Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem NIH R01EY012949, R21EY018885, T32 EY0707133 unterstützt. Wir bedanken uns bei Darwin Hang für seine technische Unterstützung.

Verwendung von Tieren Statement: Die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Leitfadens für die Pflege und Verwendung von Labortieren beschrieben gepflegt, mit Protokollen, die von der University of Minnesota Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt. 1) Herstellung von Lösungen <ol><li> Vor der Durchführung elektrophysiologischer Aufzeichnung, müssen intrazellulär, extrazellulär und Enzymlösungen vorbereitet werden. </li><li> Extrazellulären Lösung: mix eine Flasche (8,8 g) gepulvertem Ames &#39;Medium (Sigma) mit 1 l H 2 O und 1,9 g Natriumhydrogencarbonat (23 mM). An allen Punkten der extrazellulären Lösung wird mit 95% O 2 / 5% CO 2-Gasgemisch gesättigt. Transfer-200 mL in ein Becherglas für Netzhaut Lagerung. Legen Sie die restliche Lösung in der Perfusion System Behälter für Schwerkraft Perfusion einmal Netzhaut angebracht wird. </li><li> Intrazelluläre Lösung: Intrazelluläre Lösung hätte erfolgen zuvor und dann aliquotiert in 500-1000 ul Aliquots und bei -20 ° C. Intrazelluläre Lösung variiert je nach Experiment benötigt werden, für Stromzange Aufnahmen gezeigt, hier benutzen wir (in mm): 125 K-Gluconat, 2 CaCl 2, 2 MgCl 2, 10 EGTA, 10 HEPES, 2 Na 2-ATP, 0,5 mM NaGTP pH-Wert auf 7,2 mit KOH 5. Ein fluoreszierender Tracer wie 10 uM AlexaFluor-594 Hydrazid (Invitrogen) hinzugefügt werden, um Dendriten während des Experiments, und neurobiotin (0,3%) zu visualisieren kann auch für die Analyse von Zell-Anatomie nach der Aufnahme aufgenommen werden. Wenn Sie bereit sind zu erfassen, zu tauen intrazelluläre Lösung. </li><li> Enzymlösung: Kombinieren 10000 Stück Collagenase (Worthington Chemicals) mit 83 mg Hyaluronidase (Worthington Chemicals) in 4,150 ml extrazellulären Lösung. Shop in 50 ul Aliquots bei -20 ° C. Aliquots können mehrere Wochen verwendet werden. Wenn Sie bereit sind, um die Netzhaut zu behandeln, verdünnten Aliquots in 500 ul von sprudelte extrazellulären Lösung. </li><li> Phosphat-gepufferte Lösung (PBS): In 800 ml H 2 O add 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,4 g Na 2 HPO 4 und 0,24 g KH 2 PO 4. Bringen Sie den pH mit NaOH auf 7,4. Stellen Sie die Lautstärke auf 1 L. </li><li> 0,2 M Phosphatpuffer: In 800 ml H 2 O hinzu 21,8 g Na 2 HPO 4 und 6,4 g NaH 2 PO 4. Bringt Volumen auf 1 L. </li><li> 4% Paraformaldehyd-Lösung: Wärme 50ml H 2 O bis 60 ° C. Add 4g Paraformaldehyd, rühren für einige Minuten. Fügen Sie einige Tropfen 1M NaOH (ca. 5 Tropfen), immer schön rühren, bis die Lösung klar ist. 50 ml 0,2 M Phosphat-Puffer in das Becherglas. Überprüfen Sie pH-Wert mit pH-Streifen (~ 7,4). Filter und kühl. </li><li> Blocking-Lösung (10% Ziegenserum, 0,5% TritonX100): In 1,8 ml PBS add 0,2 ml Ziegenserum und 10 l Triton X-100. TritonX-100 dient dazu, das Gewebe permeabilisieren. </li><li> Streptavidin-Lösung (5% Ziegenserum, 0,5% TritonX100, 1:500 Streptavidin 594): In 1,9 ml PBS add 0,1 ml Ziegenserum, 10 l Triton X-100 und 4 ul Streptavidin 594. </li></ol> 2) Isolierung der Netzhaut von der Maus Dissection Werkzeuge benötigt: 1 # 2 Pinzetten, 2 # 5 Pinzetten, Scheren ophthalmologische <ol><li> Euthanize Maus nach anerkannten Protokollen, in diesem Fall CO 2 Ersticken und entkernen Augapfel durch vorsichtiges Einsetzen einer abgewinkelten Pinzette # 2 hinter dem Auge und Herausheben des Augapfels. </li><li> Setzen Sie den Augapfel in eine 35 mm Petrischale mit extrazellulären Lösung. Schneiden Sie den Sehnerv und alle angeschlossenen Augenmuskeln oder Bindegewebe mit ophthalmologischen Schere. Cut entfernt die Hornhaut mit einer augenärztlichen Schere und ziehen Sie das Objektiv mit Nr. 5 Pinzette. Reißen Sie die Lederhaut mit einem Paar Nr. 5 Pinzette und nutzen Sie die Zange an den Sehnerv, wo die Netzhaut und Sklera am Sehnervenkopf treffen zu durchtrennen. Vorsichtig schälen die Netzhaut weg von der Augenmuschel. Tipp: Lassen Sie jeden Schritt auf beiden Netzhäute, bevor er zum nächsten Schritt zu Zeit zu minimieren. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um Glaskörper an der Netzhaut zu entfernen. Dies kann durch &quot;Greifen&quot; der transparente Glaskörper vor der Netzhaut mit einer Pinzette durchgeführt werden. Der Glaskörper, wenn erfolgreich entfernt, sichtbar sein soll als eine klare, gallertartige Substanz an der Zange. Tipp: Schneiden Netzhaut in der Mitte nach der Entfernung des Glaskörpers wird die Menge der verwendbaren Gewebe zu maximieren und die Montage in der Kammer zu erleichtern. </li><li> Halten Sie die Netzhaut in Sauerstoff extrazellulären Lösung bei Raumtemperatur in einer dunklen Umgebung mit minimalem Umgebungslicht bis sie bereit sind verdaut werden. Netzhaut kann auf diese Weise für ca. 6 Stunden aufbewahrt werden. </li></ol> 3) Die Behandlung von Netzhaut mit Enzym-Mischung und Montage in der Aufnahme Kammer <ol><li> Ein Aliquot des Kollagenase / Hyaluronidase in 500 ul extrazellulären Lösung, Place-Lösung in einer 35 mm Petrischale und Transfer der Netzhaut. </li><li> Halten Sie das Retina-enthaltenIng. Petrischale abgedeckt und in der Dunkelheit, in einem 95% O2 / 5% CO 2-Umgebung für 15 min unter leichtem Schütteln. Dieser Schritt hilft bei der Verdauung alle verbleibenden Glaskörpers und ermöglicht einen leichteren Zugang zu den Ganglienzellen. Tipp: für Netzhäute von jüngeren Tieren mit weniger Glaskörper oder wenn schädliche Wirkungen beobachtet werden, Zeit zu ~ 5 Minuten verkürzt werden. </li><li> Entfernen Netzhaut von Enzym-haltigen Medium und waschen ausgiebig in extrazellulären Lösung </li><li> Übertragen Sie die Netzhaut in der Aufnahme Kammer 6 mit dem Photorezeptorschicht nach unten. Wick entfernt Restflüssigkeit entweder mit einer Pipette oder Gewebe-und Roll-out Seiten der