Diese Arbeit wurde teilweise durch NIH K99EB009096-01A1 an JM-M unterstützt.

1. Vorbereitung <ol><li> Machen EGM-2 Medium (500 mL) <ul><li> Add 100 ml fötales Rinderserum (FBS) auf 395 ml Endothelial Basal Medium (EBM-2). </li><li> 5 ml 100x Glutamin-Penicillin-Streptomycin-Lösung (GPS). </li><li> Fügen Sie alle EGM-2 SingleQuots Ergänzungen außer Hydrocortison (dh, VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, Heparin, Ascorbinsäure, und GA-1000). </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Machen MSCGM Medium (500 mL) <ul><li> 5 ml 100x GPS bis 440 ml mesenchymalen Stammzellen Basal Medium (MSCBM). </li><li> Fügen Sie alle Inhalte der MSCGM SingleQuots Kit. </li><li> Add hFGF-B Aliquot von EGM-2 SingleQuots ergänzt. </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Machen DMEM-Medium (500 mL) <ul><li> 50 ml fötales Rinderserum (FBS) auf 440 ml 1x hohen Glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). </li><li> 5 ml 100x GPS. </li><li> 5 ml nicht essentielle Aminosäure-Lösung. </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Machen Kollagen / Fibronektin-Lösung (3,6 mL; aus am selben Tag nach der Injektion) <ul><li> Fügen Sie 0,4 ml 10x DMEM auf 150 ul destilliertem H 2 O. </li><li> 100 l 1M HEPES (25 mM final). </li><li> Vorsichtig fügen 2,4 ml Rinder-Kollagen (5 mg / mL Lager 3 mg / mL endg.) und vorsichtig mischen auf dem Eis. </li><li> Stellen Sie den pH-Wert auf neutral durch Zugabe von 1N NaOH-Lösung (ca. 30 mL). </li><li> Verwenden Sie Phenolrot-Indikator auf einen neutralen pH bewerten; Alternative verwenden Sie pH-Testpapier auf pH-Monitor. </li><li> Add 120 ul humanem Fibronectin (1 mg / mL Lager 30 pg / mL endg.) </li><li> Fügen Sie 0,4 ml FBS (10% endg.) </li><li> halten Lösung auf Eis bis zum Gebrauch. </li></ul></li><li> Machen Fibrinogen-Lösung (1 mL, machte am selben Tag nach der Injektion) <ul><li> Zugabe von 30 mg in Pulverform Fibrinogen zu 1 ml 0,9 N NaCl (pH 7,4)-Lösung (30 mg / mL endg.). </li><li> Vor dem Gebrauch inkubieren Fibrinogen-Lösung bei 37 ° C für 30 Minuten. </li><li> Vorsichtig mischen, ohne Verwirbelungen, vor der Zugabe zu den Kollagen / Fibronektin Gel. </li></ul></li><li> Machen Thrombin-Lösung (200 mL) <ul><li> Add 1 KU von pulverförmigen Thrombin zu 200 ml 0,9% NaCl Kochsalzlösung (50 U / mL). </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Spritze Filter und bei -20 ° C bis zur Verwendung. </li><li> Vor dem Gebrauch verdünnt mit 0,9% NaCl normaler Kochsalzlösung auf eine Endkonzentration von 10 U / mL. </li></ul></li><li> Machen Sie 1% Gelatine-Lösung (500 mL) <ul><li> 5 g pulverisierte Gelatine 500 ml Dulbecco phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). </li><li> Bei 121 ° C für 30 min. </li><li> Filter sterilisiert mit einem 0,2-um Porengröße Vakuum-Filter. </li></ul></li><li> Coat 100-mm-Zellkulturplatten mit 1% Gelatine Beschichtungslösung <ul><li> Fügen Sie 10 ml 1% Gelatine-Lösung in jede 100-mm Gewebekulturplatte. </li><li> Die Platten bei 37 ° C für 60 min. </li><li> Vor dem Gebrauch entfernen Sie die Gelatine-Lösung und waschen Sie die Platten einmal mit PBS. </li></ul></li></ol> 2. Kultur der Menschenrechte Cord Endothelial Colony-Forming Cells (ECFCs) Blut-Derived Dieses Protokoll übernimmt gefrorene Fläschchen ECFC stehen im Labor vor diesem Experiment. ECFC können aus den mononukleären Zellfraktion entweder Nabelschnurblut oder Erwachsener peripheren Blut als vorher 7 beschrieben isoliert werden. <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen ECFCs (typischerweise 0,5-1x10 6 Zellen in 1 ml des Einfrierens Medien) aus dem flüssigen Stickstoff Speicher entnommen und sofort verdünnen deren Inhalt in einem 15-mL konische Röhrchen mit 10 ml DMEM-Medium. Spin bei 1200 rpm für 5 min. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml warmes EGM-2 Medium. </li><li> Fügen Sie die 10 ml ECFC Aufhängung in einer 1% Gelatine beschichtete 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag vorsichtig aspirieren aus ungebundenen Zellen und Medium, und Futtermitteln gebundenen Zellen mit 10 ml frisches EGM-2 Medium. </li><li> Vorschub der Platte alle 2-3 Tage mit EGM-2 Medium. Lassen Zellen zu erweitern, so dass die Platte durch eine konfluente Monolayer zellulären bedeckt ist. Bei Konfluenz Subkultur der Zellen wie folgt: </li><li> Absaugen aus dem Kulturmedium und die Zellen mit 10 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Bei 37 ° C und 5% CO 2 für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. </li><li> Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml EGM-2 Medium und sammeln Sie die Zelle Lösungenbindung an den 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der Zellen geerntet. </li><li> Platte die Zellen in 1% Gelatine beschichtete Zellkulturplatten mit einer Aussaatdichte von 5.000 Zellen / cm 2 mit EGM-2 Medium. Legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern sie alle 2-3 Tage mit EGM-2 Medium. </li></ol> Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Passagen. Verfolgen Sie die Passage-Nummer als der Zellpopulation wird erweitert. ECFCs wird zwischen den Kanälen 4-8 eingesetzt werden. 