Wir danken der Ohio State University Comprehensive Cancer Center Analytical Cytometry Core Facility, speziell Katrina Moore, für die technische Unterstützung bei der FACS-Analyse. Darüber hinaus erkennen wir, Dr. William Pu und seine Gruppe für ihre wissenschaftlichen Erkenntnisse. Diese Arbeit wurde vom NIH HL091878 (JL) und das Herzzentrum bei Nationwide Kinderkrankenhaus unterstützt.

1. Herstellung der Geräte und Lösungen <ol><li> Sterilisieren Sie die Dissektion Werkzeuge - Feingewebe Schere Erwachsenen Herzen und 2 feinen Pinzette für die Präparation des Klappen Region zu extrahieren - in einem überdachten Instrumentenablage durch Autoklavieren. Spritzwerkzeuge mit 70% Ethanol (EtOH) vor der Dissektion. </li><li> Bereiten alle Lösungen unmittelbar vor dem Experiment und sterilisieren Lösungen, indem sie durch einen sterilen 0,2 um Filter. Halten Sie Lösungen auf Eis bis zum Gebrauch. <ol><li> Sterile Dissoziationspuffer (15 ml Gesamt / Probe). Kombinieren Sie 1,2 ml Kollagenase IV, 300 ul 2,5% Trypsin und 150 ul Küken Serum. Bringt Volumen von bis zu 15 ml mit Hanks Balanced Salt Solution (HBSS). </li><li> Sterile Sortierpuffer (12 ml insgesamt). Kombinieren von 25 ul 0,5 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 12 ul DNase I (RNase-frei). Bringt Volumen von bis zu 12 ml mit HBSS. </li><li> VEC Kultur Medien. Mix endothelialen growth Medien gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Material Tabellenkalkulation), indem Sie die aliquotiert Komponenten aus dem Kit zu 500 ml EBM2 Medien. </li><li> GFP Negative Kultur, Medien (Nicht-Endothelzellen Medien). Mischen 445 ml Medium 199 1x mit 5 ml Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep) (1% Endkonzentration) und 50 ml FBS (10% Endkonzentration). </li></ol></li></ol> 2. Präparation der Herzklappen Region von Mäusen und Erwachsene E14.5 Embryonen <ul><li> Alle Tier Verfahren genehmigt und in Übereinstimmung mit der bundesweiten Kinderklinik Forschungsinstitut IACUC Richtlinien durchgeführt. </li><li> Tie2-GFP-Mäuse wurden von Jackson Laboratories (Bestellnummer 003658) 14 gekauft und wurden als homozygote Genotypen auf einem FVB / N Hintergrund gehalten, und damit sicherzustellen, dass alle Off-Feder ausdrückliche GFP in Tie2-positiven Endothelzellen. </li><li> Für FACS-Sortierung, bereiten einem Alter abgestimmt negativen sample, die nicht GFP enthält wie C57 / Bl6 GFP Gate-Parameter für die FACS-Sortierung eingestellt. Hinweis: Dieses Protokoll und repräsentative Ergebnisse basieren auf der Verwendung drei, vier Monate alten erwachsenen Mäusen oder einen Wurf an embryonalen Tag (E) 14.5 basiert. </li></ul><ol><li> Erwachsene Mäuse: unmittelbar nach der Tötung von CO 2 Anoxie, verwenden Dissektion Schere öffnen Sie vorsichtig die Brusthöhle und setzen die Herz und Lunge. Einmal ausgesetzt, Griff das Herz mit einer Pinzette an den großen Arterien und ziehen weg aus dem Körper. Lungengewebe zu entfernen, wenn intakt und Ort Herzen in kaltem HBSS zu spülen. Entfernen Sie die Herzkammer und ziehen weg die Vorhöfe des AV-Kanal &quot;Ring&quot; und Aorten-Regionen intakt. Machen Sie einen Schnitt an der Seite von AV-Kanal zu öffnen, den &quot;Ring&quot; und setzen die Klappenstrukturen. Entfernen Sie den Herzmuskel und der proximalen Aorta Regionen vorsichtig mit einer Pinzette entfernt necken. Identifizieren Sie die Klappensegel als weiße, dichte Gewebe über dem rosa Myokard. Sanft DetaCH Das Sehnenfäden aus den AV-Klappen und entfernen Sie so viel von der restlichen Myokard wie möglich. Seien Sie vorsichtig, um nicht ziehen oder kratzen die Klappensegel in diesem Prozess seit VECs kann verdrängt werden. Platzieren getrimmt Klappenbereiche in einem 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen mit 1 ml HBSS und auf Eis halten. HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation ist entscheidend, um nicht-valvulärem Endothelzellen, die die Probe verunreinigen könnten zu beseitigen. </li><li> Embryonen: Sacrifice weiblichen Mäusen 14,0 Tage nach der Kopulation beobachtet Stecker (morgens der Kopulation Stecker = 0.5 Tage). <ol><li> Unmittelbar nach der Tötung, sezieren die Gebärmutter (mit Embryonen), und Wäsche in kaltem HBSS. Sezieren einzelne Embryonen aus der Gebärmutter und entfernen Sie die embryonalen Dottersack jedes Embryo umgibt. Entfernen Sie die Herzen von jedem der Embryonen und führen Sie Schritt 2.1. (HINWEIS: leichtes Zusammendrücken der Embryo mit einer Pinzette direkt unter den oberen Fortsätze sollen helfen, das Herz freizulegen und stellen die Entfernung zu erleichtern.) </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Zelle Dissoziation und Vorbereitung für die FACS <ol><li> Mit sterilen Pipettenspitzen, entfernen HBSS aus dem Eppendorf-Röhrchen, die die Herzklappen Regionen. </li><li> Ersetzen mit 1 ml Dissoziationspuffer und 4 ul DNase I. </li><li> Drehen die Röhrchen bei 37 ° C für 7 min. </li><li> Pipette auf und ab 3 Mal und dann lassen Sie die Probe für 15 Sekunden absetzen. Die überstehende Flüssigkeit (die dissoziierten Zellen enthält) in einem 15 ml konischen Röhrchen. </li><li> Um die Reaktion zu stoppen Kollagenase, fügen Sie 125 ul von Pferdeserum auf die Sammelröhrchen. Halten Sammelröhrchen auf Eis. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte Dissoziation (3,2-3,5) neun Mal zu neun Fraktionen der Überstand zu sammeln. </li><li> Übergeben Sie die fraktionierte Sammlung durch eine 70 um Nylonfilter in ein neues Sammelröhrchen, um eine Einzelzellsuspension durch Entfernen Sie alle Fremdkörper und Klumpen zu gewährleisten. </li><li> Drehen Sie die Suspension bei 400 g für 5 min, um die Zellen zu pelletieren. </li><li> Zellpellet in 1 ml Sortierpuffer undauf Eis zu halten, bis FACS. </li></ol> 4. FACS-Sortierung GFP positive VECs <ol><li> Gesetzt Tore für vorne und Seitenstreuung, um Schmutz auszuschließen und Aufnahme von Einzelzellen; Dubletten ausschließen, indem Sie Wams Diskriminierung Gating. Notieren Sie sich die negative Kontrollprobe und Gate-Einstellungen zu definieren, um in der Tie2-GFP Probe zu vergleichen und genau zu definieren, die das GFP-positive Zellpopulation. </li><li> Analyse GFP-positiven Zellen über FACS und verfeinern Gate-Einstellungen. </li><li> Sortieren Sie die Tie2-GFP Probe und sammeln beide GFP-positiven und GFP-negativen Zellen. Wenn Zellen zur RNA-Extraktion, Art direkt in den Sortierpuffer verwendet werden. Zur Kultivierung von Zellen nach FACS, sammeln GFP-positiven Zellen in einem sterilen Röhrchen mit 1 ml VEC Medien mit 1 ml FBS und sammeln GFP-negativen Zellen in 1 ml von nicht-endothelialen Medien mit 1 ml FBS. Verwenden Sie diese 50% Medien / 50% Serum Kombination, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Halten Sie sich auf Eis, bis nach FACS-Analyse. </li></ol> 5. Beitrag FACS Analysis <ol><li> RNA-Extraktion: <ol><li> Unmittelbar nach FACS, Zentrifuge GFP positiven und-negativen Zellen bei 1.500 g für 8 min. </li><li> Beim Pipettieren der Überstand (Sortierpuffer) und entsorgen. </li><li> Zellpellet (Pellet ist nicht für die Stichprobengrößen hier empfohlen sichtbar) in 200 ul Trizol. </li><li> Einfrieren bei -80 ° C oder beginnen Standard Phenol-Chloroform-Extraktion zur