml Dissoziationspuffer ohne Enzyme und auf der Tischplatte auf Raumtemperatur kommen. Entfernen Sie die Superfusionslösung von 4 ° C und lassen Sie ihn auf Raumtemperatur auf der Bank oben ins Gleichgewicht. </li></ol></li></ol> 2. Vorbereitung der Tiere Stellen Sie sicher, dass alle Verfahren und Protokolle mit Tieren sind in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren. Die hier beschriebenen Verfahren wurden vom Animal Care und Verwenden Ausschuss der Universität bestätigtMissouri. <ol><li> Verwenden männlichen oder weiblichen Mäusen mindestens 9 Wochen alt und studieren jeweils einzeln. Betäuben eine Maus mit Pentobarbital-Natrium (60 mg / kg) durch intraperitoneale (ip) Injektion. Spitze: Verdünnen der Pentobarbital 10 mg / ml in steriler Kochsalzlösung vor der Injektion verringert die Möglichkeit einer Überdosierung. </li><li> Anästhesie beeinträchtigt Temperaturregelung, so halten Sie die Maus erwärmen unmittelbar nach der ersten Injektion von Pentobarbital. Mit einem Metallträger (belüftet Aluminium-Korb) auf einer Heizplatte (auf ~ 37 ° C kalibriert) funktioniert gut, um die Temperatur der Maus stabil zu halten. Alternativ können Sie auch eine Wärmelampe, kümmert sich um sie in einem angemessenen Abstand von der Maus zu positionieren. Überwachen Sie die Maus alle 5-10 Minuten, bis die entsprechende Ebene der Narkose erreicht ist (Mangel an Rücktritt bis Fuß oder Schwanz Prise). Nach 15-20 min kann eine Zusatzdosis erforderlich sein. Am besten ist es, langsam und mit Vorsicht vorgehen, um Überdosierung zu vermeiden, vor allem bei übergewichtigen, gealtert, oder Tiers anders betont. </li><li> Entfernen Sie die Haare von der Bauchseite nach der Rasur sorgfältig mit kleinen Tierhaarschneidemaschinen. Besondere Aufmerksamkeit sollte getroffen werden, um ein Trauma des Tieres zu vermeiden. Es ist hilfreich, alle Haare aus einem Gebiet stammen aus den Achselhöhlen bis zum Schambereich zu entfernen. Entfernen Sie lose anhaftende Haare mit einem frischen Alkoholtupfer. </li><li> Positionieren Sie die Maus auf den Rücken, wobei sowohl Vorder-und Hinterbeine verteilt, so viel von der Bauchwand wie möglich aussetzen liegt. Falls erforderlich, verwenden Labor Klebeband, um die Beine in einem Spread-Eagle Weise zu sichern. </li></ol> 3. Die Isolierung der A. epigastrica superior <ol><li> Einen kleinen Einschnitt durch die Haut unmittelbar über dem Bereich der Schamgegend. Stellen Sie sicher, dass nur die Haut wird geschnitten, während Vermeidung von Schäden an der zugrunde liegenden Bauchmuskeln, erweitern den Schnitt seitlich in jede Richtung aus, um entsprechende Hinterbeine. Weiterhin den Einschnitt rostral entlang der ventralen Mittellinie auf der Oberseite des Brustkorbs und dern verlängern den Schnitt seitlich in jede Richtung zu den jeweiligen Vorderbeine. </li><li> Heben Sie die Haut und mit einer Schere durchtrennen das Bindegewebe hält die Haut an die darunter liegende Muskulatur, wodurch die gesamte Oberfläche der Bauchmuskulatur ausgesetzt (siehe Abbildung 3A). Spülen Sie die freiliegende Muskel mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung. </li><li> Aufgrund der geringen Größe der SEA, positionieren Sie das Tier unter einem Stereomikroskop für weitere Verfahren. Heben Sie die Fettpolster an der Unterseite des Brustbeins mit einer Pinzette entfernt und einen Einschnitt durch. Setzen Sie den Schnitt entlang der unteren Rippe, dabei nicht zu tief in das darunter liegende Gewebe zu schneiden. Die SEA sollte sichtbar sein, darauf achten, nicht zu beschädigen. Nachdem der Schnitt fertig ist, bewässern die freiliegende Gewebe mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung. </li><li> Nachdem die oberste Schicht der Skelettmuskulatur eingefahren hat, sind das Meer und die darunter liegende Muskulatur leicht zu erkennen. Tipp: Beachten Sie die Länge derdie SEA in vivo vor Isolierung zu endothelialen Rohre (die sich entlang ihrer Achse nach der Isolierung zu verkürzen) sich auf ihre ursprüngliche Länge nähern. Mit einer Pinzette und Schere, auszuschneiden sorgfältig die dünne Muskelschicht unter der SEA. </li><li> Mit abgewinkelten Pinzette, passieren eine Länge von 6-0 Seidenfaden unter der SEA und Ligation der Arterie und den angrenzenden Vene, um es unter Druck und Blut in das Gefäßlumen zurückgehalten, um die Visualisierung während der nachfolgenden Isolierung und Reinigung zu erleichtern halten. </li><li> Wiederholen Sie den Vorgang SEA-Ligation auf der kontralateralen Seite. </li><li> Sobald beide SUP wurden ligiert, einen Einschnitt entlang der Mittellinie der Bauchmuskulatur zu den jeweiligen Seiten zu trennen. </li><li> Erweitern der Einschnitt seitlich in jede Richtung, wie für die Haut durchgeführt, dann weiter der Schnitt vertikal entlang der Außenkante, um die Bauchmuskeln vollständig getrennt von dem Körper. Schäden an Gefäßen von der SEA zugeführt, um den Druck aufrecht zu erhalten Lumen vermeiden. </li><li> Cut die SEA über der Ligation, um das Siegel zu erhalten, und legen Sie den isolierten Muskel und Arterie in einem 50 ml-Becherglas mit 10 ml 4 ° C Dissektion Puffer. </li><li> Vorgang für die andere Seite des Bauches und Inkubation der Gewebe in der Präparation Puffer für 10 min. </li><li> Legen Sie die Bauchmuskulatur, die die SEA in einem gekühlten (4 ° C) Präparation Kammer, die Dissektion Puffer (siehe Abbildung 3B). Die Präparation Kammer aus einer Petrischale mit einer Schicht aus Sylgard (Polydimethylsiloxan [PDMS]) an der Unterseite. </li><li> Mit Insektenstifte (0,15 mm), strecken die isoliert SEA-und Bauchmuskel aus, um in vivo Längen (siehe oben) annähernd und befestigen Sie sie am Sylgard. Tipp: Orientieren den Muskel, so dass die dünne Schicht mit Blick auf das Bauchfell ist oben macht mit Durchleuchtung der SEA gut sichtbar. </li><li> Mit Hilfe feiner Mikrodissektion Instrumente und Arbeits von der stromaufwärts Ligationsstelle in Richtung derstromabwärts gelegenen Ende, deaktivieren Sie das Meer von seiner gepaart Vene und dem umgebenden Gewebe, bis der erste große Zweigstelle (1-2 cm). Dann auszuschneiden die SEA, indem es direkt über der Zweigstelle und knapp unterhalb der Ligation. </li><li> Um Blut in das Gefäßlumen beibehalten entfernen, kanülieren das Meer und spülen Sie es mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit einem Stück Silasticschlauch, befestigen Sie das hintere Ende einer Kanülisier Pipette auf eine 5 ml Spritze mit eiskaltem Puffer Dissektion und sichern