Netzhaut, um Gewebe zu achten, nur die Ränder der Netzhaut, insbesondere die Vermeidung von Kontakt mit dem Ganglienzellschicht Touch zu glätten. Legen Sie ein Platin-Ring mit Nylon-Mesh über Netzhaut, um das Gewebe zu verankern und sofort füllen die Kammer mit extrazellulären Lösung. </li><li> Montieren Sie die Aufnahme Kammer auf den Mikroskoptisch legen Rohr für die Schwerkraft Perfusion und Vakuum-Saug-und befestigen Erdungskabel. </li></ol> 4) Lokalisierung von EGFP exprimieren Ganglienzellen und leichte Stimulation <ol><li> Versorgen die Netzhaut durch die Schwerkraft mit extrazellulären Lösung bei 1 mL / min oder schneller Preisen. Tipp: Wenn Perfusionsrate zu langsam ist, das Gewebe wird nicht ausreichend mit Sauerstoff und synaptische Signalisierung kann gestört werden. </li><li> Füllen Sie eine Aufzeichnung Pipette mit intrazellulären Lösung und setzen Sie sie in den Pipettenhalter. Tipp: Pipetten mit Widerständen im Bereich von 3 bis 5MΩ die besten Ergebnisse. </li><li> Visualisieren Sie die Netzhaut unter Infrarot-Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik bei geringer Vergrößerung (10fach Objektiv, NA 0,3) zur Lokalisierung der Aufnahme Pipette. Infrarot-Licht wird verwendet, um Netzhaut Belichtung mit sichtbarem Licht zu minimieren und zur Minimierung Helladaptation. Umzug in höherer Vergrößerung (40fach Objektiv, NA 0,8) und bringen Elektrode in den Blick knapp über Gewebe. </li><li> Bei hoher Vergrößerung (40fach Objektiv), beleuchten die Netzhaut mit Epifluoreszenz (480 nm für EGFP) und wählen Sie einen fluoreszierenden Ganglienzellen und markieren Sie auf dem Computer-Monitor mit Klebeband (Abbildung 1A). </li><li> Unter DIC und IR-Beleuchtung, Position der Aufnahme Elektrode in der Nähe der gezielten Ganglienzellen (Abb. 1A). Den Bereich sofort für Zelle durch leichten Überdruck, um die Aufnahme Elektrode über eine 12cc Plastikspritze mit dem Pipettenhalter mit PE-Rohre. Auf dem Verstärker, Null jede Spannungs-Offsets. Die Elektrodenspitze auf ausgewählte Ganglienzelle bis ein Grübchen erscheint auf der Zelloberfläche. </li><li> Mit dem Verstärker in Voltage-Clamp-Modus anwenden Testpuls und Überwachung der Strom durch die Pipette. Bewerben Unterdruck zur Abdichtung zwischen Elektrode und Zelle zu schaffen. Release-Unterdruck, wenn die Zelle beginnt zu versiegeln und bis Haltestrom deutet auf eine GOhm elektrische Abdichtung zwischen Zellmembran und Pipette zu warten. Bewerben sanfte Impulse von negativer Druck, bis kapazitiven Transienten und erscheinen dann los jede Anwendung von Druck. Tipp: wenn der Zugriff (Serie) Widerstand ist hoch (&gt; 30MΩ), kann dies oft durch zusätzliche, sehr sanft, Impulse von negativer Druck gelindert werden. </li><li> Sobald eine stabile Abdichtung erreicht gelten ein Impuls von Unterdruck. Nach Ganzzell-Modus erhalten, ermöglichen Zelle zu dunkel für 5 Minuten anzupassen. Record, in Stromzange Modus Reaktion auf full-field, weißes Licht Stimulation (Abbildung 1B). </li><li> Nach der Aufnahme wird AlexaFluor-594 haben diffundiert, um die Dendriten. Der Tracer kann unter Epifluoreszenz visualisiert bei 594 nm und verwendet werden, um festzustellen, ob eine Ganglienzelle On-, Off-oder Bi-Schichtspeicher durch Umschalten zwischen Epifluoreszenz und DIC Infrarotoptik 5. Ist </li><li> Wenn neurobiotin in Pipette und der Netzhaut wird sich für die Immunhistochemie verarbeitet werden enthalten ist, dann muss Pipette vorsichtig eingefahren werden, um minimale Unterbrechung der Membran. </li></ol> 5) Analyse der Anatomie des aufgezeichneten Ganglienzellen Füllen mit neurobiotin ermöglicht genauere morphologische Analyse von Ganglienzellen nach der Aufnahme. Tipp: Wenn bestimmte Korrelationen zwischen einem aufgezeichneten Ganglienzellen und detaillierte Morphologie gewünscht wird, kann es am besten zu erfassen und zu füllen nur ein RGC pro Präparat. <ol><li> Wenn neurobiotin in der intrazellulären Lösung enthalten war dann die Netzhaut in Paraformaldehyd-Lösung und fix über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Spülen in PBS, mindestens 2 Stunden, mindestens 6 ändert. Übertragung der Netzhaut zu einer Platte mit Blocking-Lösung. Lassen Sie in Blocking-Lösung für 2 Stunden bei Raumtemperatur auf Schüttler. </li><li> Ersetzen Sie die Blocking-Lösung mit dem Streptavidin-Lösung. Inkubieren 2 Tage bei 4 ° C am Schüttler. Spülen Sie die Netzhaut in PBS, 6 Spülungen, jeweils 20 min. </li><li> Montieren Sie die Netzhaut mit Vectashield in einem Glasträger.Die Netzhaut ist mit den Ganglienzellen platziert werden bis. Führen Sie die konfokale Mikroskopie (Abbildung 1C). </li></ol> Repräsentative Ergebnisse Wenn die Netzhaut gesund ist und das Sezieren erfolgreich war, sollten die einzelnen Ganglienzellen unter DIC sichtbar bei hoher Vergrößerung (Abbildung 1A). Ungesunde Netzhaut haben große, granulierte Kerne und muss entsorgt werden. Wenn der synaptischen Antwort eines bestimmten Ganglienzellen intakt ist, dann ist die Zelle sollte bei leichten Einsetzen reagieren oder versetzt Aktionspotentiale und, im Falle eines intrinsisch lichtempfindlichen Ganglienzellen (Abbildung 1B), eine anhaltende Depolarisation. <img src="/files/ftp_upload/2367/2367fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Lokalisierung, Aufzeichnung und Färbung eines fluoreszenzmarkierten retinalen Ganglienzellen. (A) GFP positive RGC visualisiert unter epifluoreszenten Beleuchtung bei 40-facher Vergrößerung (links) und unter DIC Beleuchtung (rechts). (B) Synaptic Licht Reaktion eines M2 intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzellen in whole-cell current clamp Modus von fluoreszenzmarkierten RGC aufgezeichnet. (C) M1 intrinsisch lichtempfindlichen retinalen Ganglienzellen, die unter Epifluoreszenz identifiziert wurde, für whole-cell recording gezielt mit neurobiotin gefüllt und dann für die Immunhistochemie verarbeitet.