Gesamt-mRNA zu isolieren, wie zuvor von unserem Labor 15 beschrieben. </li><li> Verwenden 50-200 ng RNA für die cDNA-Synthese unter Verwendung des Mastermix nach den Anweisungen des Herstellers. </li><li> Gegenstand cDNA, quantitative PCR-Amplifikation unter Verwendung von IDT Primetime qPCR-Sonden gegen Maus-Endothelzellen-Marker (CD31, von Willebrand Faktor (vWF)), Ventil interstitiellen Zellmarker (α-Aktin des glatten Muskels (α-SMA), Periostin (Postn)), Myozyten Marker (Mhc6, Mhc7) und GAPDH. </li></ol&gt; </li><li> Züchten Murine VEC: <ol><li> Nach FACS-Sortierung und Zellsammlung (Schritt 4.3), Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min. </li><li> Beim Pipettieren Sie den Überstand (Sortierpuffer + Medien) und entsorgen. </li><li> Resuspendieren der GFP-positiven Zellpellet in 1 ml VEC Medien und die GFP-negative Pellet in 1 ml nicht-endothelialen Medien. </li><li> Schild Jede Probe in eine Vertiefung einer Plastikkammer Schieber und wachsen bis zur Konfluenz. Kultur für etwa 1 Woche für GFP-negativen Zellen konfluent werden und mehr als 2 Wochen für GFP-positiven Zellen konfluent geworden (aus einer Probe von 3, erwachsene Mäuse). Ändern Medien alle zwei Tage. </li></ol></li><li> Immunfluoreszenzfärbung: <ol><li> Entfernen Medien von Zellen und Fixierung in 4% Paraformaldehyd (PFA) für 30 min bei RT. Für jeweils 5 min in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen fixierten Zellen dreimal. </li><li> Entfernen Kammer Vertiefungen von Folie und Block in 5% Rinderserumalbumin / 1 × PBS für 1 h bei RT. </li><li> BebrütenFolien O / N bei 4 ° C mit Primärantikörpern (CD31, 1: 1000 oder α-Aktin des glatten Muskels (α-SMA), 1: 100). Für 5 min in PBS waschen 3x. </li><li> Verdünnen Sie die Sekundärantikörper (Alexa-Fluor 568 Ziege anti-Rat) 1: 400 in PBS, in den Rutschen, und Inkubation 1 h bei RT. Spülen Folien 3x für 5 min in PBS. </li><li> Berg in Vectashield haltigen DAPI und Inkubation 1 h bei 4 ° C vor der Anzeige. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Hier erstmals beschreiben wir ein neues Verfahren zur Isolierung von embryonalen und adulten murinen VECs von Tie2-GFP-Mäuse. Während dieser Mauslinie wurde ausgiebig für die Isolierung von endothelialen Zellpopulationen verwendet wird, ist dies der erste Bericht zeigt selektive Isolierung von VECs. Wegen der Zerbrechlichkeit der VEC Bevölkerung haben wir eine strenge Protokoll, für Einzelzellisolierung von GFP positiven (negativen und GFP) Zellen von Herzklappen von embryonalen und adulten Mäusen ermöglicht. Im Vergleich zu der ursprünglichen Veröffentlichung mit ganzen Embryonen oder Organe von Tie2-GFP-Mäuse 14, haben wir Kollagenase und Dissektion Schritte auf der Grundlage der geringe Häufigkeit dieser fragilen endothelialen Zellpopulation, eine ausgewählte Population von Zellen zu isolieren optimiert. VEC-Isolierungen haben bisher nur in Großtiermodellen mit begrenzten genetischen und molekularbiologischen Werkzeuge berichtet. Diese Werkzeuge sind in Mäusen festgestellt, und daher die ABIkeit murine VECs isolieren ermöglicht einen erweiterten Satz von experimentellen Designs für Herzklappen Forschung verwendet werden. Deshalb ist ein wesentlicher Vorteil dieses Ansatzes, dass VECs kann zeitlich von Wildtyp-Mäusen, und Modelle von Klappenerkrankungen und Verletzungen isoliert werden. Ein zweiter Vorteil ist, dass VECs isoliert und fast sofort analysiert nach der Sektion, die Erhaltung Expressionsmuster, das die in vivo-Situation genauer zu reflektieren. Ferner ist diese Trennprotokolls ausreicht, um Zellkultur-Nr Expansion und somit potentielle phänotypischen Veränderungen durch die in vitro-Umgebung induzierten beseitigen verhindert. Trotz der Neuerungen und experimentelle Vorteile dieses Protokoll, erkennen wir, dass Einschränkungen existieren noch. Erstens ist die Grße des VEC Bevölkerung im murinen Ventile sehr klein, und daher werden mehrere zeitlich embryonalen Würfe um ausreichend RNA für Genexpressionsanalyse zu erzeugen benötigt. Während this kann mit mehreren Züchtern überwunden werden, könnte es einen Einfluss auf die Anwendung von einigen Post-Isolierung Analyse-Tools. Diese Einschränkung hat sich besonders für die Einrichtung konfluenten Kulturen von GFP-positiven VECs um genauere Analysen der VEC Phänotypen einschließlich molekularer Profile und funktionelle Assays durchzuführen war eine Herausforderung. Daher bestätigen wir, dass nicht alle Schwierigkeiten wurden von unseren Ansatz zu überwinden, aber dies ist ein Bereich von Interesse, dass wir sind bestrebt, zu überwinden. Dieser Ansatz zur Isolierung von VECs Klappen Regionen stellt die Möglichkeit einer Kontamination von Tie-GFP-positiven, nicht-valvulärem Endothelzellen der Endokard oder Gefäßstrukturen im Myokard. Bisher wurden molekulare Unterscheidung VECs von anderen Herz endothelialen Zellpopulationen nicht identifiziert. Jedoch ein Enhancer-Region des NFATc1 Gen identifiziert und gezeigt, spezifisch zu markieren, die nicht VECsEMT unterziehen, und keine andere endotheliale Zellpopulation innerhalb des Herzens 18. Als Cre-Modell (NFATc1 ENCRE) verfügbar ist, könnten zukünftige Studien die Spezifität dieser Linie nutzen, um Kontaminationsrisiken zu minimieren. Zusätzlich zu nicht-Klappen Tie2-GFP-positiven Zellen, besteht immer die Möglichkeit einer Kontamination von Myozyten an dem Punkt, wo die Klappensegel zu befestigen an den ringförmigen Bereich des septalen und Wand myokardialen Wände. In der Daten hier nicht dargestellt, zunächst begannen wir Studien, um VECs von seziert Klappen Regionen mit Antikörper-konjugierten Perlen mit anti-GFP und anti-CD31 beschichtet isolieren. Während dieser Ansatz erfolgreich zur Isolierung der Endothelzellen war, erlebten wir eine signifikante Zell Verklumpung von benachbarten, nicht-endothelialen Zelltypen und damit VICs und Herzmuskelzellen verunreinigt unsere experimentellen Probe. Dies wurde mit Hilfe der FACS-Analyse als Parameter eingestellt sind, nur Einzelzellsuspension zu isolieren vermiedens und die PCR-Analyse zum Nachweis der Expression Myocyten-spezifischen Gene für diese Begrenzung (3) gesteuert wird. Während unsere Verunreinigung als minimal erachtet werden, bleibt es ein Potential experimentellen Aufwand, der in der Zukunft mit der Doppelselektion von GFP und Endothelzell-spezifische Oberflächenmarker vermieden werden. Über dieses Protokoll, haben wir erfolgreich isoliert VECs von embryonalen und adulten Mäusen und bereitgestellt Beispiele, wie dieser Ansatz für die RNA-Isolierung und Zellkultur von GFP und GFP positive negativen Zellpopulationen verwendet werden. Jedoch ist dieser Ansatz nicht auf diese Anwendungen beschränkt und kann für eine Vielzahl von molekularen, zellulären und funktionalen Ansätze verwendet werden. Darüber hinaus kann der Tie2-GFP Hintergrund mit genetischen Mausmodellen, die für Vergleichsstudien von VEC Bevölkerung in Gesundheit und Krankheit ermöglichen wird gezüchtet werden. Die Entwicklung dieser neuartigen Methodik wird, zum ersten Mal, ermöglichen gezielte StudienPrüfung der Beitrag der VECs in Ventil Entwicklung und Wartung und konnte bisher unbeachtet Mechanismen der endothelialen abhängige Klappenerkrankungen zeigen.