die Mikropipette in einem Mikromanipulator zu ihrer Spitze innerhalb der Dissektion Kammer zu positionieren, um die SEA kanülieren. </li><li> Sobald alle Erythrozyten werden ausgespült, entfernen Sie das Meer von der Kanülierung Pipette, und heben Sie die Pipette aus der Dissektion Gericht. </li><li> Schneiden Sie die SEA in kleinere Segmente jeweils 1-3 mm in der Länge. Diese kürzere Segmente ermöglichen die Isolierung von Endothelzellen Röhren. </li></ol> 4. Isolierung des Endothelrohr <ol><li> Füllen Sie eine 12 mm x 75 mm Glas KultAbbildung Rohr halb mit eiskaltem Dissektion Puffer. Mit abgewinkelten Pinzette, übertragen Sie die Arterienstücke in die Kulturröhrchen und legen auf Eis. Zu diesem Zeitpunkt verbinden die Verdauungsenzyme mit Dissoziationspuffers auf ein Endvolumen von 1 ml in einem separaten 12 mm x 75 mm Kulturröhrchen (siehe 1.3.2 Solutions) vorzuwärmen und die Lösung auf 37 ° C mit einem Heizblock. </li><li> Während die Dissoziation Puffer und Enzyme werden aufgewärmt, sorgfältig absaugen Dissektion Puffer aus dem Kulturröhrchen so dass eine kleine Band mit den Gefäßsegmente. </li><li> Hinzufügen vorsichtig Raumtemperatur Dissoziationspuffer ohne Enzyme abzuwaschen restlichen Dissektion Puffer. Tipp: Fügen Sie die Dissoziation Puffer langsam, so dass die Arterienstücke bleiben auf dem Boden der Kulturrohr um Zeit zu sparen warten, bis sie umzusiedeln. Heben die Puffer Temperaturen über mehrere Schritte von Eis (4 ° C), auf Raumtemperatur (~ 24 ° C), auf 37 ° C bis Schock zu minimieren. </li><li> Die dissoc vorsichtig absaugenausstrahle Puffer aus dem Kulturröhrchen, wieder sicher zu sein, eine kleine Band mit den Gefäßsegmente zu verlassen. </li><li> Entfernen Sie die Vorwärmung Dissoziationspuffer mit Enzymen aus dem Heizblock, übertragen Sie die 1 ml Enzymlösung zu dem Kulturröhrchen, das die Gefäßsegmente und legen Sie die Kulturröhrchen wieder in den Thermoblock. Inkubieren bei 37 ° C für 30 min. </li><li> Während der Inkubation mit Enzymen, bereiten Sie das Verreiben Pipette verfüllen es mit Mineralöl und sichern Sie sie auf einer Mikro, die in einem Mikromanipulator montiert ist. Dann Einfahren der Kolben, um die Mikropipette mit 2 nl der Dissoziation Puffer zu füllen und die Position der Pipettenspitze über die Flusskammer. </li><li> Am Ende der 30 min Inkubation entfernen Kulturröhrchen aus dem Heizblock und sorgfältig absaugen Puffer wie oben. </li><li> Mit 4 ml Raumtemperatur Dissoziationspuffers waschen Arteriensegmente. Anmerkung: Es ist nicht mehr notwendig, den Behälter zu halten segmenten am Boden des Kulturröhrchen, Störung der arteriellen Stücke tatsächlich dazu beiträgt, sicherzustellen, daß restliche Enzyme wirksam entfernt werden. </li><li> Übertragung eines Gefäßsegments zu der Strömungskammer durch vorsichtiges Ansaugen mit einer 1 ml-Mikropipette, und sie in der Durchflusskammer mit 1 ml der Spaltpuffer. </li><li> Mit Hilfe der Mikromanipulator, der die Mikro, positionieren Sie die Spitze der Pipette in der Nähe von Verreiben ein Ende des Gefäßsegments. </li><li> Saugen Sie den Gefäßsegment (500 nl zurückgezogen) in das Verreiben Pipette langsam (225 nl / s), um nicht zu mechanischen Belastungen an den ECs verursachen, und werfen Sie sie in die Kammer zurück. Wenn die Verdauung erfolgreich war, werden die Zellen der glatten Muskulatur und Adventitia von der endothelialen Rohr getrennt werden. </li><li> Wiederholen Sie das Verreiben, bis alle Zellen der glatten Muskulatur dissoziiert. Seien Sie sich bewusst, dass die übermäßige Verreiben (4x oder mehr) können die ECs beschädigen und sie reagieren nicht auf Agonisten. Tipp:Verreiben mit der Pipette, bewegen Sie die Adventitia von der endothelialen Röhre so schnell wie möglich, um es von verwickelten den Schlauch halten. Anmerkung: Mit dem Verreiben Pipette kann das isolierte Endothelzellen Rohr angesaugt und in eine separate Kammer überführt werden. </li><li> Positionieren Sie den Endothelzellen Rohr in der Mitte des Flusskammer, entlang der Strömungsrichtung ausgerichtet ist, und entfernen Sie das Verreiben Pipette. </li><li> Sichere Pinning Pipetten Mikromanipulatoren an jedem Ende der Durchflusskammer angeordnet ist, und die Position ihrer Spitze an den jeweiligen Enden der endothelialen Rohr. </li><li> Absenken eines Pinning Pipette über ein Ende des Rohrs, um es gegen die Unterseite der Kammer zu drücken. Positionieren der zweiten Pinning-Pipette in gleicher Weise an dem gegenüberliegenden Ende des Rohres. Hinweis: Die Platzierung der Pipetten Pinning ist ein Trade-off zwischen dem Befestigungsrohr (indem sie weiter von dem Ende des Rohrs) und sorgt für mehr Imaging / Versuchsfläche (indem sie näher an dem Ende des Rohrs). Auffinden tSaum ~ 50 &amp;mgr; m von jedem Ende des Rohrs funktioniert gut. So wie der Pinning-Pipette das Rohr berührt, langsam zurückzuziehen entlang der Achse des Rohres, wodurch Ausdehnung auf in vivo Länge nähern; drücken Sie dann die Pipette gegen den Kammerboden, um das Rohr zu sichern. </li><li> Beginnen Sie den Fluss der Superfusionslösung und damit der endothelialen Rohr, für mindestens 20 Minuten ruhen und ins Gleichgewicht zu halten (siehe Abbildung 3C). Nutzen Sie eine peristaltische Pumpe, um konstante Fluidstrom (Superfusion) durch die endotheliale Rohr zu halten. Hinweis: Pinning Pipetten entfernt werden kann, sobald der endothelialen Rohr auf den Boden der Strömungskammer (~ 25 min) verklebt oder an Ort und Stelle gelassen, um sicherzustellen, dass die endotheliale Rohr nicht wegrutschen. </li></ol> 5. Farbstoffbeladung und Calcium Imaging <ol><li> Um intrazellulären Calcium-Antworten zu visualisieren, laden Sie die endotheliale Rohr mit Fluo-04.00 Farbstoff bei Raumtemperatur (~ 24 ° C). Stopp-Fluidströmung in der Wanne, und fügen Fluo-4Uhr mit der Kammer mit einer Endkonzentration von 10 uM. Warten Sie 10 Minuten, damit der Farbstoff in die Zellen eindringen, dann superfuse die endotheliale Rohr mit frischen PSS für 20 Minuten, um sicherzustellen, extrazellulären Farbstoff entfernt wird und dass die intrazelluläre Farbstoff vollständig entes worden. </li><li> Führen Kalzium-Imaging. Für diese Arbeit eine aufrechte Mikroskop (siehe Fig. 2) mit einer drehenden Scheibe konfokalen Abbildungssystem ausgestattet war, bei Raumtemperatur verwendet. Excite das fluoreszierende Kalzium-Farbstoff mit einem 491-nm-Laser und Bilder zu erwerben (bei 500-550 nm Emission) unter Verwendung einer Digitalkamera intensiviert. </li></ol>