3. Kultur der Menschenrechte Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen (MSCs) Dieses Protokoll übernimmt gefrorene Fläschchen des menschlichen MSC stehen im Labor vor diesem Experiment. MSC isoliert aus Knochenmark saugt wie bisher 11 beschrieben. <ol><li> Tauwetter ein Fläschchen von MSCs (typischerweise 0.50-1x10 6 Zellen in 1 mL Einfrieren Medien) aus dem flüssigen Stickstoff Speicher entnommen und sofort verdünnen deren Inhalt in einem 15-mL konische Röhrchen mit 10 ml DMEM-Medium. Spin bei 1200 rpm für 5 min. Überstand entfernen und Zellpellet in 10 ml warmes MSCGM Medium. </li><li> Fügen Sie die 10 ml MSC Suspension in eine unbeschichtete 100-mm Gewebekulturplatte. Die Platte wird in einem befeuchteten Inkubator bei 37 ° C und 5% CO 2. Am nächsten Tag vorsichtig aspirieren aus ungebundenen Zellen und Medium, und Futtermitteln gebundenen Zellen mit 10 ml frisch MSCGM Medium. </li><li> Vorschub der Platte alle 2-3 Tage mit MSCGM Medium. Lassen Zellen zu erweitern, so dass die Platte 80% konfluenten Zellen Monoschicht erreicht. Bei 80% Konfluenz, Subkultur der Zellen wie folgt: </li><li> Absaugen aus dem Kulturmedium und die Zellen mit 10 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Bei 37 ° C und 5% CO2 für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. </li><li> Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml MSCGM Medium und sammeln Sie die Zell-Lösung in einen 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der Zellen geerntet. </li><li> Platte die Zellen in unbeschichteten Zellkulturplatten mit einer Aussaatdichte von 10.000 Zellen / cm 2 mit MSCGM Medium. Legen Sie die Platten in den Inkubator und füttern sie alle 2-3 Tage mit MSCGM Medium. </li></ol> Wiederholen Sie diesen Vorgang für nachfolgende Passagen. Verfolgen Sie die Passage-Nummer als der Zellpopulation wird erweitert. MSCs werden zwischen den Kanälen 4-8 eingesetzt werden. 4. Resuspension der Zellen in Collagen / Fibronectin / Fibrinogen-Lösung (Tag 0) Vor dem Versuch, stellen Sie sicher, es gibt genug ECFCs und MSCs in Kultur; 0.8x10 6 ECFCs und 1.2x10 6 MSCs wird für jedes Implantat und Maus erforderlich. <ol><li> Saugen Sie sich das Medium der jede Kultur Platte und waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS. Entfernen PBS und 2 mL Trypsin-EDTA-Lösung in jede 100-mm-Platte. Schütteln Sie die Platten zur gleichmäßigen Verteilung der Trypsin-EDTA-Lösung. Inkubieren für 3-5 Minuten. Klopfen Sie leicht die Platte an den abgelösten Zellen in Suspension unter einem inversen Mikroskop zu sehen. </li><li> Wenn die Zellen vollständig zu lösen, 8 ml DMEM-Medium und sammeln Sie die Zell-Lösung in einen 15-mL konischen Rohr. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellen in einer Zählkammer zählen und erarbeiten die Gesamtzahl der ECFCs und MSCs geerntet. </li><li> Transfer-4x10 6 ECFCs (5x 0.8x10 6 Zellen) und 6x10 6 PLM (5x 1.2x10 6 Zellen) in einem einzigen 50-mL konischen Rohr. Dies ist der Gesamtbetrag der Zellen für die fünf einzelnen Implantate und Mäuse benötigt. Zentrifugation bei 1200 rpm und Überstand. </li><li> Sanft, mit 100 uL der Fibrinogen-Lösung auf 0,9 ml Kollagen / Fibronektin-Lösung (3 mg / mL letzten Fibrinogenkonzentration); halten Sie die Mischung auf Eis. </li><li> Zellpellet auf 1 mL eiskaltem Kollagen / Fibronektin / Fibrinogen-Lösung, mischen Sie die Zellen sehr vorsichtig, um Blasen zu vermeiden. Laden Sie die Mischung in eine 1-mL sterile Spritze, und legen Sie eine 26-Gauge-Nadel mit seiner Kappe auf der Spitze der Spritze. Halten Sie die geladene Spritze auf Eis, bis Injektion. </li></ol> 5. Die Injektion in Immundefiziente Nacktmaus (Tag 0) Alle Tierversuche werden mit 6-Wochen alten athymischer (nu / nu) Mäusen durchgeführt werden. <ol><li> Vor der Injektion, betäuben die immundefizienten Mäusen, indem sie sie in eine Gaskammer liefert Isofluran. Lassen Sie die Maus auf die Isofluran für ca. 2 Minuten inhalieren, bis sie betäubt und reagiert nicht mehr bis zu den Zehen Prise (Überwachung ihrer Herzschläge durch Inspektion) sind. </li><li> Für jede Maus injizieren 50 ul Thrombin-Lösung (10 U / ml) subkutan in den oberen dorsalen Bereich mit einem 26-Gauge-Nadel. </li><li&gt; In der gleichen Stelle, wo Thrombin injiziert wurde, zu injizieren 200 ul der Zelle Mischung unter Verwendung eines 26-G-Nadel. Collagen wird Gel bei 37 ° C und Fibrinogen wird Fibrin-Gel in Gegenwart von Thrombin zu bilden. Als Ergebnis sollte das Implantat bilden eine kleine, aber spürbare, Bump unter die Haut. </li><li> Nach der Injektion statt der Mäuse auf einer Schicht aus Gaze für Komfort und Wärme und beobachten sie, bis sie ambulant zu werden. Dann nach, beobachten die Mäuse täglich für die ersten drei Tage. </li></ol> 6. Harvesting (Tag 7) <ol><li> Eine Woche nach der Injektion, euthanize die Mäuse, indem sie sie in eine Gaskammer liefert komprimierte CO 2-Gas. </li><li> Sobald eingeschläfert, aufgeschnitten die Haut in der Nähe der Bereich der Injektions-und