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	<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+processing+in+the+mammalian+retina.">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li><li>Schmidt, T. M., Taniguchi, K., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+and+extrinsic+light+responses+in+melanopsin-expressing+ganglion+cells+during+mouse+development.">Intrinsic and extrinsic light responses in melanopsin-expressing ganglion cells during mouse development.</a> J Neurophysiol. 100, 371-384 (2008).</li><li>Huberman, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+identification+of+an+On-Off+direction-selective+retinal+ganglion+cell+subtype+reveals+a+layer-specific+subcortical+map+of+posterior+motion.">Genetic identification of an On-Off direction-selective retinal ganglion cell subtype reveals a layer-specific subcortical map of posterior motion.</a> Neuron. 62, 327-334 (2009).</li><li>Siegert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+address+book+for+retinal+cell+types.">Genetic address book for retinal cell types.</a> Nat Neurosci. 12, 1197-1204 (2009).</li><li>Schmidt, T. M., Kofuji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+morphological+differences+among+intrinsically+photosensitive+retinal+ganglion+cells.">Functional and morphological differences among intrinsically photosensitive retinal ganglion cells.</a> J Neurosci. 29, 476-482 (2009).</li><li>Newman, E. A., Bartosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+eyecup+preparation+for+the+rat+and+mouse.">An eyecup preparation for the rat and mouse.</a> J Neurosci Methods. 93, 169-175 (1999).</li><li>Haverkamp, S., Inta, D., Monyer, H., Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+green+fluorescent+protein+in+retinal+neurons+of+four+transgenic+mouse+lines.">Expression analysis of green fluorescent protein in retinal neurons of four transgenic mouse lines.</a> Neuroscience. 160, 126-139 (2009).</li><li>Zhang, D. Q., Zhou, T. R., McMahon, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+retinal+dopaminergic+neurons+underlying+their+multiple+roles+in+vision.">Functional heterogeneity of retinal dopaminergic neurons underlying their multiple roles in vision.</a> J Neurosci. 27, 692-699 (2007).</li><li>Hu, E. H., Dacheux, R. F., Bloomfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+flattened+retina-eyecup+preparation+suitable+for+electrophysiological+studies+of+neurons+visualized+with+trans-scleral+infrared+illumination.">A flattened retina-eyecup preparation suitable for electrophysiological studies of neurons visualized with trans-scleral infrared illumination.</a> J Neurosci Methods. 103, 209-216 (2000).</li><li>Wu, S. M., Gao, F., Pang, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+circuitry+mediating+light-evoked+signals+in+dark-adapted+mouse+retina.">Synaptic circuitry mediating light-evoked signals in dark-adapted mouse retina.</a> Vision Res. 44, 3277-3288 (2004).</li></ol>