Das reife Ventil aus drei geschichteten Lagen von spezialisierten extrazellulären Matrix (ECM) mit Ventilzwischenzellen (VIC) durchsetzt und eingekapselt durch eine einzige Schicht von Herzklappen Endothelzellen (VEC) 1 zusammengesetzt. Die Rolle der ECM ist, alle notwendigen biomechanischen Eigenschaften zu ständigen Änderungen der hämodynamischen Kraft während des Herzzyklus zu widerstehen. Umsatz des Ventil ECM im erwachsenen Ventil fest durch VICs weitgehend ruhenden Fibroblasten-ähnliche und in Abwesenheit von Krankheit geregelt. Neben dem VIC Bevölkerung Herzklappe Endothelzellen (VEC) einen ununterbrochenen Endothel über die Oberfläche der Klappensegel 2. Während die Bedeutung von ECM und VICs Ventil Struktur und Funktion sind von uns und anderen beschrieben wurde, ist die Rolle der VECs weniger bekannt. Jedoch ist dieser vergleichsweise kleinen Zellpopulation kritischen Ventilbildung im Embryo und als dysfunktional Ventil beschriebenKrankheit. Herzklappenbildung im Embryo beginnt, wenn eine Teilmenge von Endothelzellen in den AV-Kanal und Ausflusstrakt Regionen unterziehen endotheliale mesenchymale Transformation (EMT) und Form wie Schwellungen Endokardkissen 1,3 bekannt. Die neu verwandelt mesenchymalen Zellen innerhalb dieser Strukturen später in VICs zu differenzieren und die reifen Ventile zu bilden. Sobald EMT abgeschlossen ist, Endothelzellen umgebenden die Kissen, genannt VECs, bilden eine ununterbrochene endothelialen Zellschicht, die die reifen Ventil vor Verletzungen schützt. Darüber hinaus erfassen die hämodynamische VECs Umwelt und haben gezeigt, dass molekular kommunizieren mit Basiswert VICs zu regulieren ECM Homöostase 1,3. In erkrankten Ventile wird die VEC-Monoschicht in Verbindung mit krankhaften Veränderungen in Organisation und ECM verändert Biomechanik 4,5 gestört. Darüber hinaus Studien in Mausmodellen zeigen, dass VEC Dysfunktion ist die zugrunde liegende Ursache der Ventil disease 1,6-9. Wie VECs spielen eine wichtige Rolle in der Ventil Entwicklung, Wartung und Krankheit, ist es wichtig, dass wir ihre zeitliche Phänotypen voll in Ordnung, um das Feld zu fördern und zu verstehen, Mechanismen der Krankheits definieren. Frühere Arbeiten von mehreren Labors erfolgreich isoliert VECs aus Schweine und Schafen Modelle 10-12. Aufgrund der großen Grße dieser Ventile, Trennung durch Betupfen und / oder enzymatische Verdauung, gefolgt von einer Anzahl von verschiedenen Verfahren, einschließlich Isolierung magnetischen Kügelchen Zelltrennung und Einzelzell klonalen Expansion wirksam war, um reine Populationen 11-13 zu erzeugen. Allerdings können diese Modelle restriktiv sein aufgrund der unvollständigen Annotation von den Schweinen und Schafen Genome Einschränkung der Verfügbarkeit von molekularen Werkzeugen zusätzlich zu den hohen Kosten. Daher Experimente von Schweine-und Schaf VECs nach Isolierung können restriktiv sein. Mausmodelle sind bevorzugt wegen der vielen Möglichkeiten für die genetische Manipulationention und molekulare Werkzeuge in den Embryo und Erwachsenen, aber bis heute keine VEC-Isolationen in kleinen Tiermodellen berichtet worden. Dies ist aufgrund der Schwierigkeit bei der Arbeit mit kleinen Gewebeproben, die eine Minderheit Zellpopulation, die gegenwärtig nicht eindeutige Identität VEC-spezifischen Markern, wodurch Antikörper-basierten Isolationsverfahren umfassen wahrscheinlich verhindert. In diesem Artikel, eine neue Methode zur direkten Isolierung von murinen VECs an embryonalen und adulten Stadien berichten wir. Dieses Protokoll nutzt Tie2-GFP Mäusen, die GFP in allen endothelialen Zelltypen zu äußern und wurden umfassend genutzt, um endotheliale Zellpopulationen 14 studieren. Jedoch ist die Neuheit dieser aktuellen Studie, dass diese Mäuse zum ersten Mal verwendet worden, um Endothelzellen von den Ventilen isolieren. Durch sorgfältige Dissektion der Klappengewebe und einer Reihe von neun enzymatischen Verdaus, gefolgt von FACS-Sortierung kann VECs isoliert und für verschiedene experimentelle Techniken verwendet werden,einschließlich RNA-Extraktion und Kultur, direkt nach Sortierung.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>		
<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rat IgG (H+L)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">A-11077</td>
			<td style="width:148px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">70 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td style="width:107px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:107px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">2.5% Trypsin</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, Heat Shock Treated</td>
			<td style="width:107px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">CD31 rat anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:107px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:107px;">553370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Chick Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16110-082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">17104-019</td>
			<td>Prepared according to manufactuer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">DNase I, RNase free (10,000 Units)</td>
			<td style="width:107px;">Roche</td>
			<td style="width:107px;">4716728001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">EBM-2</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC3156</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">EDTA, 0.5M Solution&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Hoefer</td>
			<td style="width:107px;">03-500-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">EGM2 SingleQuot, Bulletkit</td>
			<td style="width:107px;">Lonza</td>
			<td style="width:107px;">CC-4176</td>
			<td>For VEC media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:107px;">Hyclone</td>
			<td style="width:107px;">SH3007103IH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:107px;">14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Horse Serum</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">16050-130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Hybridization Oven</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:107px;">230301V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Medium 199 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">10-060-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Paraformaldehyde 16% Solution EM grade</td>
			<td style="width:107px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:107px;">15710</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Pen/Strep</td>
			<td style="width:107px;">MP-Biomed</td>
			<td style="width:107px;">ICN1670049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Permanox sterile chamber slide with cover</td>
			<td style="width:107px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:107px;">177429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">Phosphate-Buffered Saline, 1X</td>
			<td style="width:107px;">Corning Cell gro</td>
			<td style="width:107px;">21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:115px;">PrimeTime Mini qPCR Assay</td>
			<td style="width:107px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:107px;">Acta2 (&#945;SMA), GAPDH, Myh6, Myh7, POSTN, CD31, vWF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:115px;">StepOnePlus Real-Time PCR System</td>
			<td style="width:107px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:107px;">4376600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">SuperScript VILO Mastermix</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen LT</td>
			<td style="width:107px;">11755050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tie2-GFP mice</td>
			<td style="width:107px;">Jackson Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">3658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">Tissue forceps #5 11cm</td>
			<td style="width:107px;">Dumont</td>
			<td style="width:107px;">14096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:115px;">Trizol</td>
			<td style="width:107px;">Ambion</td>
			<td style="width:107px;">15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:115px;">&#945;-SMA anti-mouse antibody&#160;</td>
			<td style="width:107px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A2547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:115px;">VECTASHIELD HardSet Mounting Medium with DAPI</td>
			<td style="width:107px;">Vector Laboratories</td>
			<td style="width:107px;">H-1500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of murine valve endothelial cells