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+channels+and+membrane+potential+in+the+modulation+of+intracellular+calcium+in+vascular+endothelial+cells.">Potassium channels and membrane potential in the modulation of intracellular calcium in vascular endothelial cells.</a> J. Cardiovasc. Electrophysiol. 15, 598-610 (2004).</li><li>Jackson, W. F., Huebner, J. M., Rusch, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+isolation+and+characterization+of+single+vascular+smooth+muscle+cells+from+cremasteric+arterioles.">Enzymatic isolation and characterization of single vascular smooth muscle cells from cremasteric arterioles.</a> Microcirculation. 4, 35-50 (1997).</li></ol>

Hier beschreiben wir die Isolierung von Endothel-Röhrchen aus dem Meer und die Verwendung dieser Zubereitung zu visualisieren Ca 2 + Signalereignisse innerhalb seiner konstituierenden ECs. Dieses Verfahren wurde von einem ursprünglich entwickelt, um Rohre von endothelialen Arteriolen der Hamstercremaster-Muskel zu isolieren 8 angepasst. Feed Arterien des Hamsters Aufroller Muskel-und Backentasche Arteriolen 10, Maus A. epigastrica superior 6,7,9, Maus mesenterialen und zerebralen: Verwendung geringfügige Variationen der Techniken, die hier vorgestellten, haben wir endothelialen Rohre aus einer Vielzahl von Gefäßbetten, einschließlich getrennt Arterien und lymphatischen Mikrogefäßen (unveröffentlichte Beobachtungen; Referenzen werden zur Isolierung Mesenterialgefäße 12 und Hirngefäße 13 enthalten). Isolieren von endothelialen Rohre von neuen Gefäßbetten kann Veränderungen an der ursprünglichen Protokoll. Wenn Trennung nicht erfolgreich ist, ist es am besten, durch Änderung Aufschlusszeiten beginnen:Erhöhen Sie die Zeit, wenn die Verdauung endothelialen Röhren sind schwer von glatten Muskelzellen und Adventitia isolieren und reduzieren Verdauungszeit, wenn die Endothelzellen Rohr nicht intakt bleiben. Wenn eine Änderung der Verdauung mal nicht erfolgreich ist, die Konzentration der Verdauung Enzyme oder die Verdauung Temperatur sollte versucht werden. Eine weitere Option ist es, den Innendurchmesser der Pipette Verreiben, die Scherkraft bei der Beseitigung von Zellen der glatten Muskulatur erhöht reduzieren. Erhöhung der Geschwindigkeit der Fluidausstoß können auch für den gleichen Effekt versucht werden, ist aber eher die Herstellung beschädigen. Es sollte erkannt werden, dass es nicht möglich sein, intakten Endothelzellen Rohre von Gefäßen, in denen Endothelzellen nicht gut miteinander durch Junction-Proteinen verbunden isolieren. Die Dissoziation von glatten Muskelzellen folgende enzymatische Verdauung wurde zunächst unter Verwendung eines Hand-style-Pipette 8. Wir haben das Verfahren verfeinert Verreiben mit einem microsyringe System, das konsequent Isolierung von Endothelzellen mehr Rohre (bis zu 3 mm) 6 ermöglicht hat. Bei Verwendung dieses Systems wird die Pipette Verreiben mit Mineralöl aufgefüllt, um eine kontinuierliche Flüssigkeitssäule zwischen dem Kolben Steuern der Fluidbewegung und PSS-Segment enthält, das Gefäß zu liefern. Die Inkompressibilität des Fluids zusammen mit dem konstanten Antriebskraft der Mikrokolben Ergebnisse in konstanten Scher wie der Behälter wird durch die Pipettenspitze gedrückt. Demgegenüber Handtechniken oft zum Dissoziieren von Zellen (z. B. Quetschen Gummidichtung am Ende einer Pasteur-Pipette) beinhaltet die Kompression der Luft, die Variabilität in der Antriebsdruck führt und dadurch an der Pipettenspitze ausgeübte Scher. Es gibt mehrere Vorteile für die Rohrvorbereitung für das Studium endotheliale Funktion in Mikrogefäßen. Die erste ist, dass die Isolationsprozess bietet verschiedene homogene nativen Zellpopulationen von ECs und glatt muscle Zellen. Da die ECs bleiben physisch als Rohre verbunden, sind sie sich von einzelnen Zellen der glatten Muskulatur, die ein &quot;C&quot;-Konfiguration beibehalten, wenn sie während Verreiben entspannt bleiben. Somit jeweiligen Zelltypen leicht unterscheiden, z. B. bei Erhalt einer Probe zur molekularen Techniken, wie Echtzeit-PCR und Immunhistochemie 10. Da mehrere Rohre aus einem einzelnen Behälter (oder von bilateralen Gefäße für das SEA gemacht) isoliert, können molekulare Daten und Funktionsdaten aus den gleichen Gefäßen von einem bestimmten Tier erhalten werden. So Molekular Ausdruck kann mit der Funktionsverhalten von mikrovaskulären Endothelzellen korreliert werden. Weiterhin können sowohl intra-und interzellulären Signalereignisse intrinsische mikrovaskulären Endothel unabhängig vom Einfluss der hämodynamischen Kräfte (Druck, Durchfluss), vasoaktiven Substanzen in die Blutbahn (zB Hormone) durchgeführt aufgelöst werden kann, oder aus den umliegenden Zellen der glatten Muskulatur (z. B.60; über myoendothelial Kupplung 14-16), Nerven 17, 18 oder Gewebe Parenchym. Wichtig ist, da das Endothel von frisch isolierten Mikrogefäßen bezeichnet, gibt es keine Veränderung des Phänotyps, die sonst mit Kultivierungs ECs 19-21 zugeordnet ist. Zum Beispiel, kultivierte ECs verlieren Muscarin-Rezeptor-Expression und dadurch ihre Calcium-Signal-Profile zu ändern. Weiterhin können elektrophysiologischen Eigenschaften von ECs in Kultur 22 ändern. Da in den einzelnen ECs bleiben durch funktionelle Gap Junction Kanälen verbunden ist, stellt die endotheliale Rohr ein ideales Modell für die Untersuchung die Leitung der elektrischen und Ca 2 +-Signale zwischen den Zellen 6,7. Es sollte auch erkannt, dass die dissoziiert glatten Muskelzellen sind leicht mit Patch-Clamp-Techniken für komplementäre Datenmikrovaskulären Funktion 23 zugrunde liegenden sucht werden. Ein Schlüssel Beschränkung auf die endotheliale Rohr modell ist die Instabilität der Herstellung mit zunehmender Temperatur. Während die Vorbereitungen von der SEA haben bei Raumtemperatur (~ 24 ° C) und für mehrere Stunden bei 32 ° C stabil und gesund erwiesen, treten morphologische und funktionelle Abbau in weniger als einer Stunde bei 37 ° C 9. Eine zweite wichtige Einschränkung der endothelialen Rohr ist der Verlust der myoendothelial Kreuzungen und ihre inhärente Signaldomänen, die integral mit EC-Funktion in intakten Gefäßwand 14-16 sind. Es sollte auch erkannt werden, dass, während längere Rohre ermöglichen interzellularen Signalisierung über relativ große Entfernungen 6 Herstellung von Rohren ist kompliziert zu untersuchen, da sie länger werden, weil es schwieriger wird, vollständig dissoziieren umgebenden glatten Muskelzellen und Adventitia. Wir haben festgestellt, dass Rohre länger als 1-2 mm sind auch schwieriger zu positionieren und zu sichern in der Strömungskammer. Im Gegensatz dazu, während kürzere Rohre (z. B. &lt;1 mm) ENABLE Ca 2 + und elektrische Signale zu unter 8 sind, sind sie schwierig während der Superfusion in der Strömungskammer aufrechtzuerhalten. Schließlich, auch mit optimaler Isolierung von Rohren bilateral, gibt es genügend Material für die traditionellen Quantifizierung der Proteinexpression mittels Western Blots, obwohl Immunomarkierung liefert einen Index von Protein-Expression und Lokalisation. Trotz dieser Einschränkungen stellt die endotheliale Rohr eine neue Vorbereitung für die Bereitstellung neuer Einblick in die Mechanismen der mikrovaskulären Endothelzellen Funktion in vivo.