Diese Technik ist für alle retinalen Ganglienzellen Aufnahmen aus einer isolierten Netzhaut. Obwohl in der Mauslinie oben verwendeten intrinsisch lichtempfindlichen, Melanopsin-exprimierenden RGCs mit EGFP 2, 5 gekennzeichnet sind, ist dieses Protokoll ohne weiteres auf andere fluoreszenzmarkierte RGC Linien oder verallgemeinert werden können, um aus zufällig ausgewählten RGCs sowie Rekord. Diese Technik ist besonders wertvoll, weil die dendritischen Dorn jedes RGC und ihre jeweiligen Eingangs-Neuronen li...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ames&#x2019; Medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>A1420</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS005273</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whorthington Biochemical</td>
<td>LS002592</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Bicarbonate</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>S5761</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>AlexaFluor 594 Hydrazyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>A10442</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Neurobiotin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>SP1120</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrodes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>BF120-69-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Forceps</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>11252-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ophthalmologic Scissor</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Fine Science Tools</td>
<td>15000-00</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptavidin 594</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>S32356</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Vectashield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vector Laboratories</td>
<td>H-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Goat Serum</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jackson ImmunoResearch</td>
<td>005-000-001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>T8787</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paraformaldehyde</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Electron Microscopy Sciences</td>
<td>19210</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