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and surrounded by a monolayer of valve endothelial cells (VECs). VECs play essential roles in establishing the valve structures during embryonic development, and are important for maintaining life-long valve integrity and function. In contrast to a continuous endothelium over the surface of healthy valve leaflets, VEC disruption is commonly observed in malfunctioning valves and is associated with pathological processes that promote valve disease and dysfunction. Despite the clinical relevance, focused studies determining the contribution of VECs to development and disease processes are limited. The isolation of VECs from animal models would allow for cell-specific experimentation. VECs have been isolated from large animal adult models but due to their small population size, fragileness, and lack of specific markers, no reports of VEC isolations in embryos or adult small animal models have been reported. Here we describe a novel method that allows for the direct isolation of VECs from mice at embryonic and adult stages. Utilizing the Tie2-GFP reporter model that labels all endothelial cells with Green Fluorescent Protein (GFP), we have been successful in isolating GFP-positive (and negative) cells from the semilunar and atrioventricular valve regions using fluorescence activated cell sorting (FACS). Isolated GFP-positive VECs are enriched for endothelial markers, including CD31 and von Willebrand Factor (vWF), and retain endothelial cell expression when cultured; while, GFP-negative cells exhibit molecular profiles and cell shapes consistent with VIC phenotypes. The ability to isolate embryonic and adult murine VECs allows for previously unattainable molecular and functional studies to be carried out on a specific valve cell population, which will greatly improve our understanding of valve development and disease mechanisms.