In diesem Protokoll beschreiben wir die Isolierung von Endothelzellen Rohre von der Maus SEA. Die SEA ergibt sich aus der Brustwandarterie und liefert sauerstoffreiches Blut in der vorderen Bauchmuskulatur. Unsere Zusammenarbeit mit der SEA als Modell ist auf die Bereitstellung es relativ lange, unverzweigte Mikrogefäßsegmente, die für das Studium interzellulären Signalwege, die Rolle des Endothels bei der Steuerung und Koordination der Muskelzelle Entspannung der glatten zugrunde liegenden gut geeignet sind. Für diejenigen, die an anderen als Skelettmuskel Gewebe haben wir diese Technik, um ohne weiteres für den Erhalt von endothelialen Rohre von Mikrogefäße von Gehirn-, Darm und das lymphatische System angepasst werden gefunden. Die wesentlichen Merkmale dieser Methode sind, dass intakte Längen (1-3 mm) der mikrovaskulären Endothel isoliert, vor einem Deckglas in einer Durchflusskammer, in der sie mit PSS strömt gesichert, und für die Ca 2 + Signal abgebildet 7-9 oderfür die elektrische Anzeige 6,8 aufgespießt. Innerhalb der Durchflusskammer, ist die obere Hälfte eines Rohres zum Superfusionslösung ausgesetzt und reagiert auf experimentelle Eingriffe, während die untere Hälfte (in Kontakt mit dem Deckglas) wird geschützt und bleibt ruhig. Neben dem Studium sowohl intra-und interzellulären Ca 2 + Signal Veranstaltungen können Endothelzellen Rohre für die quantitative Echtzeit-PCR verwendet werden, um die Genexpression 6,10, Immunhistochemie bewerten, um die Proteinexpression 6,10 untersuchen und elektrophysiologische Untersuchungen zur biophysikalischen Eigenschaften definieren der elektrische Leitungs 6,11. Es gibt mehrere Vorteile für die endotheliale Rohrvorbereitung für das Studium der endothelialen Funktion. Zunächst erhält der Isolationsprozess bietet eine einfache Unterscheidung zwischen zwei Zellpopulationen: Endothelzellen (die Röhrenbildung bleiben) und glatten Muskelzellen (einzeln dissoziiert; normalerweise &quot;C&quot;-förmig ist, wennentspannt). Dies ermöglicht eine gezielte Probenahme und Untersuchung der einzigartigen Eigenschaften Beitrag jeweiligen Zellen auf Gefäßfunktion zugrunde liegen. Zweitens, dieses Modell ermöglicht die Auflösung der Signalereignisse Eigen an das Endothel, unabhängig vom Einfluss des Blutflusses, die umliegenden glatten Muskulatur, Nerven und Parenchym. Drittens wird das Endothel untersucht, während frisch isolierten, wodurch jedoch Veränderungen in der Gen-oder Protein-Expression mit der Zellkultur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="632">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">S642-212</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Potassium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P9541</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">M2643</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Calcium Chloride</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C1016</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sodium Nitroprusside</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">431451</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:159px;">USB Products</td>
			<td style="width:159px;">9048-46-8</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Papain</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">P-4762</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Collagenase</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">C-8051</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dithioerythritol</td>
			<td style="width:159px;">Sigma</td>
			<td style="width:159px;">D-8255</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Cannulation and Pinning Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">G150-4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Boroscilicate Glass (Trituration Pipettes)</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">4897</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">Nanoliter Injector Microsyringe</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">B203MC4</td>
			<td style="width:159px;">Updated to Nanoliter 2010 from Nanoliter 2000</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Micro4 Controller</td>
			<td style="width:159px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;">SYS-MICRO4</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">12 mm x 75 mm Culture Tubes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">14-961-26</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">3-Axis Micromanipulator</td>
			<td style="width:159px;">Siskiyou Corp</td>
			<td style="width:159px;">DT3-100</td>
			<td style="width:159px;">Holding and positioning the pinning pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Flow Chamber</td>
			<td style="width:159px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:159px;">RC-27N</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">100-1,000 &#181;l Pipette</td>
			<td style="width:159px;">Eppendorf</td>
			<td>3120000062</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:159px;">1 ml Pipette Tips</td>
			<td style="width:159px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;">02-707-405</td>
			<td style="width:159px;">For transferring digested vessel segment to the flow chamber</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Upright Microscope</td>
			<td style="width:159px;">Olympus</td>
			<td style="width:159px;">BX51W1</td>
			<td style="width:159px;">The actual microscope is up to the user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Spinning Disc Confocal System</td>
			<td style="width:159px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:159px;">CSU-X1</td>
			<td style="width:159px;">Confocal imaging is optional</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">XR/TURBO EX Camera</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;">XR/TURBO EX</td>
			<td style="width:159px;">Ideal for our needs; may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Piper Control Software</td>
			<td style="width:159px;">Stanford Photonics</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:159px;">Imaging software for TURBO EX camera</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Stereo Microscrope</td>
			<td style="width:159px;">Leica</td>
			<td style="width:159px;">MZ8</td>
			<td style="width:159px;">may vary with user</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Sylgard</td>
			<td style="width:159px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:159px;">184</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Microdissection Scissors</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">15003-08</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Dumont Forceps</td>
			<td style="width:159px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:159px;">#5/45</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:159px;">Minutiens Insect Pins</td>
			<td style="width:159px;">Austerlitz</td>
			<td style="width:159px;">M size 0.15 mm</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">GP Millipore Express PLUS Membrane</td>
			<td style="width:159px;">Millipore</td>
			<td style="width:159px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Pipette Scoring Device</td>
			<td style="width:159px;">Austin Flameworks</td>
			<td style="width:159px;">Small Handheld Scoring Tool</td>
			<td style="width:159px;">austinflameworks.com</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:159px;">Compact Pet Trimmer</td>
			<td style="width:159px;">Wahl Clipper Corp.</td>
			<td style="width:159px;">Model 9966</td>
			<td style="width:159px;">Clean well after each use to maintain life</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of microvascular endothelial tubes from mouse resistance arteries

