Diese Arbeit wurde von Research finanziert, um Blindheit und National Institutes of Health Zuschuss EY10542 verhindern.

1. Retinal Slices Vorbereitung <ol><li> Montieren Sie die Kammer (Design in Abbildung 1 dargestellt). Platz zwei Perlen aus Vakuumfett, Abstand ~ 8-10 mm auseinander, über die Aufnahme Kammer um einen Kanal für Superfusat bilden und in denen die Netzhaut Scheiben einzubetten. Fügen Sie eine zweite Wulst von Fett ein paar Millimeter weiter draußen jenseits jeder dieser beiden Perlen von Fett als Damm und Spillover-Grenze handeln. Setzen Sie einen kleinen dreieckigen Stück Kimwipe am Ende der Kammer, um Flüssigkeit Kontakt mit der Referenz-Elektrode zu gewährleisten. </li><li> Drücken Sie ein Stück Nitrozellulosemembran (~ 5 x 10 mm; 0,8 um Poren) flach auf dem Objektträger in zwei kleine Perlen aus Vakuumfett. Vermeiden Sie Fett direkt unter dem Zentrum der Nitrocellulosemembran, da dies die Netzhaut anhaften können. </li><li> Um das Gewebe Schneidemaschine vorzubereiten, brechen sie ein Double Edge Rasierklinge in 4 Stücke und bringen einen zum Schneiden Arm. Schneiden Sie eine dünne Scheibe nitrocellulOse Membran, um sicherzustellen, daß die Schneidkante der Rasierklinge flach liegt gegen die Aufnahmekammer und schneidet daher sauber durch die Nitrocellulosemembran. </li><li> Halten Sie ein kleines Becherglas von Amphibien Salzlösung (Tabelle 1) auf Eis bei der Präparation entfernt. </li><li> Euthanize Salamander durch Enthauptung. Hemisect den Kopf sagittal und Mark durch das Rückenmark. Die Hälfte des Kopfes auf einem Stück Baumwolle befeuchtet mit Amphibien Kochsalzlösung auf einem Linoleum-Block. Die andere Hälfte des Kopfes kann mit einem feuchten Papiertuch gewickelt werden und bei 4 ° C für die spätere Verwendung in den Tag. </li><li> Enucleate das Auge. Mit kleinen Vannas Schere, schneiden Sie die Haut verbindet den Blick auf die umliegenden Umlaufbahn. Nach der Befreiung der vor dem Auge aus dem umgebenden Gewebe Orbital, ziehen das Auge nach vorne und schieben Sie die Schere unter dem Auge, um durch die Augenmuskeln und Sehnerv geschnitten, befreien das Auge von der Umlaufbahn. </li><li> Legen Sie die entkernte Auge auf einem Bett aus Baumwolle auf derLinoleum Block. Entsorgen Sie den halben Kopf. Überschüssiges Augenhöhlenfett von der Rückseite des Auges. </li><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Mitte der Hornhaut mit einem scharfen Skalpell. Entfernen Sie die Hornhaut, indem feine Vannas Schere in den Einschnitt und sich den Schnitt radial in Richtung der ora serrata. Schneiden am Umfang um den ora serrata durch Drehen des Linoleum Block oder die Baumwolle zwischen den Schnitten. </li><li> Nach dem Schneiden den ganzen Weg um das Auge, entfernen Sie die Hornhaut und Linse, indem sie aus der Seite der Augenmuschel. Bewegen Sie den resultierenden Augenmuschel auf eine harte Oberfläche des Linoleum Block angefeuchtet mit Amphibien Kochsalzlösung. Schneiden Sie es in Drittel mit einer scharfen Rasierklinge, mit einer feinen Säge Bewegung, um sicherzustellen, dass Sie alle den Weg durch die Lederhaut geschnitten. </li><li> Legen Sie ein oder zwei Stücke von Augenmuschel auf der Nitrozellulosemembran mit dem Retina-Oberfläche nach unten zeigt. Tauchen Sie die restlichen Stücke mit zusätzlichen Kochsalzlösung und legen Sie sie im Kühlschrank bei 4 ° C ~ </li><li> Gently drücken das Stück Augenmuschel gegen die Nitrozellulosemembran mit feinen Pinzette. Tauchen Sie die Nitrocellulosemembran und Augenmuschel Stück mit einigen Tropfen kalten Kochsalzlösung und Amphibien Blot an den Rändern mit Kimwipe um die Netzhaut zu halten. Erneut tauchen die Augenmuschel und Nitrozellulosemembran mit einigen Tropfen kalt Amphibien Kochsalzlösung und abziehen der Lederhaut / Aderhaut / Netzhautpigmentepithel um die Netzhaut zu isolieren (die rosa erscheinen können aufgrund des Vorhandenseins von rohen Rhodopsin). Falls erforderlich, den Sehnerv, die Netzhaut zu befreien. </li><li> Wenn die Netzhaut nicht eingehalten hat dicht, abfließen die Kochsalzlösung mit einem Kimwipe um die Netzhaut stärker nach unten ziehen auf die Nitrozellulosemembran. Ersetzen Sie die Kochsalzlösung. Wiederholen, falls erforderlich. </li><li> Füllen Sie die Kammer mit kaltem Amphibien Kochsalzlösung und überträgt es auf der Bühne des Gewebes Schneidemaschine. Schneiden Sie die Netzhaut und Nitrozellulosemembran in dünne Streifen, die Arbeit von einem Ende zum anderen durch Drehen des Noniusmikrometerin 125 Schritten um. Drücken Sie die Rasierklinge sanft, aber bestimmt durch die Netzhaut und Nitrozellulosemembran. </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut Scheiben, indem Streifen Nitrozellulosemembran zum Hauptkanal der Aufnahme Kammer. Heben Sie einen Streifen von Membran frei und dann halten Sie es fest, während sie sich die Kammer darunter, dass auf jeden Fall halten die Scheiben unter Wasser. Integrieren Sie die Kanten der Nitrozellulosemembran in den Streifen von Vakuumfett, dreht sie um 90 Grad nach Netzhautschichten anzuzeigen. </li><li> Drücken Sie die Nitrozellulosemembran flach an der Glasoberfläche. Auch wenn es nicht auf jedem Stück Netzhaut, Ort Streifen Nitrozellulosemembran in regelmäßigen Abständen (ca. 1 mm Abstand) entlang der gesamten Länge der Perfusion Kanal zu helfen, brechen die Oberflächenspannung und verbessern Strömung. </li></ol> 2. Gepaart Ganzzellableitungen <ol><li> Nachdem alle