Tie2-GFP-Zellen co-lokalisiert mit Endothelzellmarkern in den embryonalen und adulten Herzklappen. Um die Spezifität der Tie2-GFP-Expression in VECs von embryonalen und erwachsenen Mäusen zu bestätigen, wurde Immunfluoreszenz durchgeführt, um die Co-Lokalisierung mit der endothelialen Zellmarker, CD31 in Gewebeschnitten von E14.5 und 3 Monate alten Erwachsenen Tie2-GFP vorbereitet bestimmen Mäuse mit Methoden zuvor von unserem Labor 16 veröffentlicht. Wie in Abbildung 1 dargestellt, VECs Co-express GFP (Abbildung 1 A, B, E, F) und CD31 (Abbildung 1 C, D, E, F) bei beiden Erwachsenen (Abbildung 1 B, D, F) und embryonalen ( Abbildung 1 A, C, E) Stufen, damit die Validierung unseres Modells für nachfolgende VEC Isolation. FACS-Analyse identifiziert deutliche GFP-positiven und GFP-negative Zellpopulationen in embryonalen und adulten Herzklappen aus Tie2-GFP Mäusen isoliert. Wild typ C57 / Bl6 Mäuse wurden verwendet, um GFP Parameter eingestellt und ca. 2% der Single-Wohnzellen aus Tie2-GFP-Mäuse zeigen eine deutliche Anreicherung in GFP-positiven Zellen durch FACS-Analyse sowohl in embryonalen und adulten Proben (Abbildung 2). Basierend auf in Abbildung 1 dargestellt Co-Lokalisationsstudien, werden diese Zellen als VECs und ergeben einen Durchschnitt von 61.800 Gesamt Zellen (Proben reichen von 39,000-77,000 Zellen / Probe) bei erwachsenen Proben (n = 3), und 8.928 Zellen (8,015- 11.000 Zellen / Wurf) von einem Wurf von E14.5 Embryonen. PCR-Analyse bestätigt Anreicherung Endothelzellmarkern in GFP-positiver Zellen und der Ventil interstitiellen Zellmarkern in GFP-negativen Zellen von Tie2-GFP-Mäuse isoliert. Genexpressionsanalyse von GFP positiven und negativen Zellpopulationen durch qPCR folgenden FACS zeigen unterschiedliche molekulare Profile. Im Vergleich zu GFP negativen Zellpopulationen aus Tie2-GFP Embryonen und adul isoliertts, sind GFP-positiven Zellen für die Expression von endothelialer Zellmarker CD31 und vWF (Figur 3) angereichert. Weiterhin ist die Expression von Myozyten-Marker (Myh6, MYH7) in diesen Zellpopulationen sehr gering, was zeigt, minimale Kontamination der Nicht Endothelzellen. Im Gegensatz dazu sind GFP-negativen Zellen aus adulten Tie2-GFP-Mäuse und E14.5 Embryonen isoliert Ventilzwischenzelle (VIC) Marker, α-SMA und Periostin (POSTN) relativ zu GFP-positiven Zellen angereichert. Anreicherung dieser Marker ist in GFP-negativen Zellen von E14.5-Proben isoliert Vergleich zu Erwachsenen höher aufgrund der ruhenden Phänotyp der Erwachsenen VICs und daher geringe Expression von aktivierten Marker. GFP-positive Zellen von Tie2-GFP erwachsenen Mäusen isoliert, können in vitro kultiviert werden. Die Fähigkeit, Kultur GFP positiven und GFP-negativen Zellen aus adulten Proben isoliert wurde Basis untersuchtd auf die Zellmorphologie und immunhistochemischen Färbung. Unter Verwendung der zuvor von uns 17 beschrieben zeigen wir in Abbildung 4, dass GFP-positiven Zellen erscheinen Runde in der Morphologie (Abbildung 4A) und Co-express GFP mit der endothelialen Zellmarker CD31 nach zwei Wochen in Kultur (4C)-Protokolle. Im Gegensatz dazu sind nicht-Endothelzellen negativ für GFP, zeigen einen mesenchymalen förmige Morphologie (4B) und drücken die VIC-Marker α-SMA nach neun Tagen (4D). <img alt="Figur 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" width="400" /> Abbildung 1. Tie2-GFP-positiven Zellen Co-Lokalisation mit CD31 in embryonalen und adulten Herzklappen. Immunfluoreszenz um die Assoziation (Tie2-) GFP-Expression (A, B) mit dem Endothel-Zellmarker zeigen, CD31 (C, D) in die septal Flugblätter der Mitralklappe bei E14.5 (A, C, E) und Erwachsenen (B, D, F) Stufen. Die Ventilbereich in einem hervorgehobenen, C, E. (E, F) fusioniert Bilder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig1highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" width="500" /> Abbildung 2. Tie2-GFP-positiven VECs kann durch FACS identifiziert werden. Vergleich zu gleichaltrigen C57 / Bl6 Kontrollen (A, C), Ventile aus Tie2-GFP Embryonen (B) und Erwachsene (D) isoliert enthalten eine deutliche GFP positive Zellpopulation, wie in grün angezeigt. GFP-negativen Ereignisse, rot dargestellt wurden als Kontrolle gesammelt. Zahlen in (B) und (D) zeigen die durchschnittlichen% der GFP-positive Zellen aus der Gesamtzahl der Veranstaltungen, sortiert nach FACS (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig2highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" width="500" /> Abbildung 3. GFP-positive Zellen für Endothelzellmarkern angereichert wohin GFP-negativen Zellen exprimieren Gene mit Ventilzwischenzellen zugeordnet. Repräsentative qPCR endothelialer Zellmarker (CD31, von Willebrand Faktor (vWF)) und Erwachsenen (Myh6) und fetalen ( MYH7) myocyte Marker in GFP-positiven Zellen von Herzklappen Regionen E14.5 (A) und Erwachsenen (B isoliert) Tie2-GFP-Mäusen. Note Anreicherung Endothelzellmarkern und sehr geringe Mengen an Myozyten-assoziierten Genen. (C, D) Falten changes in der Expression von Ventil interstitielle Zellmarker α-SMA und Postn in isolierten GFP-negativen Zellen aus E14.5 (C) und Erwachsenen (D) Tie2-GFP-Mäusen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51860/51860fig3highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51860/51860fig4highres.jpg" width="500" /> Abbildung 4. Tie2-GFP-positiven Zellen zu erhalten Expression der endothelialen Zellmarker in vitro. Nach FACS, GFP positive (A, C) und negativen (B, D) Zellpopulationen aus erwachsenen Mäusen wurden bis zur Konfluenz kultiviert und nach Kontrastbildgebung Phase (A, B) und Fluoreszenz-Immunfärbung (C, D). GFP-positive Zellen exprimieren CD31 (rot) (C) nach10 Tagen Kultur. Im Gegensatz dazu wurde die GFP-Expression nicht in der negativen Zellpopulation, die für α-SMA, einem Marker für aktivierte VICs (D) positiv gefärbt erkannt.