Die Steuerung des Blutflusses durch den Widerstand Gefäß regelt die Zufuhr von Sauerstoff und Nährstoffen, gleichzeitig mit der Entfernung von Stoffwechselprodukten, wie durch die Ausübung Skelettmuskel veranschaulicht. Endothelzellen (ECs) säumen die Intima aller Widerstandsgefäße dienen und eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Durchmesser (zB Endothel-abhängige Vasodilatation) und damit die Größe und Verteilung der Gewebedurchblutung. Die Regulierung der Gefäßwiderstand durch ECs wird durch intrazelluläre Ca 2 +-Signalisierung, die die Produktion von diffusionsfähigen Autacoide (z. B. Stickstoffmonoxid und Arachidonsäure-Metaboliten) führt 1-3 und Hyperpolarisation bewirkt 4,5, die Entspannung der glatten Muskelzellen zu entlocken. So das Verständnis der Dynamik der endothelialen Ca 2 +-Signal ist ein wichtiger Schritt zum Verständnis Mechanismen, die Blutflusskontrolle. Isolieren von endothelialen Rohre beseitigt Störvariablen mit bl verbundenenOOD im Gefäßlumen und mit umgebenden glatten Muskelzellen und perivaskuläre Nerven, die sonst EG Struktur und Funktion zu beeinflussen. Hier präsentieren wir die Isolierung von Endothel-Rohre von der A. epigastrica superior (SEA) mit einem Protokoll für dieses Schiff optimiert. Um endothelialen Rohre von einer narkotisierten Maus zu isolieren, wird die SEA in situ ligiert, um Blut in das Gefäßlumen zu halten (zur Erleichterung bei der Präparation visualisieren), und das gesamte Blatt Bauchmuskel wird ausgeschnitten. Das Meer ist frei von umgebenden Skelettmuskulatur und Bindegewebe seziert, wird Blut aus dem Lumen gespült und milde enzymatische Verdauung wird durchgeführt, um die Entfernung der Adventitia, Nerven und Zellen der glatten Muskulatur mit sanften Verreiben zu ermöglichen. Diese frisch isoliert Vorbereitungen von intakten Endothel behalten ihre Mutter Morphologie, mit individuellen ECs bleibt funktionell miteinander gekoppelt sind, in der Lage, chemische und elektrische si übertragengnale interzellulär durch gap junctions 6,7. Neben der Bereitstellung von neuen Einblick in Calcium-Signal-und Membranbiophysik, diese Präparate ermöglichen molekulare Untersuchungen der Genexpression und Proteinlokalisierung in nativen mikrovaskulären Endothel.

