Die Autoren möchten sich Ina Wolter für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung danken. VGAT-Venus transgenen Ratten wurden von Drs erzeugt. Y. Yanagawa, M. Hirabayashi und Y. in Kawaguchi Nationale Institut für Physiologische Wissenschaften, Okazaki, Japan, mit pCS2-Venus von Dr. A. Miyawaki vorgesehen.

Ethikerklärung: Alle Verfahren und Tier Wartung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Instituts durchgeführt, die deutsche Tierschutzgesetz hat der Europäische Rat die Richtlinie 86/609 / EWG über den Schutz von Tieren und Richtlinien von den lokalen Behörden (Berlin, T-0215/11 ) 1. Herstellung der Akute-Hippocampus <ol><li> Nehmen Sie ein transgenes Ratten (17 bis 24 Tage alt), die Leuchtstoff Venus / YFP Protein unter der VGAT Promotor, der die Mehrheit der kortikalen inhibitorischen Inter 13 Etiketten zum Ausdruck. Enthaupten die Ratte. Rasch zerlegen Gehirn (&lt;40 sec) in semifrozen, carbogenated (95% O 2/5% CO 2) auf Basis Saccharose künstliche Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF Saccharose, 1A). </li><li> Bewerten Sie die sezierten Rattenhirn für Venus / YFP Fluoreszenz mit einer 505 nm LED-Lampe und Emissionsfilter 515, auf einer Schutzbrille angebracht. </li><li> Entfernen Sie die Front Drittel des Kortex und Cerebellum; dann trennen die Halbkugeln, die alle mit einem Skalpell. Entfernen Sie die Rückenfläche des Kortex um eine flache Oberfläche, um das Gehirn zu kleben nach unten zu schaffen, wie zuvor beschrieben 14. </li><li> Geschnitten Querschnitt (300 um) des Hippocampus auf einer Vibratom sollten die Halbkugeln mit semifrozen umgeben sein, carbogenated Saccharose-ACSF (1B) 14. Entfernen Sie zusätzliche Regionen rostral Kortex, Mittelhirn und Hirnstamm. Übertragen Sie jede Scheibe zu einem untergetauchten Haltekammer, die Saccharose-ACSF, die carbogenated und erwärmt auf 35 ° C. </li><li> Lassen Sie die Scheiben bei 35 ° C für 30 min von der Zeit der letzten Scheibe in die erwärmte ACSF erholen. Tun Sie dies, um Stoffwechselprozesse zu aktivieren und erleichtern die Wiederverschließen geschnitten neuronale Prozesse. Dann übertragen auf Raumtemperatur für die Lagerung (Abbildung 1c). </li></ol> 2. Herstellung und Abfüllung von Aufnahme-Pipetten <ol><li> Pull Patchpipetten von Glaskapillaren, so dass eine Pipette Widerstand von 2-4 MOhm wird erreicht, wenn mit filtriert gefüllt (Spritzenfilter, Porengröße: 0,2 um) die intrazelluläre Lösung, die 0,1% Biocytin (für intrazelluläre Markierung). Halten Sie die intrazelluläre Lösung auf Eis gekühlt, um den Abbau seiner Bestandteile zu verhindern. </li><li> Füllen Patch-Pipetten zur Identifizierung von postsynaptischen Ströme mit einer Lösung, die eine physiologisch relevante niedrigen Cl - Konzentration (E R (Cl) = -61 mV, siehe Lösung Liste). </li><li> Für gepaarte Aufnahmen auf der präsynaptischen Rezeptor-vermittelten Reaktionen zu identifizieren, füllen Patch-Pipetten mit intrazellulären Lösung mit niedrigen Ca2 +-Pufferkapazität, um Interferenzen mit Transmitterfreisetzung präsynaptisch zu verhindern, sowie 4-fach höhere Cl - Konzentration (E R (Cl) = -20 mV) zur Verbesserung der Signal-zu-Rauschen der beobachteten IPSCs 5 was eine genaue Beurteilung der pharmakologischen bzw.onsiveness. Beachten Sie, dass Änderung Cl - Konzentration IPSC-Kinetik 15 ändern. </li></ol> 3. Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahme von FS-ins <ol><li> Carbogenate ACSF und Futtermittel durch das Perfusionssystem zu der Aufzeichnungskammer, mittels einer Schlauchpumpe (der auch entfernt von der Aufzeichnungs ACSF Kammer über eine Saugleitung, Figur 2A). Schalten Sie alle Geräte auf dem Setup in der Vorbereitung für die Aufnahme. </li><li> Übertragen einer Scheibe auf die Aufnahme Kammer und halten Sie ihn mit einem Platin-Ring mit einzelnen Fasern aus Seide bespannt. Positionieren Sie die Scheibe, so dass die Schicht (str.) Pyramidale der CA1 läuft vertikal durch das Sichtfeld, die den Zugang mit 2 Pipetten sowohl auf die str. radiatum und str. Oriens gleichzeitig (2C und 4A). </li><li> Legen Sie die Kammer in das Setup und starten Perfusion carbogenated und erwärmt (32-34 ° C) Aufnahme einesCSF bei einer Flußrate von 5-10 ml / min. </li><li> Beurteilen Scheibenqualität unter IR-DIC-Optik mit 40x Objektivvergrößerung und visualisieren mit einer CCD-Kamera auf einem Display angezeigt. Annehmen gutes Stück Qualität, wenn eine große Anzahl von runden, mäßig gegen CA1-Pyramidenzellen (CA1 PC) in str gesehen werden. pyramidale in einer Tiefe von 20-30 um unter einer glatten und leicht Kraterlandschaft (Abbildung 2C). Schlechte Qualität Scheiben enthalten eine große Zahl von sehr kontrast, geschrumpft oder geschwollene Zellen, mit einer unebenen Oberfläche Scheibe. </li><li> Identifizieren mutmaßlichen FS Inter unter Epifluoreszenz Beleuchtung wie die Venus auszudrücken / YFP (2B), mit großen multipolaren Somata in oder in der Nähe des str. pyramidale. Markieren Sie die Zellen einigermaßen tief in die Scheibe (50-100 um, 2C), um eine bessere Erhaltung ihrer morphologischen Integrität. </li><li> Montieren Sie den Aufnahme-Elektrode in der Pipette Halter auf der heads; dann Apply ein geringer positiver Druck (20-30 mbar) durch die Schlauchleitung. Senken der Pipette auf die Oberfläche der Scheibe, leicht zu dem Zentrum des Neurons ausgewählt versetzt. </li><li> Erhalten whole-cell-Konfiguration wie zuvor beschrieben, und 14,16 siehe auch Bilder in 2D und 2E: <ol><li> Zielen auf eine Zelle: Erhöhen Sie den Druck auf 70-80 mbar und schnell senken Sie die Pipette durch die Scheibe, gerade über die Soma der ausgewählten Zelle (Abbildung 2D, oben). </li><li> Nähern Sie sich dem Zell: Drücken Sie die Pipette gegen die Zellmembran erzeugen eine &quot;Delle&quot; auf sie (2D, oben). Führen Sie diesen Schritt schnell, um Biocytin Kennzeichnung von Nachbarzellen zu verhindern. </li><li> Erstellen Sie eine Giga-Ohm-Siegel: Lassen Sie den Druck und gleichzeitig gelten eine 20 mV Spannungsbefehl mit der Pipette. Ein Giga-Ohm-Dichtung (1-50 GOhm; 2D, unten und 2E Mitte) typicVerbündeten entwickelt sich schnell. Einmal versiegelt, gelten die zu erwartende Ruhemembranpotential (typischerweise zwischen -70 und -60 mV) als Spannungsbefehl. </li><li> Durchbrechen Sie den Patch: Einmal versiegelt, reißen die Membran-Patch mit einem kurzen Impuls von Unterdruck; wodurch die Gesamtzellkonfiguration (2E, unten) erreicht wird. </li></ol></li><li> Ausgleich Ganzzellkapazität und Serienwiderstand (R S). R s ist normalerweise 5-20 MOhm und stabil für bis zu 120 min. Aufzugeben, wenn Zellen Membranpotential (V M) auf Durchbruch ist mehr als -50 mV depolarisiert; R S anfänglich größer als 30 MOhm; oder R S um mehr als 20% im Verlauf der Aufzeichnung. </li><li> Identifizieren FS-Ins durch ihre Reaktion (im Current-Clamp-Modus) zu einer Familie von Hyperstromimpulse depolarisierende (-250 bis +250 pA, 2F, oben). FS-Ins haben relativ Verzehr V M (typischerweise -50 to -60 mV), kurze Membranzeitkonstante (&lt;20 ms) und auf einem 500 pA depolarisierende Strominjektion mit einem Zug von Aktionspotentialen (APs) bei Frequenzen&gt; 100 Hz 11 (2F, unten), die deutlich sind von denen in CA1 PCs (2F, Mitte). </li></ol> 4. Extrazelluläre Elektrostimulation GABA B R-vermittelte Antworten Evoke <ol><li> Um synaptisch hervorgerufenen Reaktionen zu beobachten, positionieren Sie eine extrazelluläre Stimulationselektrode (eine Patch-Pipette mit 2 M NaCl gefüllt; Widerstand: 0,1-0,3 MQ) in der Scheibe an der Grenze von str. radiatum und str. lacunosum-moleculare. Positionieren Sie die Elektrode 200-300 um lateral der Soma der direkten elektrischen Stimulation der Zelle zu verhindern und zu minimieren Stimulation Artefakten (3A). </li><li> Nachdem der Stimulationselektrode angeordnet ist, zu erhalten, Ganzzell-Aufzeichnungdie gewählte Zelle und Beurteilung der physiologischen Phänotyp in Current-Clamp-Modus, wie in Abschnitt 3.9 (3B). </li><li> Mit dem Neuron in Voltage-Clamp (V M -65 mV) aufgezeichnet, liefern elektrische Stimulation der präsynaptischen Axone bei 50 V (~ 500 uA