Scheiben übertragen worden sind, bewegen Sie die Aufnahme Kammer auf die Bühne eines aufrechten, festenStage-Mikroskop und bringen Sie die Referenz-Elektrode führen. Konzentrieren Sie sich auf den Scheiben mit einem langen Arbeitsabstand, Eintauchen in Wasser, 40-60X Ziel. Das Mikroskop sollte auf Lufttisch zur Schwingungsdämpfung angeordnet und eingeschlossen in einem Faradayschen Käfig um eine elektrische Störung zu verringern. </li><li> Superfuse die Scheiben kontinuierlich mit einer Geschwindigkeit von 1 ml / min mit Amphibien Kochsalzlösung mit 100% O 2 geleitet. Verbinden Sie die Saug-, dafür zu sorgen, dass die Zu-und Abfluss ausgeglichen sind. Abfluss durch Drehen des abgeschrägten Ende der Vakuum-Nadel oder durch Bewegen des Kimwipe am Ende der Kammer näher oder weiter weg von dem Abfluss Nadel geregelt werden. Die Zubereitung kann bei Raumtemperatur gehalten oder abgekühlt werden mit einer Peltier-Vorrichtung oder durch einfaches Einstellen einer Packung Eis auf dem Mikroskoptisch. </li><li> Untersuchen Scheiben unter dim oder Infrarot-Licht und identifizieren ein Paar von Zellen - ein Photorezeptor (Stab oder Kegel) und in der Nähe horizontal oder bipolaren Zellen - bis Ziel für whole-cell recording. Rods kann identified durch ihre großen Zellkörper und prominente stabförmigen äußeren Segmente (2A). Cones sind kleiner als Stangen und haben kleine konische äußere Segmente. Bipolare Zelle und horizontalen Zelle somas sind in der äußersten Reihe von Zellen in dem Körper innere Körnerschicht (INL, 2B und 2C). </li><li> Vor der Herstellung Scheiben, mit einer Pipette Abzieher Pipetten aus Borosilikatglas (1,2 mm Außendurchmesser, 0,95 mm Innendurchmesser mit einem Glas Filament) herzustellen. Die Spitze jedes Mikropipette sollte ~ 1-2 Mikrometer im Durchmesser. </li><li> Die Verwendung eines nicht-metallischen Füllung Nadel (z. B. ein aus einer 1-ml-Spritze oder einer Mikrofiltration hergestellt), füllen Pipetten mit der intrazellulären Lösung (Tabelle 1) und heften sich an dem Elektrodenhalter. </li><li> Elevate das Mikroskop-Objektiv leicht. Positionieren Sie den Photorezeptor Pipette unter dem Ziel und dann senken Sie es so, dass die Spitze knapp oberhalb der Scheiben positioniert ist. Wiederholen Sie mit ter zweite Pipette. </li><li> Stellen Sie einem in der Baseline aktuellen Pegel am Verstärker-Offset. Überprüfen Sie die Pipette mit einem Widerstand 5-10 mV depolarisierenden Puls. Wir verwenden in der Regel, dass Pipetten Bereich 10-15 MOhm, das Ergebnis der Langkegel der Welle und niedrige Osmolarität der Amphibien Pipettenlösungen. Bei höheren Säugetieren Osmolarität Lösungen weisen diese gleichen Pipetten Widerstandswerte von ~ 8-12 MOhm. Während wir größere Spitzendurchmessern mit Widerstandswerte von 3-4 MOhm in Amphibien-Lösungen eingesetzt haben, werden die Vorteile durch einen geringeren Zugang Widerstand vorgesehen durch eine größere Schwierigkeiten bei der Abdichtung auf Zellmembranen und einer schnelleren Überblick über Kalzium-Ströme und andere second messenger Offset -sensitive Antworten. </li><li> Während der Anwendung leichter Überdruck, positionieren Sie den postsynaptischen Pipette so daß es die horizontale oder bipolar Zellkörper. Dann positionieren präsynaptischen Pipette so daß es die Zellkörper einer Stange oder eines Kegels Photorezeptor. Recordings appear stabiler zu sein, wenn Pipettenspitzen kontaktieren Sie das innere Segment anstelle der soma, besonders in Zapfen. </li><li> Während die Überwachung der Widerstand, lassen Sie die positiven Druck auf die postsynaptischen Pipette. Manchmal ist die Freisetzung von positiven Druck, der ausreicht, um eine Giga-Ohm-Dichtung zu bilden. Falls nicht, gelten sanfte Saugwirkung mit einer 1 ml Spritze oder durch den Mund. Nachdem die Spitze Widerstand&gt; 100 gewachsen MOhm, gelten einem Haltepotential von -60 mV. Nach Erhalt einer Gigaohm Dichtung, null heraus keine Pipette Kapazität Transienten und wiederholen Sie den Vorgang für die Abdichtung Photorezeptor Pipette Anlegen einer Haltepotential von -70 mV. </li><li> Rupture der Patch mit Ihrem Mund oder eine Spritze zum Saugen zu jeder Zelle wiederum gelten. Rods, Kegel und bipolaren Zellen typischerweise Bruch mit sanften Sog. Beziehen whole-cell-Konfiguration mit einem horizontalen Speicherzellen eine größere Saugwirkung (dh mit einer 3-ml-Spritze) in Kombination mit stark praktischen Spannungsimpulse mit dem &quot;zap&quot; f gelieferteneature der Patch-Clamp-Verstärker. Reißen der Membran und Etablierung von Ganzzell-Konfiguration wird durch das Auftreten von Ganzzell-Kapazität Transienten offensichtlich. </li><li> Bestätigen Identität des postsynaptischen Zelle physiologisch durch Anlegen eines Lichtblitz und liefert eine Reihe von Schritten Spannung von -120 bis +40 mV in 20 mV-Schritten (Abbildungen 3 und 4). </li><li> Um zu beurteilen, wenn das Paar von Zellen synaptisch verbunden sind, liefern eine kurze (25-100 ms), 60 mV Depolarisation Schritt auf den Photorezeptor (bis -10 mV, in der Nähe der Spitze der L-Typ spannungsabhängigen Calcium-Strom) und schauen für postsynaptischen Ströme in der zweiten Ordnung Neuron (Abbildung 5). Eine starke depolarisierenden Schritt sollte eine schnelle, transiente innen postsynaptischen Strom in der post-synaptischen horizontal oder OFF bipolaren Zelle durch ein Platzen der Vesikel-Freisetzung aus dem Konus (Abbildung 5) verursacht zu evozieren. </li></ol>