Calcium Antworten können in frisch isolierten Endothelzellen Rohre mit Acetylcholin (ACh) eingeleitet werden. In diesem Film wird eine endotheliale Rohr mit 10 uM Fluo-04.00 beladen mit Superfusion von 1 uM ACh (Movie 1) stimuliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/SochaandSegal_movie1.avi" target="_blank">Klicken Sie hier, um Film anzusehen</a> . Der Farbstoff wird bei 491 nm angeregt und Emission von 500 bis 550 nm unter Verwendung eines verstärkten ladungsgekoppelte Vorrichtung Kamera aufgezeichnet. Bild Stapel werden mit 120 Bildern / s für eine 25 Sekunden Zeitraum erfasst und können dann gemittelt werden (zB zu 40 Bilder / s). Repräsentative Fluoreszenzbilder im Laufe der Zeit sind in Abbildung 4 dargestellt. <img alt="Figur 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig1.jpg" width="500px" /> Fig. 1 ist. Flusskammer und Pipetten bei der Isolierung von Endothel-Rohre verwendet. </strong&gt; A) Die Flusskammer mit einer 24 mm x 50 mm Deckglas als Basis. B montiert) Beispiele für eine gezogen (links) und einer gezogen, gebrochen, polierte und abgewinkelte (rechts) Kanülierung Pipette. Diese Pipette wird verwendet, um Erythrozyten aus dem Lumen der Arterie zu spülen folgenden Dissektion. Maßstabsbalken = 200 um. C) Beispiele für eine gezogen (links) und einer zog, gebrochen und poliert (rechts) Verreiben Pipette. Der Innendurchmesser dieser Pipette wird der Außendurchmesser der Arterie bestimmt. Maßstabsbalken = 200 um. D) Beispiele für eine gezogen (links) und einer zog, gebrochen und poliert (rechts) Pinning Pipette. Die Spitze dieses Pipette wird abgerundet und vollständig abgedichtet, um die Endothel-Röhre in der Strömungskammer zu sichern. Maßstabsbalken = 200 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig2.jpg" width="500px" /> 2. Spinning Disc-Konfokalmikroskop für die Bildgebung von Ca 2 +-Signale. A) Upright-Mikroskop für Calcium-Bildgebung verwendet. B) (a) Die konfokale Spinning Disc-Einheit mit einem (b) intensiviert charge coupled device Kamera. C) Immersionsobjektive (a) 63X ( NA = 1) und (b) 20x (NA = 0,5) für die Bildgebung verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig2highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50759/50759fig3.jpg" width="500px" /> 3. Isolation der Bauchmuskulatur und A. epigastrica superior. A </strong&gt;) anästhesiert Maus mit Bauchmuskel freigelegt und mit Raumtemperatur 0,9% Kochsalzlösung gespült. Rote Pfeile markieren die Standorte unter Fettpolster, an dem jeweiligen SUP geben Sie jeden geraden Bauchmuskel (also dort, wo Schiffe sollten ligiert werden). Maßstabsbalken = 1 cm. B) Isolierte Bauchmuskel (unilateral) und SEA in einer Dissektion Kammer für die Mikrodissektion merken. Rote Pfeil zeigt die erste große Verzweigungsstelle der SEA (dh der Punkt, an dem die Reinigung der Behälter wird gestoppt). Maßstabsbalken = 1 cm. C) Isolierte Endothelzellen Rohr von einer SUP. Differential-Interferenz-Kontrast-Bild eines Endothelrohr folgenden 1 h Inkubation bei Raumtemperatur. Die Endothelzellen Rohr wurde mit Superfusion-Puffer bei 3 ml / min überspült. Maßstabsbalken = 50 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig3highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . 4. Calcium-Fluoreszenz in einer Endothelzelle Rohr. Repräsentative Fluoreszenzbildern eines endothelialer Gefäße in Reaktion auf die Stimulierung mit 1 uM Acetylcholin. A) Fluoreszenz vor der Stimulation. B) Endothelrohr Fluoreszenz bei der Verabreichung von Acetylcholin, t = 0 sek. C) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 5 Sekunden. D) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 10 Sekunden. E) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 15 Sekunden. F) Endothelrohr Fluoreszenz bei t = 20 Sekunden. Maßstabsbalken = 40 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50759/50759fig4highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Wir präsentieren eine Vorbereitung für die Visualisierung und Manipulation von Calcium-Signal in nativer, intakte mikrovaskulären Endothel. Endothelial Rohre frisch aus Maus Widerstand Arterien Skelettmuskel in vivo behalten Morphologie und dynamische Signalisierung innerhalb und zwischen benachbarten Zellen isoliert. Endothelzellen Rohre können aus Mikrogefäßen anderer Gewebe und Organe hergestellt werden.