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Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Isolierung von murinen Ventil Endothelzellen

Normal valve structures consist of stratified layers of specialized extracellular matrix (ECM) interspersed with valve interstitial cells (VICs) and ...

isolation-of-murine-valve-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Aufrufe.  The Ohio State University. The ability to isolate heart valve endothelial cells (VECs) is critical for understanding mechanisms of valve development, maintenance, and disease. Here we describe the isolation of VECs from embryonic and adult Tie2-GFP mice using FACS that will allow for studies determining the contribution of VECs in developmental and disease processes.

Serie: Isolation of Murine Valve Endothelial Cells

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps include: degradation of the basement membrane, proliferation and migration (sprouting) of endothelial cells (EC) into the extracellular matrix, alignment of EC into cords, lumen formation, anastomosis, and formation of a new basement membrane. Many in vitro assays have been developed to study this process, but most only mimic certain stages of angiogenesis, and morphologically the vessels often do not resemble vessels in vivo. Here we demonstrate an optimized in vitro angiogenesis assay that utilizes human umbilical vein EC and fibroblasts. This model recapitulates all of the key early stages of angiogenesis, and importantly the vessels display patent intercellular lumens surrounded by polarized EC. Vessels can be easily observed by phase-contrast and time-lapse microscopy, and recovered in pure form for downstream applications.

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells HUVEC

This video protocol illustrates the isolation and culture of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) from human umbilical cord. Once isolated these cells can be used for in vitro angiogenesis assays like the Optimized Fibrin Gel Bead Assay also demonstrated by the Hughes lab.

Isolierung humaner Nabelschnur-Endothelzellen (HUVEC)

Angiogenesis is a complex multi-step process, where in response to angiogenic stimuli, new vessels are created from the existing vasculature. These steps ...

Forschung

Biologie

Isolation of Valvular Endothelial Cells

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system. These thin, fibrous tissues are subjected to significant mechanical stresses as they open and close several billion times over a lifespan. The incredible endurance of these tissues is due to the resident valvular endothelial (VEC) and interstitial cells (VIC) that constantly repair and remodel in response to local mechanical and biological signals. Only recently have we begun to understand the unique behaviors of these cells, for which in vitro experimentation has played a key role. Particularly challenging is the isolation and culture of VEC. Special care must be used from the moment the tissue is removed from the host through final plating. Here we present protocols for direct isolation, side specific isolation, culture, and verification of pure populations of VEC. We use enzymatic digestion followed by a gentle swab scraping technique to dislodge only surface cells. These cells are then collected into a tube and centrifuged into a pellet. The pellet is then resuspended and plated into culture flasks pre-coated with collagen I matrix. VEC phenotype is confirmed by contact inhibited growth and the expression of endothelial specific markers such as PECAM1 (CD31), Von Willebrand Factor (vWF), and negative expression of alpha-smooth muscle actin (&alpha;-SMA). The functional characteristics of VEC are associated with high levels of acetylated LDL. Unlike vascular endothelial cells, VEC have the unique capacity to transform into mesenchyme, which normally occurs during embryonic valve formation1. This can also occur during significantly prolonged post confluent in vitro culture, so care should be made to passage at or near confluence. After VEC isolation, pure populations of VIC can then be easily acquired.