chirurgisch zu entfernen das Gel-Stecker. Digitale Fotos der abgerufenen Gel-Stecker mit einer Skala wird empfohlen. </li><li> Legen Sie die geernteten Gel Stecker in histologischen Kassette und tief sie in 10% neutral gepuffertem Formalin über Nacht bei Raumtemperatur. </li><li> Nach der Fixierung, waschen Sie die 10% neutral gepuffertem Formalin weg mit destilliertem H 2 O und Ort der histologischen Kassetten bei 4 ° C in PBS bis histologische Beurteilung. </li></ol> 7. Evaluation: Histologie (H &amp; E) und Immunhistochemie (hCD31) <ol><li> Zur histologischen Auswertung werden die Implantate in Paraffin und geschnitten (7 Mikrometer dicke Abschnitte) mit Standard-histologische Verfahren eingebettet. </li><li> Quantify microvessel Dichte durch Auswertung von Hämatoxilin und Eosin (H &amp; E) gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der Implantate übernommen. Standard-Protokolle für die H &amp; E Färbung kann an anderer Stelle gefunden werden. Mikrogefäßen kann als luminalen Strukturen mit roten Blutkörperchen identifiziert werden. Bericht Mikrogefäßen Dichte wie die durchschnittliche Zahl der roten Blutkörperchen gefüllten Mikrogefäßen aus den Bereichen analysiert und Gefäße / mm 2 angegeben. </li><li> Zur Demonstration der menschlichen Natur der mikrovaskulären Gefäße, Abschnitte der abgerufenen Implantat sollte immunhistochemisch mit einem human-spezifischen CD31 (hCD31) Antikörper unter Verwendung von Standard Färbeprotokollen gefärbt werden. Wir empfehlen die Verwendung des monoklonalen Maus-Anti-Human-CD31-Antikörper aus DakoCytomation (Clone JC70A;. Cat # M0823) in einer 1:100-Verdünnung. Der menschliche Spezifität dieses Antikörpers wurde durch die negative Reaktion mit einer Vielfalt von Maus Gewebeschnitten, die in parallel 7,11 gefärbt wurden gewonnen bestätigt worden. Zu beachten ist, sind Maus Blutgefäße oft im Inneren der Implantate zu sehen (besonders um die Grenze), sondern mit der Maus Schiffe keine Flecken mit diesem Antikörper positiv. Darüber hinaus kann das Vorhandensein von menschlichen MSC durch immunhistochemische Färbung mit human-spezifische Antikörper gegen CD90 bzw. α-smooth muscle actin (α-SMA) nachgewiesen werden. Menschliche MSC sind sowohl in den perivaskulären Region neu gebildete Blutgefäße und interstitiell in das Implantat 11 befindet sich gefunden. </li></ol> 8. Repräsentative Ergebnisse <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig1.jpg" /> Abbildung 1. Typisches Erscheinungsbild ECFC und MSC Kulturen. Phasenkontrast-Aufnahmen zeigt die typische Erscheinungsbild der ECFCs und MSCs in Kultur. (A) Monolayer von Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs Darstellung der charakteristischen Kopfsteinpflaster Morphologie der Endothelzellen. (B) Human Knochenmark abgeleiteten MSCs Anzeige einer Spindelform Morphologie. Scaler Bars, 200 um. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig2.jpg" /> Abbildung 2. Aussehen der explantierten Stecker am Tag 7. Humanem Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs und Knochenmark abgeleiteten MSCs wurden in Kollagen / Fibronektin / Fibrin-Gel eingebettet und subkutan in Nacktmäuse implantiert, wie im Text beschrieben. (A) Nach 7 Tagen, sobald die Maus wurde eingeschläfert, aufgeschnitten die Haut in der Nähe der Bereich der Injektionsstelle und setzen die Zelle / Gelpfropfen durch Umklappen der Haut. (B) Aussehen des Steckers chirurgisch aus der Maus und vor Formalinfixierung entfernt. Die rote Farbe des Implantats ist ein Indiz für Vaskularisation. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig3.jpg" /> Abbildung 3. Histologische Identifizierung von Gefäßnetz in explantierten Stecker. Hämatoxilin und Eosin (H &amp; E) gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der explantierten Stecker genommen. (A) geringer Vergrößerung (10x) Aufnahme zeigt die Implantat (gekennzeichnet durch ein gelbes gestrichelte Linie) im Kontext der umgebenden Wirtsgewebe (dh, Fettgewebe und Skelettmuskulatur). (B) Starke Vergrößerung (40x) Aufnahme Anzeige mehrerer Mikrogefäßen (gelbe Pfeilspitze zeigt auf einige von ihnen) im Stecker; Mikrogefäßen kann als luminalen Strukturen mit roten Blutkörperchen identifiziert werden. <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/3065/3065fig4.jpg" /> Abbildung 4. Immunhistochemische Identifizierung von menschlichenLumen. Immunhistochemisch gefärbten Schnitten aus dem mittleren Teil der explantierten Stecker genommen. Bei einer Verdünnung 1:100; Färbung wurde mit einem monoklonalen Maus-Anti-Human-CD31 (hCD31) Antikörper aus DakoCytomation (. Cat # M0823 Clone JC70A); durchgeführt Zellkerne wurden mit Hämatoxilin gegengefärbt. (A) geringer Vergrößerung (10x) Aufnahme zeigt die Implantat (abgegrenzt durch eine schwarze gestrichelte Linie) im Kontext der umgebenden Wirtsgewebe. Die spezifischen menschlichen, CD31-positive Mikrogefäßen sind in braun (Peroxidase-Färbung) gefärbt. (B) Starke Vergrößerung (40x) Aufnahme Anzeige mehrerer Menschen Mikrogefäßen (schwarz Pfeilspitze an einigen hCD31-positive Lumen) im Stecker.