Microvascular Endothelial Isolierung von Rohren aus Maus Widerstand Arterien

The control of blood flow by the resistance vasculature regulates the supply of oxygen and nutrients concomitant with the removal of metabolic ...

isolation-microvascular-endothelial-tubes-from-mouse-resistance

Research

JoVE Journal

Biology

15.6K Aufrufe.  University of Missouri.  Wir präsentieren eine Vorbereitung für die Visualisierung und Manipulation von Calcium-Signal in nativer, intakte mikrovaskulären Endothel. Endothelial Rohre frisch aus Maus Widerstand Arterien Skelettmuskel in vivo behalten Morphologie und dynamische Signalisierung innerhalb und zwischen benachbarten Zellen isoliert. Endothelzellen Rohre können aus Mikrogefäßen anderer Gewebe und Organe hergestellt werden. 

Serie: Isolation of Microvascular Endothelial Tubes from Mouse Resistance Arteries

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Forschung

Biologie

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular physiology. Dysfunctional eNOS such as uncoupling of eNOS leads to decrease in NO bioavailability and increase in superoxide anion (O2.&#8722;) production, and in turn promotes cardiovascular diseases. Therefore, appropriate measurement of NO and O2.&#8722; levels in the endothelial cells are pivotal for research on cardiovascular diseases and complications. Because of the extremely labile nature of NO and O2.&#8722;, it is difficult to measure NO and O2.&#8722; directly in a blood vessel. Numerous methods have been developed to measure NO and O2.&#8722; production. It is, however, either insensitive, or non-specific, or technically demanding and requires special equipment. Here we describe an adaption of the fluorescence dye method for en face simultaneous detection and visualization of intracellular NO and O2.&#8722; using the cell permeable diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE), respectively, in intact aortas of an obesity mouse model induced by high-fat-diet feeding. We could demonstrate decreased intracellular NO and enhanced O2.&#8722; levels in the freshly isolated intact aortas of obesity mouse as compared to the control lean mouse. We demonstrate that this method is an easy technique for direct detection and visualization of NO and O2.&#8722; in the intact blood vessels and can be widely applied for investigation of endothelial (dys)function under (physio)pathological conditions.

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

In this article we describe an adapted relatively easy method using the fluorescence dye diaminofluorescein-2 diacetate (DAF-2DA) and dihydroethidium (DHE) for en face simultaneous detection and visualization of intracellular nitric oxide (NO) and superoxide anion (O2.&#8722;) respectively, in freshly isolated intact aortas of an obesity mouse model.

En Gesichtserkennung von Stickstoffmonoxid und Superoxid in Endothelschicht Intact Arterien

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation and Culture of Primary Aortic Endothelial Cells from Miniature Pigs

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a suitable organ source. Immune rejection and coagulation are two major hurdles for the success of xenotransplantation. Vascular endothelial cell (EC) injury and dysfunction are important for the development of the inflammation and coagulation responses in xenotransplantation. Thus, isolation of porcine aortic endothelial cells (pAECs) is necessary for investigating the immune rejection and coagulation responses. Here, we have developed a simple enzymatic approach for the isolation, characterization, and expansion of highly purified pAECs from miniature pigs. First, the miniature pig was anaesthetized with ketamine, and a length of aorta was excised. Second, the endothelial surface of aorta was exposed to 0.005% collagenase IV digestive solution for 15 min. Third, the endothelial surface of the aorta was scraped in only one direction with a cell scraper (&#60;10 times), and was not compressed during the process of scraping. Finally, the isolated pAECs of Day 3, and after passage 1 and passage 2, were identified by flow cytometry with an anti-CD31 antibody. The percentages of CD31-positive cells were 97.4% &#177; 1.2%, 94.4% &#177; 1.1%, and 92.4% &#177; 1.7% (mean &#177; SD), respectively. The concentration of Collagenase IV, the digestive time, the direction, and frequency and intensity of scraping are critical for decreasing fibroblast contamination and obtaining high-purity and a large number of ECs. In conclusion, our enzymatic method is a highly-effctive method for isolating ECs from the miniature pig aorta, and the cells can be expanded in vitro to investigate the immune and coagulation responses in xenotransplantation.