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	<li>Ram&#242;n y Cajal, S., Thorpe, S. A., Glickstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Structure of the Retina. , (1972).</li><li>Piccolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cajal+and+the+retina:+a+100-year+retrospective.">Cajal and the retina: a 100-year retrospective.</a> Trends Neurosci. 11, 521-525 (1998).</li><li>Hartline, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+response+of+single+optic+nerve+fibers+of+the+vertebrate+eye+to+illumination+of+the+retina.">The response of single optic nerve fibers of the vertebrate eye to illumination of the retina.</a> Am. J. Physiol. 121, 400-415 (1938).</li><li>Kuffler, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discharge+patterns+and+functional+organization+of+mammalian+retina.">Discharge patterns and functional organization of mammalian retina.</a> J. Neurophysiol. 16, 37-68 (1953).</li><li>Werblin, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+along+and+between+rods+in+the+riger+salamander+retina.">Transmission along and between rods in the riger salamander retina.</a> J. Physiol. 280, 449-470 (1978).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connections+between+neurons+in+living+slices+of+the+larval+tiger+salamander+retina.">Synaptic connections between neurons in living slices of the larval tiger salamander retina.</a> J. Neurosci. Meth. 20, 139-149 (1987).</li><li>Heidelberger, R., Thoreson, W. B., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+transmission+at+retinal+ribbon+synapses.">Synaptic transmission at retinal ribbon synapses.</a> Prog. Retin. Eye Res. 24, 682-720 (2005).</li><li>Schmitz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+making+of+synaptic+ribbons:+how+they+are+built+and+what+they+do.">The making of synaptic ribbons: how they are built and what they do.</a> Neuroscientist. 15, 611-624 (2009).</li><li>Morgans, C. W., Brown, R. L., Duvoisin, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRPM1:+the+endpoint+of+the+mGluR6+signal+transduction+cascade+in+retinal+ON-bipolar+cells.">TRPM1: the endpoint of the mGluR6 signal transduction cascade in retinal ON-bipolar cells.</a> Bioessays. 32, 609-614 (2010).</li><li>Bartoletti, T. M., Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+pool+size+at+the+salamander+cone+ribbon+synapse.">Vesicle pool size at the salamander cone ribbon synapse.</a> J. Neurophysiol. 103, 419-423 (2010).</li><li>Kim, M. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis. Exp. (59), e3345 (2012).</li><li>Wang, J. S., Estevez, M. E., Cornwall, M. C., Kefalov, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-retinal+visual+cycle+required+for+rapid+and+complete+cone+dark+adaptation.">Intra-retinal visual cycle required for rapid and complete cone dark adaptation.</a> Nat. Neurosci. 12, 295-302 (2009).</li><li>Thoreson, W. B., Tranchina, D., Witkovsky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+synaptic+transfer+from+rods+and+cones+to+horizontal+cells+in+the+salamander+retina.">Kinetics of synaptic transfer from rods and cones to horizontal cells in the salamander retina.</a> Neuroscience. 122, 785-798 (2003).</li><li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+organization+of+the+vertebrate+retina:+general+principles+and+species-specific+variations:+the+Friedenwald+lecture.">Synaptic organization of the vertebrate retina: general principles and species-specific variations: the Friedenwald lecture.</a> Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 1263-1274 (2010).</li><li>Babai, N., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Horizontal+cell+feedback+regulates+calcium+currents+and+intracellular+calcium+levels+in+rod+photoreceptors+of+salamander+and+mouse+retina.">Horizontal cell feedback regulates calcium currents and intracellular calcium levels in rod photoreceptors of salamander and mouse retina.</a> J. Physiol. 587, 2353-2364 (2009).</li><li>Babai, N., Morgans, C. W., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+contributes+to+synaptic+release+from+mouse+rod+photoreceptors.">Calcium-induced calcium release contributes to synaptic release from mouse rod photoreceptors.</a> Neuroscience. 165, 1447-1456 (2010).</li><li>Thoreson, W. B., Burkhardt, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrast+encoding+in+retinal+bipolar+cells:+current+vs.+voltage.">Contrast encoding in retinal bipolar cells: current vs. voltage.</a> Vis. Neurosci. 20, 19-28 (2003).</li><li>Thoreson, W. B., Bryson, E. J., Rabl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reciprocal+interactions+between+calcium+and+chloride+in+rod+photoreceptors.">Reciprocal interactions between calcium and chloride in rod photoreceptors.</a> J. Neurophysiol. 90, 1747-1753 (2003).</li><li>Cadetti, L., Bryson, E. J., Ciccone, C. A., Rabl, K., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-induced+calcium+release+in+rod+photoreceptor+terminals+boosts+synaptic+transmission+during+maintained+depolarization.">Calcium-induced calcium release in rod photoreceptor terminals boosts synaptic transmission during maintained depolarization.</a> Eur. J. Neurosci. 23, 2983-2990 (2006).</li><li>Luo, J., Boosalis, B. J., Thoreson, W. B., Margalit, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+optical+and+electrophysiological+methods+for+recording+retinal+ganglion+cells+during+electrical+stimulation.">A comparison of optical and electrophysiological methods for recording retinal ganglion cells during electrical stimulation.</a> Curr. Eye Res. 37, 218-227 (2012).</li><li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell.">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li><li>Snellman, J., Mehta, B., Babai, N., Bartoletti, T. M., Akmentin, W., Francis, A., Matthews, G., Thoreson, W. B., Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+destruction+of+the+synaptic+ribbon+reveals+a+role+for+the+ribbon+in+vesicle+priming.">Acute destruction of the synaptic ribbon reveals a role for the ribbon in vesicle priming.</a> Nat. Neurosci. 14, 1135-1141 (2011).</li><li>Mercer, A. J., Chen, M., Thoreson, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+mobility+of+presynaptic+L-type+calcium+channels+at+photoreceptor+ribbon+synapses.">Lateral mobility of presynaptic L-type calcium channels at photoreceptor ribbon synapses.</a> J. Neurosci. 31, 4397-4406 (2011).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die Netzhaut Scheibe Vorbereitung hat sich als sehr nützlich für die Analyse der Schaltungen und Mechanismen von der Netzhaut eingesetzt, um visuelle Informationen verarbeiten. Die Möglichkeit, ganze Zelle Aufnahmen gleichzeitig erhalten von Pre-und Post-synaptischen Neuronen war besonders hilfreich bei diesem Unterfangen. Gepaart ganze Zelle Aufnahmen sind viel einfacher zu erreichen als mit Scheiben mit Flachbild-mount Netzhaut Vorbereitungen, weil die verschiedenen Netzhaut Schichten ausgesetzt sind. Darüber hinaus wegen ihrer großen Netzhautneuronen haben Salamander eine lange Geschichte als einer retinalen Vorbereitung und bieten daher eine besonders gut charakterisierte Modell-System. Mit etwas Übung können gesunde Scheiben Salamander Netzhaut regelmäßig hergestellt werden. Ein paar wichtige Schritte machen den Unterschied zwischen Erfolg und Misserfolg. 