an isolated retinal preparation to record light response from genetically labeled retinal ganglion cells

Die ersten Schritte in Wirbeltieren Vision statt, wenn das Licht regt den lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen der Netzhaut 1. Diese Information wird dann in das, was als die ON und OFF Wege bekannt getrennt. Die Photorezeptoren Signallicht Informationen zu den bipolaren Zellen (BCS), die als Reaktion auf Erhöhungen (über BCS) oder verringert (Off BCs) in der Lichtintensität depolarisieren. Diese Trennung von Licht Informationen auf der Ebene des retinalen Ganglienzellen (RGC), die Dendriten Stratifizierung entweder im Off sublamina der inneren plexiformen Schicht (IPL), wo sie erhalten direkten exzitatorischen Input von Off BCs haben behauptet, oder Stratifizierung in der On sublamina der IPL, wo sie erhalten direkten exzitatorischen Input von über BCS. Diese Trennung von Informationen über Erhöhungen oder Verminderungen Beleuchtung (die Ein-und Ausschalten Wege) konserviert ist und signalisiert dem Gehirn in parallel. Die RGCs sind der Ausgang Zellen der Netzhaut, und sind somit eine wichtige Zelle in Ordnung Studie zu verstehen, wie Licht Informationen zu visuellen Kerne im Gehirn signalisiert. Advances in Mausgenetik in den letzten Jahrzehnten wurden in einer Vielzahl von fluoreszierenden Reporter-Maus Linien, in denen spezifische RGC Populationen mit einem fluoreszierenden Protein markiert sind, für die Identifizierung von RGC-Subtypen 2 3 4 und Targeting für die elektrophysiologische Ableitung ermöglichen geführt. Hier präsentieren wir eine Methode zur Aufzeichnung von Licht Antworten von fluoreszenzmarkierten Ganglienzellen in einer intakten, isolierten retinalen Vorbereitung. Diese isolierten retinalen Vorbereitung ermöglicht Aufnahmen aus RGCs wo die dendritischen Dorn ist intakt und die Eingänge über die gesamte RGC dendritischen Dorn bleiben erhalten. Dieses Verfahren ist anwendbar für eine Vielzahl von Ganglienzellen Subtypen und ist offen für eine Vielzahl von Single-Cell-physiologischen Methoden.