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	<li>Melero-Martin, J. M., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+13.+An+in+vivo+experimental+model+for+postnatal+vasculogenesis.">Chapter 13. An in vivo experimental model for postnatal vasculogenesis.</a> Methods Enzymol. 445, 303-329 (2008).</li><li>Koike, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+engineering:+creation+of+long-lasting+blood+vessels.">Tissue engineering: creation of long-lasting blood vessels.</a> Nature. 428, 138-139 (2004).</li><li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+formation+of+complex+microvessels+lined+by+human+endothelial+cells+in+an+immunodeficient+mouse.">In vivo formation of complex microvessels lined by human endothelial cells in an immunodeficient mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 97, 9191-9196 (2000).</li><li>N&amp;ouml, r., E, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+and+characterization+of+functional+human+microvessels+in+immunodeficient+mice.">Engineering and characterization of functional human microvessels in immunodeficient mice.</a> Lab Invest. 81, 453-463 (2001).</li><li>Lin, Y., Weisdorf, D. J., Solovey, A., Hebbel, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origins+of+circulating+endothelial+cells+and+endothelial+outgrowth+from+blood.">Origins of circulating endothelial cells and endothelial outgrowth from blood.</a> J Clin Invest. 105, 71-77 (2000).</li><li>Ingram, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+novel+hierarchy+of+endothelial+progenitor+cells+using+human+peripheral+and+umbilical+cord+blood.">Identification of a novel hierarchy of endothelial progenitor cells using human peripheral and umbilical cord blood.</a> Blood. 104, 2752-2760 (2004).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+vasculogenic+potential+of+human+blood-derived+endothelial+progenitor+cells.">In vivo vasculogenic potential of human blood-derived endothelial progenitor cells.</a> Blood. 109, 4761-4768 (2007).</li><li>Au, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+in+vivo+potential+of+endothelial+progenitor+cells+from+human+umbilical+cord+blood+and+adult+peripheral+blood+to+form+functional+long-lasting+vessels.">Differential in vivo potential of endothelial progenitor cells from human umbilical cord blood and adult peripheral blood to form functional long-lasting vessels.</a> Blood. 111, 1302-1305 (2008).</li><li>Yoder, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redefining+endothelial+progenitor+cells+via+clonal+analysis+and+hematopoietic+stem/progenitor+cell+principals.">Redefining endothelial progenitor cells via clonal analysis and hematopoietic stem/progenitor cell principals.</a> Blood. 109, 1801-1809 (2007).</li><li>Traktuev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+Functional+Vascular+Network+Formation+In+Vivo+by+Cooperation+of+Adipose+Progenitor+and+Endothelial+Cells.">Robust Functional Vascular Network Formation In Vivo by Cooperation of Adipose Progenitor and Endothelial Cells.</a> Circ Res. 104, 1410-1420 (2009).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+robust+and+functional+vascular+networks+in+vivo+with+human+adult+and+cord+blood-derived+progenitor+cells.">Engineering robust and functional vascular networks in vivo with human adult and cord blood-derived progenitor cells.</a> Circ Res. 103, 194-202 (2008).</li><li>Melero-Martin, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+Myeloid+Cells+Are+Necessary+for+Creating+Bioengineered+Human+Vascular+Networks+In+Vivo.">Host Myeloid Cells Are Necessary for Creating Bioengineered Human Vascular Networks In Vivo.</a> Tissue Eng Part A. 16, 2457-2466 (2010).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Dies ist ein experimentelles Modell für Biotechnik humanen vaskulären Netzwerken. Die wichtigsten Merkmale dieses Modells sind: 1) Mikrogefäßen sind aus menschlichen Zellen aus postnatalen Gewebe (dh Blut und Knochenmark) isoliert gebildet; 2) Mikrogefäßen bei einem erwachsenen Tier gebildet werden, und 3) Mikrogefäßen nicht von der Vorschule entstehen bestehenden (Host) Schiffe, sondern sie gebildet sind, de novo, aus einzelnen Zellen in einem geeigneten Gel suspendiert. Die Angiogenese spielt eine wichtige Rolle in diesem Test, weil Verbindungen zu den murinen Gefäßsystem notwendig sind, um rote Blutkörperchen gefüllten Gefäße, eine der funktionellen read-out in diesem Test zu erzielen. Darüber hinaus sind Host-myeloischen Zellen, um das Implantat in den ersten Tagen nach der Transplantation rekrutiert, und sie sind notwendig für die Bildung der neuen Gefäßbett 12. Dieses experimentelle Modell bietet ein vielseitiges, quantifizierbare und relativ einfaches Modellsystem, um die postnatale Entstehung von menschlichen vaskulären Netzwerken in-vivo-Studie. Darüber hinaus ist dieser Test einfach durchzuführen und es bedarf keiner einen Einschnitt oder chirurgischen Eingriffs. Das Modell könnte verwendet werden, um den vaskulären Potenzial von verschiedenen Quellen der menschlichen Endothelzellen und perivaskulären Zellen zu studieren. Das Modell könnte verwendet werden, um für die anti-und / oder pro-vaskulären Verbindungen Bildschirm. Schließlich kann das Modell verwendet, um die Rolle (n) bestimmter Gene bei der Entstehung und Funktion einer Gefäßnetz der menschlichen Endothel zusammen zu studieren.