1) Stellen Sie sicher, dass die Rasierklinge auf das Gewebe Schneidemaschine montiert ist, so dass es flach auf der Glasoberfläche und Scheiben legt sauber obwohl beide das Gewebe und underlying Nitrozellulosemembran. Wenn Sie einen sauberen Schnitt durch die Nitrozellulosemembran gemacht haben, sollten Sie hören ein leises Klicken, wenn die Rasierklinge auf die Oberfläche der Glasträger. 2) Stellen Sie sicher, dass die Netzhaut der Nitrozellulosemembran eingehalten. Ansonsten kann die Netzhaut schweben von der Membran auf jeder Stufe der Verfahren. 3) Setzen Sie geschnittenen Scheiben in die Luft, da dies viele der oberflächlichen Zellen schädigen. 4) Stellen Sie sicher, dass die Scheiben und Nitrozellulosemembran liegen flach auf der Glasplatte, so dass die Netzhautschichten offensichtlich stehen unter dem Binokular. 5) Stand der Erstattungssätze bei Superfusat Zufluss und Abfluss, um zu vermeiden Überlaufen der Aufnahme Kammer. Dies verhindert, dass plötzliche Veränderungen in der Lösung Ebenen, die abrupten Bewegungen Gewebe verursachen kann. 6) Wählen eines gesunden Paar von Zellen nahe beieinander. Cells mit glatten Zytoplasma sind gesünder als Zellen mit körnigen Zytoplasma. Cells tiefer in der Scheibe sind eher intakt synaptischen con behaltenKontakte. 7) Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitze nicht gebrochen oder gebürstet gegen andere Gewebe oder Schutt auf dem Weg nach unten zu den Zellen. 8) Überprüfen Sie die Pipette Widerstand, um sicherzustellen, dass es nicht mit Schutt oder eine Blase, die beide machen es schwierig, eine Qualität whole-cell Aufnahme erhalten kann verstopft. Anstatt Anbringen der Netzhaut Nitrozellulosefilter Papier, einbetten einige Forscher Netzhaut in einem Block von Agar und verwenden Sie einen Vibratom der Netzhaut Scheiben schneiden. Obwohl wir nicht diesen Ansatz haben versucht, Kim et al. Diskutieren 11 Vorteile beider Ansätze. In ihrer Erfahrung, bietet der Agar-basierten Ansatz eine konsequentere Ausbeute von flachen Scheiben mit gut abgegrenzt Netzhautschichten aber das Filterpapier Ansatz ergibt gesündere Photorezeptoren. Stäbchen und Zapfen sind verantwortlich für Transduzieren Licht in Änderungen des Membranpotentials. Gepaart mit Aufnahmen, kann das Membranpotential von Stangen oder Kegel sein manipuldirekt und so die Fähigkeit, Licht zu erzeugen Reaktionen ated zwar hilfreich für die Identifizierung Zelltypen, kann nicht entscheidend sein. Wir haben daher oft vorzubereiten Scheiben in weißem Licht. Selbst wenn jedoch unter heller Beleuchtung hergestellt, kann Salamander Netzhautneuronen erzeugen große Licht Reaktionen wie die Reaktionen in dargestellt. 3. Dies ist teilweise auf einen relativ großen Reservoir von Chromophors in der großen äußeren Segment Volumen, sondern kann auch durch die Fähigkeit der Müller-Zellen zu 11-cis-Retinal regenerieren für Kegel 12. Um vollständig dunkel-adaptierte Licht Antworten zu erhalten, kann man die Scheiben unter Infrarot-Beleuchtung vorzubereiten. Für Dissektionen unter Infrarot-Licht, legen wir GenIII Bildverstärkern (Nitemate NAV3, Litton Industries, Tempe, AZ) an die Okulare des Binokular und beleuchten das Gewebe mit einer Infrarot-LED-Taschenlampe. Zum Nuten und andere Verfahren, die nicht unter dem Binokular durchgeführt werden, setzen wir ein Head-Mounted-image Verstärker. Für die Anordnung der Patch-Pipetten visualisieren wir Scheiben unter Verwendung eines Infrarot-empfindliche CCD-Kamera (z. B. Watec 502H, Watec Inc., Middletown, NY), die an der aufrechten, festen Phase Mikroskop. Mit diesen Vorsichtsmaßnahmen kann man erhalten Stab Antworten ausstellenden einzelnes Photon Empfindlichkeit 6, 13. Eine Begrenzung der Arbeitszeit in der Netzhaut Scheiben ist, dass lange zelluläre Prozesse von großen Feld Netzhautneuronen kann viele ihrer Dendriten beim Zerschneiden Verfahren verlieren. Retinal Scheibe Zubereitungen sind daher nützlich für die Untersuchung der Physiologie der Zellen, in denen die synaptischen Kontakte umfassen Prozesse der Nähe der Zellkörper. Amphibien und Säuger-Retina teilen viele der gleichen Zelltypen und nutzen ähnliche physiologische Mechanismen 14-16. Während Salamander Retina ist ein gutes Modell für viele Aspekte der Netzhaut von Säugetieren, scheint ein wichtiger Unterschied zu der Anwesenheit eines dedizierten Stange Weg in Säugetieren sein, dass involves Kontakte von spezialisierten Stab bipolaren Zellen auf AII Amakrinzellen 14. Eine weitere Einschränkung des Salamanders Netzhaut ist die geringe Anzahl von genetischen Werkzeuge, die speziell für diese Art entwickelt. Allerdings Antikörper und shRNA Reagenzien, die auf gut konservierten Regionen in anderen Arten erfolgreich in Salamander verwendet werden, ebenso wie viele niedermolekulare Inhibitoren und Peptidreagenzien. Zusätzlich mit ein paar Änderungen in Technik, kann Netzhaut Scheiben aus anderen Spezies, in denen einige dieser Werkzeuge sind leichter verfügbar, hergestellt werden. Über ihre Nutzbarkeit für gepaarte Ganzzell-Aufnahme wird der Salamander retinalen Schicht Zubereitung auch zugänglich für eine Vielzahl von anderen Ansätzen. Wie oben diskutiert, kann retinalen Schichten verwendet werden, um Licht Reaktionen in Kombination mit verschiedenen Protokollen Spannungsklemme 17 zu untersuchen. Retinal Neuronen können auch mit Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich auf Ca 2 + geladen werden, Cl - oder Na+ Eingeführt durch die Patch-Pipette oder durch Bad-Anwendung 15,18-20. Ein fluoreszierendes Peptid, das an den synaptischen Band 21 bindet, kann durch den Patch-Pipette eingeführt werden und für die Bildgebung verwendet das Band 10 oder, wenn konjugiert mit Fluorescein, bei akut und selektiv eine Beschädigung des Bandes 22. Wir haben auch Netzhaut Scheiben in Kombination mit Quantenpunkten verwendet, um die Bewegungen der einzelnen Calciumkanäle in Stäbchen und Zapfen Synapsenenden 23 überwachen. Somit ist das vertikale retinalen Schicht eine vielseitige Versuchsansatz zur Untersuchung grundlegenden synaptischen Mechanismen und die einzigartigen Verarbeitungsfunktionen an dem ersten Synapse im visuellen Signalweg durchgeführt.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent/material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 <td>Comments (optional)</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tissue slicer</td>
 <td>Stoelting</td>
 <td>51425</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Double edge razor blades</td>
 <td>Ted Pella, Inc</td>
 <td>121-6</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nitrocellulose membranes</td>
 <td>Millipore</td>
 <td>AAWP02500</td>
 <td>Type AAWP 0.8 mm pore</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Borosilicate glass pipettes</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>TW120F-4</td>
 <td>1.2mm OD 0.95 mm ID</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Ag/AgCl pellet</td>
 <td>Warner</td>
 <td>E206</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>MicroFil</td>
 <td>World Precision Instruments</td>
 <td>MF34G-5</td>
 <td>34 ga. Filling needle, 67 mm long</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