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An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Eine isolierte Retinal Vorbereitung auf leichte Ansprache aus genetisch markierten retinalen Ganglienzellen Rekord

The first steps in vertebrate vision take place when light stimulates the rod and cone photoreceptors of the retina 1.  This information is then ...

an-isolated-retinal-preparation-to-record-light-response-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K Aufrufe.  University of Minnesota. Dieser Artikel enthält eine Beschreibung, wie zu sezieren und Datensatz aus der isolierten Netzhaut Vorbereitung in der Maus. Insbesondere beschreiben wir, wie Licht von Antworten eines fluoreszenzmarkierten Ganglienzelle Bevölkerung aufzunehmen und anschließend zu identifizieren und zu analysieren, ihre Morphologie.

Serie: An Isolated Retinal Preparation to Record Light Response from Genetically Labeled Retinal Ganglion Cells

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural connectivity form during development. In mice, retinofugal projections are arranged in a topographic manner and form eye-specific layers in the Lateral Geniculate Nucleus (dLGN) of the thalamus and the Superior Colliculus (SC). The development of these precise patterns of retinofugal projections has typically been studied by labeling populations of RGCs with fluorescent dyes and tracers, such as horseradish peroxidase1-4. However, these methods are too coarse to provide insight into developmental changes in individual RGC axonal arbor morphology that are the basis of retinotopic map formation. They also do not allow for the genetic manipulation of RGCs.
Recently, electroporation has become an effective method for providing precise spatial and temporal control for delivery of charged molecules into the retina5-11. Current retinal electroporation protocols do not allow for genetic manipulation and tracing of retinofugal projections of a single or small cluster of RGCs in postnatal mice. It has been argued that postnatal in vivo electroporation is not a viable method for transfecting RGCs since the labeling efficiency is extremely low and hence requires targeting at embryonic ages when RGC progenitors are undergoing differentiation and proliferation6. 
In this video we describe an in vivo electroporation protocol for targeted delivery of genes, shRNA, and fluorescent dextrans to murine RGCs postnatally. This technique provides a cost effective, fast and relatively easy platform for efficient screening of candidate genes involved in several aspects of neural development including axon retraction, branching, lamination, regeneration and synapse formation at various stages of circuit development. In summary we describe here a valuable tool which will provide further insights into the molecular mechanisms underlying sensory map development.

Transfection of Mouse Retinal Ganglion Cells by in vivo Electroporation

We demonstrate an in vivo electroporation protocol for transfecting single or small clusters of retinal ganglion cells (RGCs) and other retinal cell types in postnatal mice over a wide range of ages. The ability to label and genetically manipulate postnatal RGCs in vivo is a powerful tool for developmental studies.

Die Transfektion von Maus retinalen Ganglienzellen durch In vivo Elektroporation

The targeting and refinement of RGC projections to the midbrain is a popular and powerful model system for studying how precise patterns of neural ...

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Ein Optic Nerve Crush Injury Mausmodell zur retinalen Ganglienzellen Survival Study

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are responsible for shaping the signals transmitted to the brain. Photons are detected in the retina by rod and cone photoreceptors, which convert that energy into an electrical signal, transmitting it to other retinal neurons, where it is processed and communicated to central targets in the brain via the optic nerve. Important early insights into retinal circuitry and visual processing came from the histological studies of Cajal1,2 and, later, from electrophysiological recordings of the spiking activity of retinal ganglion cells - the output cells of the retina3,4.
A detailed understanding of visual processing in the retina requires an understanding of the signaling at each step in the pathway from photoreceptor to retinal ganglion cell. However, many retinal cell types are buried deep in the tissue and therefore relatively inaccessible for electrophysiological recording. This limitation can be overcome by working with vertical slices, in which cells residing within each of the retinal layers are clearly visible and accessible for electrophysiological recording.
Here, we describe a method for making vertical sections of retinas from larval tiger salamanders (Ambystoma tigrinum). While this preparation was originally developed for recordings with sharp microelectrodes5,6, we describe a method for dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells in which we manipulate the photoreceptor's membrane potential while simultaneously recording post-synaptic responses in horizontal or bipolar cells. The photoreceptors of the tiger salamander are considerably larger than those of mammalian species, making this an ideal preparation in which to undertake this technically challenging experimental approach. These experiments are described with an eye toward probing the signaling properties of the synaptic ribbon - a specialized synaptic structure found in a only a handful of neurons, including rod and cone photoreceptors, that is well suited for maintaining a high rate of tonic neurotransmitter release7,8 - and how it contributes to the unique signaling properties of this first retinal synapse.