<table border="1"><tbody><tr><th> Name des Reagenzes </th><th> Firma </th><th> Katalog-Nummer </th><th> Kommentare (optional) </th></tr><tr><td> Endothelial Basal Medium, EBM-2 </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td><td></td></tr><tr><td> EGM-2 SingleQuot Ergänzungen </td><td> Lonza </td><td> CC-3162 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamin-Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x GPS </td><td> Mediatech, Inc. </td><td> 30 bis 009-CI </td><td></td></tr><tr><td> Mesenchymalen Stammzellen Growth Medium BulletKit, MSCBM / MSCGM </td><td> Lonza </td><td> PT-3001 </td><td></td></tr><tr><td> Hohe Glukose Dulbeccos Modified Eagle Medium, 1x DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995-073 </td><td></td></tr><tr><td> MEM Non-essentielle Aminosäure-Lösung, 100x NEAA </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td></td></tr><tr><td> Hohe Glukose Dulbeccos Modified Eagle, gepudert DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12100-046 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES-Puffer-Lösung </td><td> Invitrogen </td><td> 15630-080 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex Bovine Collagen I-Lösung </td><td> Trevigen </td><td> 3442-050-01 </td><td></td></tr><tr><td> Cultrex humanem Fibronectin </td><td> Trevigen </td><td> 3420-001-01 </td><td></td></tr><tr><td> Fibrinogen aus Rinder-Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> F8630-1G </td><td></td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Fischer </td><td> DF0143-17-9 </td><td></td></tr><tr><td> Dulbeccos Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190-250 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin-EDTA-Lösung, 1x </td><td> Invitrogen </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> Isofluran, Flüssigkeit zur Inhalation </td><td> Buxter Healthcare Corporation </td><td> NDC 10019-360-40 </td><td></td></tr><tr><td> Thrombin aus bovinem Plasma </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T4648-1KU </td><td></td></tr><tr><td> Formalin-Lösung, Buffered Neutral </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> HT501128 </td><td></td></tr><tr><td> Monoklonalen Maus-Anti-Human CD31 Antikörper </td><td> DakoCytomation </td><td> M0823 </td><td> Clone JC70A </td></tr></tbody></table>