simultaneous whole-cell recordings from photoreceptors and second-order neurons in an amphibian retinal slice preparation

Eine der zentralen Aufgaben in der Netzhaut Neurowissenschaften ist, um die Schaltung von retinalen Neuronen und wie diese Verbindungen sind verantwortlich für die Gestaltung der Signale an das Gehirn zu verstehen. Photonen werden in der Netzhaut von Stäbchen und Zapfen Fotorezeptoren, die diese Energie in ein elektrisches Signal, übertragen auf andere retinalen Neuronen, wo sie verarbeitet und übermittelt zentrale Vorgaben im Gehirn über den Sehnerv detektiert. Bedeutende frühe Einblicke in retinalen Schaltung und visuelle Verarbeitung kamen aus den histologischen Untersuchungen Cajal 1,2 und später von elektrophysiologischen Ableitungen der Spick Aktivität von retinalen Ganglienzellen - der Ausgang Zellen der Retina 3,4. Ein detailliertes Verständnis der visuellen Verarbeitung in der Netzhaut ein Verständnis der Signalisierung bei jedem Schritt in dem Weg von dem Fotorezeptor zu retinalen Ganglienzellen. Allerdings sind viele Zelltypen Netzhaut BohrerIED tief im Gewebe und damit relativ unzugänglich für elektrophysiologische Aufnahmen. Diese Begrenzung kann durch Bearbeitung mit vertikalen Scheiben, bei dem Zellen, die sich innerhalb jeder der retinalen Schichten sind deutlich sichtbar und zugänglich für elektrophysiologische Aufnahmen überwunden werden. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Herstellung von vertikalen Abschnitten Netzhaut von Larven Tiger Salamander (Ambystoma tigrinum). Während dieses Präparat wurde ursprünglich für Aufnahmen mit scharfen Mikroelektroden 5,6 entwickelt, beschreiben wir ein Verfahren für Dual Ganzzell-Voltage-Clamp-Aufnahmen von Photorezeptoren und zweiter Ordnung horizontalen und bipolaren Zellen, in denen wir manipulieren Photorezeptors Membranpotential während gleichzeitig die Aufnahme nach synaptischen Antworten in horizontaler oder bipolaren Zellen. Die Photorezeptoren des Tigers Salamander sind wesentlich größer als die von Säugetieren, so dass dies eine ideale Vorbereitung, in dem t verpflichtenseine technisch anspruchsvollen experimentellen Ansatz. Eine spezialisierte synaptische Struktur in einer nur einer Handvoll von Neuronen, einschließlich lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen, die gut für die Aufrechterhaltung einer hohen Rate von Tonic Neurotransmitterfreisetzung 7 geeignet ist gefunden - Diese Experimente werden mit einem Auge in Richtung Sondierung der Signalisierung Eigenschaften des synaptischen Bandes beschrieben , 8 - und wie es zu den einzigartigen Eigenschaften Signalisierung dieser ersten retinale Synapse.