We describe the preparation of thin retinal slices from aquatic tiger salamanders (Ambystoma tigrinum) and explain how we use these slices to study synaptic processing in the retina by obtaining dual whole-cell voltage clamp recordings from photoreceptors and second-order horizontal and bipolar cells.

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Implementing Dynamic Clamp with Synaptic and Artificial Conductances in Mouse Retinal Ganglion Cells

Ganglion cells are the output neurons of the retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs arising from specific neural circuits. Patch clamp techniques, in voltage clamp and current clamp configurations, are commonly used to study the physiological properties of neurons and to characterize their synaptic inputs. Although the application of these techniques is highly informative, they pose various limitations. For example, it is difficult to quantify how the precise interactions of excitatory and inhibitory inputs determine response output. To address this issue, we used a modified current clamp technique, dynamic clamp, also called conductance clamp 1, 2, 3 and examined the impact of excitatory and inhibitory synaptic inputs on neuronal excitability. This technique requires the injection of current into the cell and is dependent on the real-time feedback of its membrane potential at that time. The injected current is calculated from predetermined excitatory and inhibitory synaptic conductances, their reversal potentials and the cell's instantaneous membrane potential. Details on the experimental procedures, patch clamping cells to achieve a whole-cell configuration and employment of the dynamic clamp technique are illustrated in this video article. Here, we show the responses of mouse retinal ganglion cells to various conductance waveforms obtained from physiological experiments in control conditions or in the presence of drugs. Furthermore, we show the use of artificial excitatory and inhibitory conductances generated using alpha functions to investigate the responses of the cells.

This video article illustrates the set-up, the procedures to patch cell bodies and how to implement dynamic clamp recordings from ganglion cells in whole-mount mouse retinae. This technique allows the investigation of the precise contribution of excitatory and inhibitory synaptic inputs, and their relative magnitude and timing to neuronal spiking.

Implementieren Dynamische Clamp mit Synaptic und künstliche Leitfähigkeiten in Maus retinalen Ganglienzellen

Ganglion cells are the output neurons of the  retina and their activity reflects the integration of multiple synaptic inputs  arising from specific neural ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Retrograde Markierung von retinalen Ganglienzellen im erwachsenen Zebrafisch mit Fluoreszenzfarbstoffen

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Single-cell RNA-Seq of Defined Subsets of Retinal Ganglion Cells

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for the improved understanding of neuronal diversity, it is important to identify genes whose expression defines various subpopulations of cells. The retina serves as an excellent model for the study of central nervous system diversity, as it is composed of multiple major cell types. The study of each major class of cells has yielded genetic markers that facilitate the identification of these populations. However, multiple subtypes of cells exist within each of these major retinal cell classes, and few of these subtypes have known genetic markers, although many have been characterized by morphology or function. A knowledge of genetic markers for individual retinal subtypes would allow for the study and mapping of brain targets related to specific visual functions and may also lend insight into the gene networks that maintain cellular diversity. Current avenues used to identify the genetic markers of subtypes possess drawbacks, such as the classification of cell types following sequencing. This presents a challenge for data analysis and requires rigorous validation methods to ensure that clusters contain cells of the same function. We propose a technique for identifying the morphology and functionality of a cell prior to isolation and sequencing, which will allow for the easier identification of subtype-specific markers. This technique may be extended to non-neuronal cell types, as well as to rare populations of cells with minor variations. This protocol yields excellent-quality data, as many of the libraries have provided read depths greater than 20 million reads for single cells. This methodology overcomes many of the hurdles presented by Single-cell RNA-Seq and may be suitable for researchers aiming to profile cell types in a straightforward and highly efficient manner.

Here, we present a combinatorial approach for classifying neuronal cell types prior to isolation and for the subsequent characterization of single-cell transcriptomes. This protocol optimizes the preparation of samples for successful RNA Sequencing (RNA-Seq) and describes a methodology designed specifically for the enhanced understanding of cellular diversity.