bioengineering human microvascular networks in immunodeficient mice

Die Zukunft des Tissue Engineering und zell-basierte Therapien für die Geweberegeneration wird wahrscheinlich auf unsere Fähigkeit, funktionale Gefäßnetze in vivo zu generieren verlassen. In dieser Hinsicht ist die Suche nach experimentellen Modellen zu Blutgefäßnetze in vivo zu bauen von größter Bedeutung 1. Die Machbarkeit der Biotechnik mikrovaskulärer Netzwerke in vivo wurde zum ersten Mal gezeigt, mit menschlichem Gewebe stammenden reifen Endothelzellen (ECs) 2-4, aber wie autologen Endothelzellen gegenwärtigen Probleme für eine breite klinische Anwendung, weil sie schwierig in ausreichenden Mengen zu erhalten und erfordern Ernte von bestehenden Gefäßsystem. Diese Einschränkungen haben angezettelt die Suche nach anderen Quellen der ECs. Die Identifizierung von Endothelzellen Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) im Blut präsentiert eine Gelegenheit, nicht-invasiv zu erhalten ECs 5-7. Wir und andere Autoren haben gezeigt, dass adulte und Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs die Fähigkeit, funktionale Gefäßnetze in vivo 7-11 bilden können. Wichtig ist, dass diese Studien haben auch gezeigt, dass eine stabile und dauerhafte Gefäßnetze zu erhalten, benötigen ECFCs Co-Implantation mit perivaskulären Zellen. Der Test wir hier beschreiben, veranschaulicht dieses Konzept: Wir zeigen, wie humanem Nabelschnurblut gewonnenen ECFCs kann mit Knochenmark-abgeleitete mesenchymale Stammzellen (MSCs) als eine einzige Zellsuspension in einer Kollagen / Fibronektin / Fibrinogen-Gel kombiniert werden, um eine funktionelle menschliche Form Gefäßnetz innerhalb von 7 Tagen nach der Implantation in einen immundefizienten Maus. Die Anwesenheit von Menschen ECFC gesäumten Lumen mit Host-Erythrozyten kann während der Implantate zeigt nicht nur die Bildung (de novo) eines Gefäßnetz, sondern auch die Entwicklung von funktionellen Anastomosen mit dem Host-Kreislauf-System zu sehen. Das Mausmodell der biotechnologisch menschlichen Gefäßnetz ist ideal für Studien über die zellulären und molekularen Mechanismen der menschlichen Gefäßnetz Bildung und für die Entwicklung von Strategien, um technisch Gewebe vaskularisieren geeignet.

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Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Bioengineering humane mikrovaskuläre Networks in immundefizienten Mäusen

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

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JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  Harvard Medical School. Hier beschreiben wir eine Methode zur menschlichen Nabelschnurblut-derived endothelial Kolonie-bildenden Zellen (ECFCs) und Knochenmark gewonnenen mesenchymalen Stammzellen (MSCs) in einem Kollagen / Fibronektin Gel eingebettet, subkutan in immundefizienten Mäusen. Liefern Diese Zelle / Gel-Kombination erzeugt eine humane vaskuläre Netzwerk, das mit der Maus Gefäßsystem verbindet.

Serie: Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

Using Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) to Develop Diagnostic Tools

Using Micro-Electro-Mechanical Systems MEMS to Develop Diagnostic Tools

Mit Micro-Electro-Mechanical Systems (MEMS) zu Diagnose-Tools entwickeln

Forschung

Biologie

CD4+ T-Lymphocyte Capture Using a Disposable Microfluidic Chip for HIV

CD4 + T-Lymphozyten Erfassen mit einem Einweg-Mikrofluidik-Chip für HIV

Title Cell Encapsulation by Droplets

Titel der Verkapselung von Zellen durch Tröpfchen

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering 

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development of constructs for tissue engineering. This environment better mimics what cells observe in vivo, compared to standard tissue culture, due to the tissue-like properties and 3D environment. Synthetic polymeric hydrogels are water-swollen networks that can be designed to be stable or to degrade through hydrolysis or proteolysis as new tissue is deposited by encapsulated cells. A wide variety of polymers have been explored for these applications, such as poly(ethylene glycol) and hyaluronic acid. Most commonly, the polymer is functionalized with reactive groups such as methacrylates or acrylates capable of undergoing crosslinking through various mechanisms. In the past decade, much progress has been made in engineering these microenvironments - e.g., via the physical or pendant covalent incorporation of biochemical cues - to improve viability and direct cellular phenotype, including the differentiation of encapsulated stem cells (Burdick et al.).
The following methods for the 3D encapsulation of cells have been optimized in our and other laboratories to maximize cytocompatibility and minimize the number of hydrogel processing steps. In the following protocols (see Figure 1 for an illustration of the procedure), it is assumed that functionalized polymers capable of undergoing crosslinking are already in hand; excellent reviews of polymer chemistry as applied to the field of tissue engineering may be found elsewhere (Burdick et al.) and these methods are compatible with a range of polymer types. Further, the Michael-type addition (see Lutolf et al.) and light-initiated free radical (see Elisseeff et al.) mechanisms focused on here constitute only a small portion of the reported crosslinking techniques. Mixed mode crosslinking, in which a portion of reactive groups is first consumed by addition crosslinking and followed by a radical mechanism, is another commonly used and powerful paradigm for directing the phenotype of encapsulated cells (Khetan et al., Salinas et al.).