Repräsentative Spuren des Lichts Antworten von Neuronen in vertikale Scheiben Salamander Netzhaut sind in Abbildung 3 dargestellt. Der Kegel, horizontal Zelle und OFF Bipolarzelle alle zeigen eine nach außen in Reaktion auf Licht Ausbruch. Der prominente Einwärtsstrom nach dem Lichtblitz in der horizontalen und bipolaren Zelle Aufnahmen wird durch die erhöhte Freisetzung von Glutamat aus Photorezeptoren, wie sie bei Licht versetzt depolarisieren verursacht. Die ON Bipolarzelle antwortet mit einer nach innen gerichteten Strom bei Licht Ausbruch aus einem Zeichen-invertierenden metabotropic Glutamat-Rezeptor-Signalkaskade und Aktivierung von TRPM1 Kanäle 9. Horizontal Zellen und bipolaren Zellen voneinander durch ihre Beziehungen IV (Fig. 4) unterscheiden. Horizontal-Zellen haben in der Regel eine lineare oder einwärtsgleichrichtenden IV und niedrigen Eingangswiderstand (&lt;500 MOhm; 4A), während bipolaren Zellen einen hohen Eingangswiderstand haben(0,5-2 GOhm) und nach außen Berichtigung I - V (4B) Abbildung 5 zeigt repräsentative Ergebnisse aus Aufnahmen von einem Kegel-horizontal Zellpaar (5A) und Kegel-OFF Bipolarzelle Paar (Abbildung 5B).. In jedem, depolarisierenden den Kegel auf -10 mV aus einem Haltepotential von -70 mV evozierte einen spannungsabhängigen Calcium-Strom in der Kegel und schnell nach innen EPSC in horizontaler oder bipolare Zelle. Diese starke Impulse ausreichend ist, um die leicht lösbare Pool von ~ 20 Vesikeln aus jedem synaptischen Band, was zu einer EPSC von ~ 47 pA / Band 10 zu entleeren. Die horizontale Zelle EPSC in 5A betrug 232 pA, was darauf hindeutet, dass es 5 Band Kontakte aus dem präsynaptischen Membran erhalten. Eine ähnliche Schätzung aus dem 178 pA EPSC im Off Bipolarzelle (5B) deutet darauf hin, dass es 4 Band Kontakte aus dem präsynaptischen Membran erhalten. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td><strong&gt; Amphibien Kochsalzlösung </td><td> Presynaptic Pipette </td><td> Postsynaptische Pipette </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 116 mM </td><td> 3,5 mM </td><td> 3,5 mM </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 2,5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> CaCl 2 </td><td> 1,8 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 0,5 mM </td><td> 1 mM </td><td> 1 mM </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> 5 mM </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Cs-Glutamat * </td><td></td><td> 40 mM </td><td></td></tr><tr><td> Cs-Gluconat ** </td><td></td><td> 50 mM </td><td> 90 mM </td></tr><tr><td> Tetraethylammoniumchlorid </td><td></td><td> 10 mM </td><td> 10 mM </td></tr><tr&gt; <td> ATP-Mg </td><td></td><td> 9 mm </td><td> 9 mm </td></tr><tr><td> GTP </td><td></td><td> 0,5 mM </td><td> 0,5 mM </td></tr><tr><td> EGTA </td><td></td><td> 5 mM </td><td> 5 mM </td></tr><tr><td> pH *** </td><td> 7.8 </td><td> 7.2 </td><td> 7.2 </td></tr><tr><td> Osmolarität **** </td><td> 245 mOsm </td><td> 240 mOsm </td><td> 240 mOsM </td></tr></tbody></table> * Cs-Glutamat wird durch Neutralisation von 40 mM L-Glutaminsäure 40 mM CsOH in der Pipette Lösung hergestellt. A 1 M ** Bestand von Cs-Gluconat wird durch Neutralisieren einer Lösung von 45-50% CsOH mit D-Gluconsäure. *** Die pH-Wert sollte mit NaOH für die extrazelluläre Lösung und CsOH für die Pipette Lösungen eingestellt werden. **** Halten der Osmolarität der Pipettenlösungen knapp unter der extrazellulären Lösung verhindert Zellschwellung und verbessert Langlebigkeit der Aufnahme. Tisch1. Komponenten und Parameter für die Standard-intra-und extrazellulären Lösungen in diesem Protokoll verwendet. <img alt="Abbildung 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig1.jpg" /> Abbildung 1. Recording Kammer-Konstruktion. (AC) Top, Seiten-und Schnittansichten der Aufnahme Kammer zeigt Dimensionen. Die Kammer wird von einem 2 mm dickes Stück Acryl gefertigt. (D) montiert Kammer. Superfusat tritt in die Kammer durch einen 10 cm Länge der Teflon-Schlauch (Zufluss Rohr; Typ 24LW). Superfusat durch Anwendung milder Ansaugen einer abgeschrägten 20 Gauge Metallrohr an der anderen Seite der Kammer entfernt. Angrenzend an diesem Ausgang Rohr ist ein Ag / AgCl Referenzelektrode Pellet. Das Blei aus dieser Referenz-Elektrode mit der Referenz-Eingang des headstage verbunden. Ein kleines Dreieck von Kimwipeüber der Referenzelektrode angeordnet, um es in Kontakt mit der Lösung zu halten und zu regulieren Lösung fließen in den Ablaufschlauch. Der Boden der Kammer befindet, indem ein Objektträger in die ausgesparten Ränder der Kammer ausgebildet. Der Objektträger wird an Ort und Stelle mit einem Wulst aus Vakuumfett statt. Strips von Nitrozellulosemembran mit retinalen Scheiben sind in Perlen Vakuumfett, die