We provide a method for isolating and culturing pure populations of heart valve endothelial cells (VEC). VEC can be isolated from either side of the cusp or leaflet and immediately following, underlying interstitial cell (VIC) isolation is straightforward.

Isolierung von Valvular Endothelzellen

Heart valves are solely responsible for maintaining unidirectional blood flow through the cardiovascular system.  These thin, fibrous tissues are ...

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) have shown to be convenient, easy to obtain and culture, and thus are the most widely studied endothelial cells. However, for research focused on processes like angiogenesis, permeability or many others, microvascular endothelial cells (ECs) are a much more physiologically relevant model to study 2. Furthermore, ECs isolated from knockout mice provide a useful tool for analysis of protein function ex vivo. Several approaches to isolate and culture microvascular ECs of different origin have been reported to date 3-7, but consistent isolation and culture of pure ECs is still a major technical problem in many laboratories. Here, we provide a step-by-step protocol on a reliable and relatively simple method of isolating and culturing mouse lung endothelial cells (MLECs). In this approach, lung tissue obtained from 6- to 8-day old pups is first cut into pieces, digested with collagenase/dispase (C/D) solution and dispersed mechanically into single-cell suspension. MLECS are purified from cell suspension using positive selection with anti-PECAM-1 antibody conjugated to Dynabeads using a Magnetic Particle Concentrator (MPC). Such purified cells are cultured on gelatin-coated tissue culture (TC) dishes until they become confluent. At that point, cells are further purified using Dynabeads coupled to anti-ICAM-2 antibody. MLECs obtained with this protocol exhibit a cobblestone phenotype, as visualized by phase-contrast light microscopy, and their endothelial phenotype has been confirmed using FACS analysis with anti-VE-cadherin 8 and anti-VEGFR2 9 antibodies and immunofluorescent staining of VE-cadherin. In our hands, this two-step isolation procedure consistently and reliably yields a pure population of MLECs, which can be further cultured. This method will enable researchers to take advantage of the growing number of knockout and transgenic mice to directly correlate in vivo studies with results of in vitro experiments performed on isolated MLECs and thus help to reveal molecular mechanisms of vascular phenotypes observed in vivo.

Here, we describe a protocol for isolation and culture of murine pulmonary endothelial cells. This method comprises mechanic and enzymatic lung tissue dissociation as well as a 2-step purification process using anti-PECAM-1 and anti-ICAM-2 antibodies conjugated to magnetic beads, which produces a pure endothelial cell population of mostly microvascular origin.

Isolierung und Kultivierung von pulmonaler Endothelzellen aus neugeborenen Mäusen

Endothelial cells provide a useful research model in many areas of vascular biology. Since its first isolation 1, human umbilical vein endothelial cells ...

Isolation of Embryonic Ventricular Endothelial Cells

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines offer significant advantages for their ease of use, these cell lines are unavailable for all potential cell types. By isolating primary cells from a specific region of interest, particularly from a transgenic mouse, more nuanced studies can be performed. The basic technique involves dissecting the organ or partial organ of interest (e.g. the heart or a specific region of the heart) and dissociating the organ to single cells. These cells are then incubated with magnetic beads conjugated to an antibody that recognizes the cell type of interest. The cells of interest can then be isolated with the use of a magnet, with a short trypsin incubation dissociating the cells from the beads. These isolated cells can then be cultured and analyzed as desired. This technique was originally designed for adult mouse organs but can be easily scaled down for use with embryonic organs, as demonstrated herein. Because our interest is in the developing coronary vasculature, we wanted to study this population of cells during specific embryonic stages. Thus, the original protocol had to be modified to be compatible with the small size of the embryonic ventricles and the low potential yield of endothelial cells at these developmental stages. Utilizing this scaled-down approach, we have assessed coronary plexus remodeling in transgenic embryonic ventricular endothelial cells.

Primary cell culture is a useful technique for analyzing specific populations of cells, particularly from transgenic mouse embryos at specific developmental stages. Herein, embryonic ventricles are dissected and dissociated, and antibody-conjugated beads recognize and separate out the endothelial cells for further analysis.

Isolierung von embryonalen ventrikuläre Endothelzellen

Cell culture has greatly enhanced our ability to assess individual populations of cells under myriad culture conditions. While immortalized cell lines ...

Isolation and Primary Culture of Mouse Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an important model for cardiovascular disease research. This study demonstrates a simple method to isolate and culture endothelial cells from the mouse aorta without any special equipment. To isolate endothelial cells, the thoracic aorta is quickly removed from the mouse body, and the attached adipose tissue and connective tissue are removed from the aorta. The aorta is cut into 1 mm rings. Each aortic ring is opened and seeded onto a growth factor reduced matrix with the endothelium facing down. The segments are cultured in endothelial cell growth medium for about 4 days. The endothelial sprouting starts as early as day 2. The segments are then removed and the cells are cultured continually until they reach confluence. The endothelial cells are harvested using neutral proteinase and cultured in endothelial cell growth medium for another two passages before being used for experiments. Immunofluorescence staining indicated that after the second passage the majority of cells were double positive for Dil-ac-LDL uptake, Lectin binding, and CD31 staining, the typical characteristics of endothelial cells. It is suggested that cells at the second to third passages are suitable for in vitro and in vivo experiments to study the endothelial biology. Our protocol provides an effective means of identifying specific cellular and molecular mechanisms in endothelial cell physiopathology.

The vascular endothelial cells play a significant role in many important cardiovascular disorders. This article describes a simple method to isolate and expand endothelial cells from the mouse aorta without using any special equipment. Our protocol provides an effective means of identifying mechanisms in endothelial cell physiopathology.

Isolation und Primärkultur von Maus Aortic Endothelial Cells

The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. The mouse is an ...