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogels for Tissue Engineering

We present protocols for the 3-dimensional (3D) encapsulation of cells within synthetic hydrogels. The encapsulation procedure is outlined for two commonly used methods of crosslinking (michael-type addition and light-initiated free radical mechanisms), as well as a number of techniques for assessing encapsulated cell behavior.

Cellular Encapsulation in 3D Hydrogele für Tissue Engineering

The 3D encapsulation of cells within hydrogels represents an increasingly important and popular technique for culturing cells and towards the development ...

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal (ICC) Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves required for peristalsis and mediate neuronal input from the enteric nervous system1. Different subtypes of ICC form distinct networks in the muscularis of the GI tract 2,3. Loss or injury to these networks is associated with a number of motility disorders4. ICC cells express the KIT receptor tyrosine kinase on the plasma membrane and KIT immunostaining has been used for the past 15 years to label the ICC network5,6. Importantly, normal KIT activity is required for ICC development5,6. Neoplastic transformation of ICC cells results in gastrointestinal stromal tumor (GIST), that frequently harbor gain-of-function KIT mutations7,8. We recently showed that ETV1 is a lineage-specific survival factor expressed in the ICC/GIST lineage and is a master transcriptional regulator required for both normal ICC network formation and for of GIST tumorigenesis9. We further demonstrate that it cooperates with activating KIT mutations in tumorigenesis. Here, we describe methods for visualization of ICC networks in mice, largely based on previously published protocols10,11. More recently, the chloride channel anoctamin 1 (ANO1) has also been characterized as a specific membrane marker of ICC11,12. Because of their plasma membrane localization, immunofluorescence of both proteins can be used to visualize the ICC networks. Here, we describe visualization of the ICC networks by fixed-frozen cyrosections and whole mount preparations.

Visualization of the Interstitial Cells of Cajal ICC Network in Mice

The interstitial cells of Cajal (ICC) are the pacemaker cells of the gastrointestinal (GI) tract. They form complex networks between smooth muscle cells and post-ganglionic neuronal fibers to regulate GI contractility. Here, we present immunofluorescence methods cross-sectional and whole-mount visualization of murine ICC networks.

Visualisierung der interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) Netzwerk in Mäuse

The interstitial cells of Cajal (ICC) are mesenchymal derived "pacemaker cells" of the gastrointestinal (GI) tract that generate spontaneous slow waves ...

Endothelial Cell Co-culture Mediates Maturation of Human Embryonic Stem Cell to Pancreatic Insulin Producing Cells in a Directed Differentiation Approach

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are pluripotent, thus having the potential to differentiate into multiple lineages. Such properties make ESCs extremely attractive for cell based therapy and regenerative treatment applications 1. However for its full potential to be realized the cells have to be differentiated into mature and functional phenotypes, which is a daunting task. A promising approach in inducing cellular differentiation is to closely mimic the path of organogenesis in the in vitro setting. Pancreatic development is known to occur in specific stages 2, starting with endoderm, which can develop into several organs, including liver and pancreas. Endoderm induction can be achieved by modulation of the nodal pathway through addition of Activin A 3 in combination with several growth factors 4-7. Definitive endoderm cells then undergo pancreatic commitment by inhibition of sonic hedgehog inhibition, which can be achieved in vitro by addition of cyclopamine 8. Pancreatic maturation is mediated by several parallel events including inhibition of notch signaling; aggregation of pancreatic progenitors into 3-dimentional clusters; induction of vascularization; to name a few. By far the most successful in vitro maturation of ESC derived pancreatic progenitor cells have been achieved through inhibition of notch signaling by DAPT supplementation 9. Although successful, this results in low yield of the mature phenotype with reduced functionality. A less studied area is the effect of endothelial cell signaling in pancreatic maturation, which is increasingly being appreciated as an important contributing factor in in-vivo pancreatic islet maturation 10,11.
The current study explores such effect of endothelial cell signaling in maturation of human ESC derived pancreatic progenitor cells into insulin producing islet-like cells. We report a multi-stage directed differentiation protocol where the human ESCs are first induced towards endoderm by Activin A along with inhibition of PI3K pathway. Pancreatic specification of endoderm cells is achieved by inhibition of sonic hedgehog signaling by Cyclopamine along with retinoid induction by addition of Retinoic Acid. The final stage of maturation is induced by endothelial cell signaling achieved by a co-culture configuration. While several endothelial cells have been tested in the co-culture, herein we present our data with rat heart microvascular endothelial Cells (RHMVEC), primarily for the ease of analysis.