einen Kanal für Lösung zu fließen bilden eingebettet. Vor der Durchführung Scheiben wird eine 5 x 10 mm Stück Nitrozellulosemembran in die Kammer mit zwei kleinen Perlen Vakuumfett befestigt. Ein Stück der Augenmuschel ist vitrealen Seite nach unten auf dieser Nitrocellulosemembran und abgehoben, sobald die Netzhaut anhaftet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50007/50007fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier, um eine größere Abbildung anzuzeigen</a> . <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig2.jpg" /> Abbildung 2. Dye-gefüllte Zelle in Paaren vertikale Scheibe Vorbereitung. A) Bilder einer Stange und synaptisch-gekoppelten horizontalen Zelle, die mit kontrastierenden Fluoreszenzfarbstoffen über die Patch-Pipette bei gleichzeitiger whole-cell recording eingeführt gefüllt waren. Lucifer Gelb (2 mg / ml) wurde in der Stange Pipettenlösung (gelb) und sulfarhodamine B (1 mg / ml) wurde in der horizontalen Zelle Pipettenlösung (purple) inbegriffen. Fluoreszenzbilder wurden wurden mit einer drehenden Scheibe konfokalen Mikroskop (Perkin Elmer Ultraview LCI) mit einer gekühlten CCD-Kamera (Orca ER) ausgestattet und an der festen Phase Mikroskop (Nikon E600 FN mit 60X, 1,0 NA Wasserimmersionsobjektiv). Diese Bilder wurden auf Hellfeld-Bilder der entsprechenden retinalen Scheiben mit Adobe Photoshop. B) Bilder eines Kegels und OFF Bipolarzelle synaptisch-gekoppelten überlagert. Die bipolare Zelle Axonterminal verzweigt in der äußersten (S1) Sublamina der inneren Plexiformschicht in der Nähe der Grenze mit der inneren Körnerschicht. <strong&gt; C) Bilder eines Kegels und synaptisch-gekoppelten horizontalen Zelle. Beachten Sie, dass die Kegel-Terminals beträchtlich größer als der Axonterminal der Stange sind. Obwohl horizontalen Zellen kann durch die längliche Form ihrer Zellkörper, Zellkörper der ON-OFF-und bipolaren Zellen in der INL nicht leicht unterschieden werden vor der Aufnahme identifiziert werden. Man kann jedoch verschoben OFF bipolaren Zellen, die Zellkörper sind in den ONL und von Zapfen durch das Fehlen von inneren und äußeren Segmenten unterscheiden kegelförmigen lösungsbezogen. Der Maßstab ist 20 um. <img alt="Abbildung 3" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig3.jpg" /> Abbildung 3. Ströme unter Spannungsklemme von vier verschiedenen retinalen Neuronen in Reaktion auf eine helle 500 msec Blitz von weißem Licht aufgezeichnet Licht hervorgerufen. Der Konus (A), horizontal Zelle <strong&gt; (B), und aus bipolaren Zelle (C) alle reagierten mit einer nach außen laufenden leuchten. (D) Die auf Bipolarzelle reagierte auf die gleiche Licht Stimulus mit einem nach innen gerichteten Strom. Das Grundrauschen des off bipolaren Zelle (C) ausgestellt spiegelt eine kontinuierliche Freisetzung synaptischer Vesikel in der Dunkelheit, wenn Photorezeptoren in Licht hyperpolarisieren abnimmt. Antworten aus diesen vier Zellen wurden in separaten Aufnahmen mit Scheiben unter weißem Licht hergestellt wurde. Die Intensität des weißen Lichts Stimulus in diesen Beispielen verwendeten individuelle Antworten in horizontalen und bipolaren Zellen entspricht 580 nm Photonenfluss von 1 x 10 5 Photonen / sec / 2 um. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="3in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig4.jpg" /> Abbildung 4. Strom-Spannungs (IV) Beziehungen von horizontal und aus bipolaren Zellen. (A) Deckplatte, Membranströme durch eine Reihe von 150 msec Schritten Spannung von -120 bis +40 mV in 20 mV-Schritten (unten) in eine horizontale Zelle angelegt hervorgerufen. Horizontal-Zellen haben typischerweise eine niedrige Eingangswiderstand und linearen oder einwärtsgleichrichtenden IV Beziehungen. (B) IV Beziehung eines aus bipolaren Zelle in Reaktion auf eine Reihe von Spannungsstufen. Bipolar-Zellen haben einen höheren Eingangswiderstand und einen nach außen Gleichrichten IV, durch die Aktivierung von spannungsabhängigen Kaliumkanälen Ströme. <img alt="Abbildung 5" fo:content-width="2.75in" fo:src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50007/50007fig5.jpg" /> Abbildung 5. Beispiele gepaart Aufzeichnen von Daten. (A) Aufnahme des Konus spannungsabhängigen Calcium-Strom (Cone I Ca </ssub&gt;) als Reaktion auf einen Schritt 100 msec bis -10 mV von einem Haltepotential von -70 mV (Cone V m). Leak und Kapazität Transienten wurden abgezogen mit einem P / 8 Lecksubtraktion Protokoll. Eine schnelle exzitatorischen postsynaptischen Strom (EPSC; HC PSC) wurde synchron von einer horizontalen Zelle aufgenommen, die zeigen, dass diese beiden Zellen synaptically gekoppelt sind (b) eine EPSC wurde in einem Aus Bipolare Zelle in Reaktion auf den gleichen Reiz in einem anderen erfasst. Kegel.