Isolation of Mouse Coronary Endothelial Cells

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new vascular formation. Endothelial cell dysfunction is implicated in the development and progression of many cardiovascular diseases including ischemic heart disease. To examine the function and characterization of coronary endothelial cells, cell isolation is the first step and it requires high purity and quantity to conduct subsequent experiments. This protocol describes an efficient method to isolate adult mouse coronary endothelial cells. The mouse heart is dissected and minced into small pieces. After the digestion of the heart using dispase and collagenase II, cells are washed&#160;and incubated with magnetic beads which are conjugated with anti-CD31 antibody. The beads with endothelial cells are washed several times and are ready to use in various applications, including imaging and molecular biological experiments. Efficient isolation yields approximately 104 cells per one heart with over 90% purity.

This protocol is prepared to share our method of isolating mouse coronary endothelial cells for the purpose of imaging or to conduct molecular biological experiments.

Isolierung von Maus-Koronar-Endothelzellen

Endothelial cells line the inner wall of blood vessels and play an important role in the regulation of vascular tone, vascular permeability, and new ...

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) play an important role in the calcification process in aortic stenosis through the activation of their dedifferentiation program to osteoblast-like cells. Mouse VICs are a good in vitro tool for the elucidation of the signaling pathways driving the mineralization of the aortic valve cell. The method described herein, successfully used by these authors, explains how to obtain freshly isolated cells. A two-step collagenase procedure was performed with 1 mg/mL and 4.5 mg/mL. The first step is crucial to remove the endothelial cell layer and avoid any contamination. The second collagenase incubation is to facilitate the migration of VICs from the tissue to the plate. In addition, an immunofluorescence staining procedure for the phenotype characterization of the isolated mouse valve cells is discussed. Furthermore, the calcification assay was performed in vitro by using the calcium reagent measurement procedure and alizarin red staining. The use of mouse valve cell primary culture is essential for testing new pharmacological targets to inhibit cell mineralization in vitro.

Isolation of Mouse Interstitial Valve Cells to Study the Calcification of the Aortic Valve In Vitro

This article describes the isolation of mouse aortic valve cells by a two-step collagenase procedure. Isolated mouse valve cells are important for performing different assays, such as this in vitro calcification assay, and for investigating the molecular pathways leading to aortic valve mineralization.

Isolierung von interstitiellen Klappenzellen der Maus zur Untersuchung der Verkalkung der Aortenklappe in vitro

The calcification of aortic valve cells is the hallmark of aortic stenosis and is associated with valve cusp fibrosis. Valve interstitial cells (VICs) ...

Isolation of Human Primary Valve Cells for In vitro Disease Modeling

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve causes aortic stenosis and contributes to heart failure and stroke. Disease pathogenesis is multifactorial, and stresses such as inflammation, extracellular matrix remodeling, turbulent flow, and mechanical stress and strain contribute to the osteogenic differentiation of valve endothelial and valve interstitial cells. However, the precise initiating factors that drive the osteogenic transition of a healthy cell into a calcifying cell are not fully defined. Further, the only current therapy for CAVD-induced aortic stenosis is aortic valve replacement, whereby the native valve is removed (surgical aortic valve replacement, SAVR) or a fully collapsible replacement valve is inserted via a catheter (transcatheter aortic valve replacement, TAVR). These surgical procedures come at a high cost and with serious risks; thus, identifying novel therapeutic targets for drug discovery is imperative. To that end, the present study develops a workflow where surgically removed tissues from patients and donor cadaver tissues are used to create patient-specific primary lines of valvular cells for in vitro disease modeling. This protocol introduces the utilization of a cold storage solution, commonly utilized in organ transplant, to reduce the damage caused by the often-lengthy procurement time between tissue excision and laboratory processing with the benefit of greatly stabilizing cells of the excised tissue. The results of the present study demonstrate that isolated valve cells retain their proliferative capacity and endothelial and interstitial phenotypes in culture upwards of several days after valve removal from the donor. Using these materials allows for the collection of control and CAVD cells, from which both control and disease cell lines are established.

This protocol describes the collection of human aortic valves extracted during surgical aortic valve replacement procedures or from cadaveric tissue, and the subsequent isolation, expansion, and characterization of patient specific primary valve endothelial and interstitial cells. Included are important details regarding the processes needed to ensure cell viability and phenotype specificity.

Isolierung humaner primärer Klappenzellen für die In-vitro-Krankheitsmodellierung

Calcific aortic valve disease (CAVD) is present in nearly a third of the elderly population. Thickening, stiffening, and calcification of the aortic valve ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolierung und Charakterisierung von primären Leber-Sinus-Endothelzellen der Maus

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Isolierung von Endothelzellen aus dermalen Lymphkapillaren der Maus

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic endothelial cells is an important process for lymphatic research, as it allows the performance of in vitro and biochemical experiments on the isolated cells. Moreover, the development of Cre-lox technology has enabled the tissue-specific deficiency of genes that cannot be globally targeted, leading to the precise determination of their role in the studied tissues. The dissection of the role of certain genes in lymphatic physiology and pathophysiology requires the use of lymphatic-specific promoters, and thus, the experimental verification of the expression levels of the targeted genes.
Methods for efficient isolation of lymphatic endothelial cells from wild-type or transgenic mice enable the use of ex vivo and in vitro assays to study the mechanisms regulating the lymphatic functions and the identification of the expression levels of the studied proteins. We have developed, standardized and present a protocol for the efficient isolation of murine dermal lymphatic endothelial cells (DLECs) via magnetic bead purification based on LYVE-1 expression. The protocol outlined aims to equip researchers with a tool to further understand and elucidate important players of lymphatic endothelial cell functions, especially in facilities where fluorescence-activated cell sorting equipment is not available.

Autor im Rampenlicht: Magnetische Bead-basierte Isolierung von murinen dermalen lymphatischen Endothelzellen

This paper describes a method for magnetic bead-based isolation of murine endothelial cells from dermal lymphatic capillaries. The isolated lymphatic endothelial cells can be used for downstream in vitro experiments and protein expression analysis.

Isolierung von dermalen lymphatischen Endothelzellen der Maus

The lymphatic system participates in the regulation of immune surveillance, lipid absorption, and tissue fluid balance. The isolation of murine lymphatic ...