The current study describes a directed differentiation approach in inducing pancreatic differentiation of human embryonic stem cells. Of great significance is the finding that endothelial cell co-culture mediates maturation of human embryonic stem cell derived pancreatic progenitors into insulin expressing cells.

Endothelial Cell Co-Kultur Vermittelt Reifung von humanen embryonalen Stammzellen zu Pankreas-Insulin-produzierenden Zellen in einer gerichteten Differenzierung Ansatz

Embryonic stem cells (ESC) have two main characteristics: they can be indefinitely propagated in vitro in an undifferentiated state and they are ...

RNA-seq Analysis of Transcriptomes in Thrombin-treated and Control Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the cell is affected by external signals (e.g. drug treatment), or how cells differ between a healthy state and a diseased state. With the advent and continuous refinement of next-generation DNA sequencing technology, RNA-sequencing (RNA-seq) has become an increasingly popular method of transcriptome analysis to catalog all species of transcripts, to determine the transcriptional structure of all expressed genes and to quantify the changing expression levels of the total set of transcripts in a given cell, tissue or organism1,2 . RNA-seq is gradually replacing DNA microarrays as a preferred method for transcriptome analysis because it has the advantages of profiling a complete transcriptome, providing a digital type datum (copy number of any transcript) and not relying on any known genomic sequence3.
Here, we present a complete and detailed protocol to apply RNA-seq to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is based on our recent published study entitled "RNA-seq Reveals Novel Transcriptome of Genes and Their Isoforms in Human Pulmonary Microvascular Endothelial Cells Treated with Thrombin,"4 in which we successfully performed the first complete transcriptome analysis of human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin using RNA-seq. It yielded unprecedented resources for further experimentation to gain insights into molecular mechanisms underlying thrombin-mediated endothelial dysfunction in the pathogenesis of inflammatory conditions, cancer, diabetes, and coronary heart disease, and provides potential new leads for therapeutic targets to those diseases.
The descriptive text of this protocol is divided into four parts. The first part describes the treatment of human pulmonary microvascular endothelial cells with thrombin and RNA isolation, quality analysis and quantification. The second part describes library construction and sequencing. The third part describes the data analysis. The fourth part describes an RT-PCR validation assay. Representative results of several key steps are displayed. Useful tips or precautions to boost success in key steps are provided in the Discussion section. Although this protocol uses human pulmonary microvascular endothelial cells treated with thrombin, it can be generalized to profile transcriptomes in both mammalian and non-mammalian cells and in tissues treated with different stimuli or inhibitors, or to compare transcriptomes in cells or tissues between a healthy state and a disease state.

This protocol presents a complete and detailed procedure to apply RNA-seq, a powerful next-generation DNA sequencing technology, to profile transcriptomes in human pulmonary microvascular endothelial cells with or without thrombin treatment. This protocol is generalizable to various cells or tissues affected by different reagents or disease states.

RNA-seq Analyse Transkriptomen Thrombin-behandelt und Control Human Pulmonary mikrovaskulären Endothelzellen

The characterization of gene expression in cells via measurement of mRNA levels is a useful tool in determining how the transcriptional machinery of the ...

Efficient Generation Human Induced Pluripotent Stem Cells from Human Somatic Cells with Sendai-virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs include modeling pathogenesis of human genetic diseases, autologous cell therapy after gene correction, and personalized drug screening by providing a source of patient-specific and symptom relevant cells. However, there are several hurdles to overcome, such as eliminating the remaining reprogramming factor transgene expression after human iPSCs production. More importantly, residual transgene expression in undifferentiated human iPSCs could hamper proper differentiations and misguide the interpretation of disease-relevant in vitro phenotypes. With this reason, integration-free and/or transgene-free human iPSCs have been developed using several methods, such as adenovirus, the piggyBac system, minicircle vector, episomal vectors, direct protein delivery and synthesized mRNA. However, efficiency of reprogramming using integration-free methods is quite low in most cases.
Here, we present a method to isolate human iPSCs by using Sendai-virus (RNA virus) based reprogramming system. This reprogramming method shows consistent results and high efficiency in cost-effective manner.

Here, we present our established method to reprogram human somatic cells into transgene-free human iPSCs with Sendai virus, which shows consistent outcome and enhanced efficiency.

Effiziente Erzeugung Menschen induzierten pluripotenten Stammzellen aus menschlichen Körperzellen mit Sendai-Virus

A few years ago, the establishment of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) ushered in a new era in biomedicine. Potential uses of human iPSCs ...

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein &#945;-subunit) is described in detail.

This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.

Selected Reaction Monitoring-Massenspektrometrie für Absolute Proteinquantifizierung

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

Bestimmung von Sialinsäuren in Leber- und Milchproben von Wildtyp und<em&gt; CMAH</em&gt; Knock-out Mäuse.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...