An effective enzymatic method for isolation of primary porcine aortic endothelial cells (pAECs) from miniature pigs is described. The isolated primary pAECs can be used to investigate the immune and coagulation response in xenotransplantation.

Isolation und Kultur der primären Aorten-Endothelzellen von Miniaturschweinen

Xenotransplantation is a promising way to resolve the shortage of human organs for patients with end-stage organ failure, and the pig is considered as a ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolation of Endothelial Cells from the Lumen of Mouse Carotid Arteries for Single-Cell Multi-Omics Experiments

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in the endothelium at the transcriptomic and epigenomic levels, resulting in proatherogenic responses. Recently, single-cell RNA sequencing (scRNAseq) and single-cell Assay for Transposase Accessible Chromatin sequencing (scATACseq) studies were performed to determine the transcriptomic and chromatin accessibility changes at a single-cell resolution using the mouse partial carotid ligation (PCL) model. As endothelial cells (ECs) represent a minor fraction of the total cell populations in the artery wall, a luminal digestion method was used to obtain EC-enriched single-cell preparations. For this study, mice were subjected to PCL surgery to induce d-flow in the left carotid artery (LCA) while using the right carotid artery (RCA) as a control. The carotid arteries were dissected out two days or two weeks post PCL surgery. The lumen of each carotid was subjected to collagenase digestion, and endothelial-enriched single cells or single nuclei were obtained. These single-cell and single-nuclei preparations were subsequently barcoded using a 10x Genomics microfluidic setup. The barcoded single-cells and single-nuclei were then utilized for RNA preparation, library generation, and sequencing on a high-throughput DNA sequencer. Post bioinformatics processing, the scRNAseq and scATACseq datasets identified various cell types from the luminal digestion, primarily consisting of ECs. Smooth muscle cells, fibroblasts, and immune cells were also present. This EC-enrichment method aided in understanding the effect of blood flow on the endothelium, which could have been difficult with the total artery digestion method. The EC-enriched single-cell preparation method can be used to perform single-cell omics studies in EC-knockouts and transgenic mice where the effect of blood flow on these genes has not been studied. Importantly, this technique can be adapted to isolate EC-enriched single cells from human artery explants to perform similar mechanistic studies.

We present a method for isolating endothelial cells and nuclei from the lumen of mouse carotid arteries exposed to stable or disturbed flow conditions to perform single-cell omics experiments.

Isolierung von Endothelzellen aus dem Lumen von Maus-Halsschlagadern für Einzelzell-Multi-Omics-Experimente

Atherosclerosis is an inflammatory disease of the arterial regions exposed to disturbed blood flow (d-flow). D-flow regulates the expression of genes in ...

Isolation of Conditionally Immortalized Mouse Glomerular Endothelial Cells with Fluorescent Mitochondria

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative stress has been suggested as a mechanism resulting in GEC dysfunction in the pathogenesis of some glomerular diseases. Historically the isolation of GECs from in vivo models has been notoriously challenging due to difficulties in isolating pure cultures from glomeruli. GECs have complex growth requirements in vitro and a very limited lifespan. Here, we describe the procedure for isolating and culturing conditionally immortalized GECs with fluorescent mitochondria, enabling the tracking of mitochondrial fission and fusion events. GECs were isolated from the kidneys of a double transgenic mouse expressing the thermolabile SV40 TAg (from the Immortomouse), conditionally promoting proliferation and suppressing cell differentiation, and a photo-convertible fluorescent protein (Dendra2) in all mitochondria (from the photo-activatable mitochondria [PhAMexcised] mouse). The stable cell line generated allows for cell differentiation after inactivation of the immortalizing SV40 TAg gene and photo-activation of a subset of mitochondria causing a switch in fluorescence from green to red. The use of mitoDendra2-GECs allows for live imaging of fluorescent mitochondria&#39;s distribution, fusion, and fission events without staining the cells.

The article describes the method for isolating conditionally immortalized glomerular endothelial cells from the kidneys of transgenic mice expressing the thermolabile simian virus 40 and photo-activatable mitochondria, PhAMexcised. We describe the procedure for glomeruli isolation from whole kidneys using beads, digestion steps, seeding, and culturing of GECs-CD31 positive.

Isolierung von bedingt immortalisierten glomerulären Maus-Endothelzellen mit fluoreszierenden Mitochondrien

Glomerular endothelial cell (GEC) dysfunction can initiate and contribute to glomerular filtration barrier breakdown. Increased mitochondrial oxidative ...

Microvascular and Macrovascular Endothelial Cell Isolation and Purification from Lung-Derived Samples

The availability of cells isolated from healthy and diseased tissues and organs represents a key element for personalized medicine approaches. Although biobanks can provide a wide collection of primary and immortalized cells for biomedical research, these do not cover all experimental needs, particularly those related to specific diseases or genotypes. Vascular endothelial cells (ECs) are key components of the immune inflammatory reaction and, thus, play a central role in the pathogenesis of a variety of disorders. Notably, ECs from different sites display different biochemical and functional properties, making the availability of specific EC types (i.e., macrovascular, microvascular, arterial, and venous) essential for designing reliable experiments. Here, simple procedures to obtain high-yield, virtually pure human macrovascular and microvascular endothelial cells from the pulmonary artery and lung parenchyma are illustrated in detail. This methodology can be easily reproduced at a relatively low cost by any laboratory to achieve independence from commercial sources and obtain EC phenotypes/genotypes that are not yet available.

Although challenging, the isolation of pulmonary endothelial cells is essential for studies on lung inflammation. The present protocol describes a procedure for the high-yield, high-purity isolation of macrovascular and microvascular endothelial cells.

Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben

The availability of cells isolated from healthy and diseased tissues and organs represents a key element for personalized medicine approaches. Although ...