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Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander (<em&gt; Ambystoma tigrinum</em&gt;) Und erklären, wie wir diese verwenden Scheiben zu synaptischen Verarbeitung in der Netzhaut durch Einholung Dual whole-cell voltage clamp Aufnahmen von Photorezeptoren und zweiter Ordnung horizontalen und bipolaren Zellen zu studieren.

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

simultaneous-whole-cell-recordings-from-photoreceptors-second-order

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Aufrufe.  University of Nebraska Medical Center. Wir beschreiben die Herstellung von dünnen Scheiben von retinalen Wasserorganismen Tiger Salamander ( Ambystoma tigrinum) Und erklären, wie wir diese verwenden Scheiben zu synaptischen Verarbeitung in der Netzhaut durch Einholung Dual whole-cell voltage clamp Aufnahmen von Photorezeptoren und zweiter Ordnung horizontalen und bipolaren Zellen zu studieren.

Serie: Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1. This information is then segregated into what are known as the ON and OFF pathways. The photoreceptors signal light information to the bipolar cells (BCs), which depolarize in response to increases (On BCs) or decreases (Off BCs) in light intensity. This segregation of light information is maintained at the level of the retinal ganglion cells (RGCs), which have dendrites stratifying in either the Off sublamina of the inner plexiform layer (IPL), where they receive direct excitatory input from Off BCs, or stratifying in the On sublamina of the IPL, where they receive direct excitatory input from On BCs. This segregation of information regarding increases or decreases in illumination (the On and Off pathways) is conserved and signaled to the brain in parallel.
The RGCs are the output cells of the retina, and are thus an important cell to study in order to understand how light information is signaled to visual nuclei in the brain. Advances in mouse genetics over recent decades have resulted in a variety of fluorescent reporter mouse lines where specific RGC populations are labeled with a fluorescent protein to allow for identification of RGC subtypes 2 3 4 and specific targeting for electrophysiological recording. Here, we present a method for recording light responses from fluorescently labeled ganglion cells in an intact, isolated retinal preparation. This isolated retinal preparation allows for recordings from RGCs where the dendritic arbor is intact and the inputs across the entire RGC dendritic arbor are preserved. This method is applicable across a variety of ganglion cell subtypes and is amenable to a wide variety of single-cell physiological techniques.

This article provides a description of how to dissect and record from the isolated retinal preparation in mouse. In particular, we describe how to record light responses from a fluorescently labeled ganglion cell population and subsequently identify and analyze its morphology.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Hirnschnitt Biotinylierung: Eine<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Ansatz zur Region spezifische Plasma Membrane Protein Handel Erwachsene Neuronen messen

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Recording Light-evoked Postsynaptic Responses in Neurons in Dark-adapted, Mouse Retinal Slice Preparations Using Patch Clamp Techniques

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. Retinal neurons in the network comprise of numerous subtypes. More than 10 subtypes of bipolar cells, ganglion cells, and amacrine cells have been identified by morphological studies. Multiple subtypes of retinal neurons are thought to encode distinct features of visual signaling, such as motion and color, and form multiple neural pathways. However, the functional roles of each neuron in visual signal processing are not fully understood. The patch clamp method is useful to address this fundamental question. Here, a protocol to record light-evoked synaptic responses in mouse retinal neurons using patch clamp recordings in dark-adapted conditions is provided. The mouse eyes are dark-adapted O/N, and retinal slice preparations are dissected in a dark room using infrared illumination and viewers. Infrared light does not activate mouse photoreceptors and thus preserves their light responsiveness. Patch clamp is used to record light-evoked responses in retinal neurons. A fluorescent dye is injected during recordings to characterize neuronal morphological subtypes. This procedure enables us to determine the physiological functions of each neuron in the mouse retina.

We will demonstrate how to prepare retinal slices from the mouse eye and record light responses in retinal neurons. The entire procedure is conducted in dark-adapted conditions.

Recording Licht-evozierte Postsynaptische Antworten in Neuronen im Dunkel-adaptierten, Maus retinalen Scheibe Vorbereitungen Verwendung Patch-Clamp-Techniken

The retina is the gateway to the visual system. To understand visual signal processing mechanisms, we investigate retinal neural network functions. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

Zebrafisch<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...