Einzelzell-RNA-Seq von definierten Subsets von Retinal-Ganglion-Zellen

The discovery of cell type-specific markers can provide insight into cellular function and the origins of cellular heterogeneity. With a recent push for ...

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in vivo&#8212;rapidly, repetitively, and at a high resolution. This protocol describes OCT imaging in the mouse retina as a powerful tool to study optic neuropathies (OPN). The OCT system is an interferometry-based, non-invasive alternative to common post mortem histological assays. It provides a fast and accurate assessment of retinal thickness, allowing the possibility to track changes, such as retinal thinning or thickening. We present the imaging process and analysis with the example of the Opa1delTTAG mouse line. Three types of scans are proposed, with two quantification methods: standard and homemade calipers. The latter is best for use on the peripapillary retina during radial scans; being more precise, is preferable for analyzing thinner structures. All approaches described here are designed for retinal ganglion cells (RGC) but are easily adaptable to other cell populations. In conclusion, OCT is efficient in mouse model phenotyping and has the potential to be used for the reliable evaluation of therapeutic interventions.

Optical Coherence Tomography: Imaging Mouse Retinal Ganglion Cells In Vivo

This manuscript describes a protocol for the in vivo imaging of the mouse retina with high-resolution spectral domain optical coherence tomography (SD-OCT). It focuses on retinal ganglion cells (RGC) in the peripapillary region, with several scanning and quantifying approaches described.

Optische Kohärenztomographie: Maus retinalen Ganglienzellen Zellen In Vivo Imaging

Structural changes in the retina are common manifestations of ophthalmic diseases. Optical coherence tomography (OCT) enables their identification in ...

Preparation of Mouse Retinal Cryo-sections for Immunohistochemistry

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for determining the mechanisms underlying retinal diseases. Maintaining structural integrity throughout the tissue preparation is vital for obtaining reproducible retinal IHC data but can be challenging due to the fragility and complexity of retinal cytoarchitecture. Strong fixatives like 10% formalin or Bouin's solution optimally preserve the retinal structure, they often impede IHC analysis by enhancing the background fluorescence and/or diminishing antibody-epitope interactions, a process known as epitope masking. Milder fixatives, on the other hand, like 4% paraformaldehyde, reduces background fluorescence and epitope-masking, meticulous dissection techniques must be utilized to preserve the retinal structure. In this article, we present a comprehensive method to prepare mouse ocular posterior cups for IHC that is sufficient to preserve most antibody-epitope interactions without loss of retinal structural integrity. We include representative IHC with antibodies to various retinal cell type markers to illustrate tissue preservation and orientation under optimal and sub-optimal conditions. Our goal is to optimize IHC studies of the retina by providing a complete protocol from ocular posterior cup dissection to IHC.

This report describes comprehensive methods for preparing frozen mouse retina sections for immunohistochemistry (IHC). Methods described include dissection of the ocular posterior cup, paraformaldehyde fixation, embedding in Optimal Cutting Temperature (OCT) media and tissue orientation, sectioning and immunostaining.

Vorbereitung von Maus-Retinal-Cryo-Sektionen für die Immunhistochemie

Preparation of high-quality mouse eye sections for immunohistochemistry (IHC) is critical for assessing the retinal structure and function and for ...

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury are essential for translating novel therapeutic strategies from rodent models to clinical application due to their closer similarities to humans in size and anatomy. Here we describe some in vivo methods to evaluate the function and structure of the retinal ganglion cells (RGCs) and optic nerve (ON) in large animals, including visual evoked potential (VEP), pattern electroretinogram (PERG) and optical coherence tomography (OCT). Both goat and non-human primate were employed in this study. By presenting these in vivo methods step by step, we hope to increase experimental reproducibility among different labs and facilitate the usage of large animal models of optic neuropathies.

In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals

Here we demostrate several in vivo tests (flash visual evoked potential, pattern electroretinogram and optic coherence tomography) in goat and rhesus macaque to understand the structure and function of the optic nerve and its neurons.

Im lebenden Organismus Methoden zur Beurteilung der Funktion und Struktur retinaler Ganglienzellen und Sehnerven bei Großtieren

The optic nerve collects axons signals from the retinal ganglion cells and transmits visual signal to the brain. Large animal models of optic nerve injury ...