wirksame Reiz) alle 20 sec, das eine isolierte Konstantspannungs Stimulator. Benutzen Reize (100 us Dauer, 3C, oben) zu GABA B R vermittelten IPSCs beobachten und zu verschachteln mit Zügen von mehreren Stimuli (bei ​​200 Hz) zu mehr Transmitterfreisetzung zu produzieren. </li><li> Bad gelten ionotropen Glutamat-Rezeptor-Antagonisten (AMPA-Rezeptor: DNQX [10 uM]; NMDA-Rezeptor: D-AP5 [50 uM]), um die isolierte monosynaptische IPSC (3C, in der Mitte oben) zu offenbaren. Ferner isolieren die GABA-vermittelte Ik R unter Anwendung eines GABA A R Blocker (gabazine [10 uM], 3C Mitte lower). </li><li> Bestätigen Sie die resultierende langsam Auswärtsstrom (3C niedriger, erweitert) als GABA B durch die anschließende Anwendung von CGP-55845 [5 uM] (3C unteren, grau unterlegt) R-vermittelten </li></ol> 5. Gekoppelte Aufnahmen von Synaptisch Gekoppelt FS-IN und CA1-PCs <ol><li> Beurteilen GABA B R-vermittelten präsynaptischen Steuerung inhibitorische synaptische Übertragung bei gleichzeitiger Aufnahme zwischen synaptisch-gekoppelt und PC Paaren durchgeführt, wie unten beschrieben. </li><li> Zuerst stellen Sie eine Ganzzell Aufnahme einer präsynaptischen Intern (wie in Abschnitt 3) und bestätigen Sie den FS-Phänotyp (4A). </li><li> Dann patchen eine benachbarte CA1 PC (20-100 um Abstand, 4A) und gelten kurze überschwelligen depolarisierende Strompulse (1 ms Dauer, 1-5 nA Amplitude) mit der präsynaptischen IN (in Current-Clamp-Modus gehalten werden), um APs zu entlocken. Wenn einem synaptischen Connection vorhanden ist, APs in der IN-Ergebnis in IPSCs in der CA1-PC, der Spannung-Klammer gehalten (Ausgleich R S bis etwa 80%). </li><li> Wenn nötig, füllen Sie eine neue Aufnahme-Elektrode und Datensatz aus weiter CA1-PCs, bis eine Verbindung gefunden. </li><li> Sobald eine Verbindung hergestellt ist, entlocken Paare von APs in der präsynaptischen FS-IN, sowohl die synaptische einheitliche Reaktion und das dynamische Verhalten zu beurteilen. Verwenden Sie einen typischen gepaart Puls-Protokoll von 2 depolarisierende Stimuli mit einer 50 ms-Intervall (4B). </li><li> Steuer sammeln Spuren im Ausgangsbedingungen. Dann gelten die selektiven GABA B-Agonisten Baclofen R (10 uM), um die Perfusion von ACSF aktiviert somit GABA B Rs, gefolgt von der Antagonist CGP-55845 (5 uM), um vollständig blockieren die Rezeptor vermittelten Wirkungen. Sammeln ~ 50 Spuren im stationären Zustand jedes Medikament Zustand (4B und C). </li><li> Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, dichten die somatischen Membran durch die Bildung eines outside-out-Patch: Ziehen Sie langsam die Pipette aus dem Zellkörper in V-Klemme und wie die R S steigt, verringern Sie die V bis -40 mV M. Tun dies, um die Bildung der Outside-out-Patches zu erleichtern; entfernen Sie dann die Pipette aus dem Bad. </li></ol> 6. Analyse der elektrophysiologischen Eigenschaften <ol><li> HINWEIS: Eine Vielzahl von verschiedenen Software-Pakete sind für den Erwerb von elektrophysiologischen Daten verfügbar. Hier WinWCP, ein Windows-Programm in der freien Software-Paket Strathclyde Elektrophysiologie verwendet, die Aufzeichnung von bis zu 16 Analogeingangskanäle und Ausgangs von 10 digitalen Signalen ermöglicht. </li><li> Tiefpassfilter alle Daten bei 5-10 kHz und Probe bei 20 kHz. </li><li> Analyse physiologischer Daten mit einer Offline-Analyse-Suite. HINWEIS: Stimfit, ein Open-Source-Software-Paket, das eine Python-Shell wird in diesem Fall verwendet wird, beinhaltet; aber andere Alternativen können leicht stattdessen verwendet werden. <ol><li> Analysieren Passivmembran pigenschaften der aufgezeichneten Neuronen, in Stromzange erworben, von Ruhemembranpotential. </li><li> Messung der mittleren Ruhemembranpotential von der Grundlinie der aufgezeichneten Antworten von dem Beginn der Aufzeichnung. </li><li> Berechnen Eingangswiderstand unter Verwendung des Ohmschen Gesetzes, aus der Spannung als Reaktion auf die kleinste Hyperpolarisierungsstromimpulse (≤ -50 pA). Zur Verbesserung der Signal-Rausch-Verhältnis, durchschnittlich mehrere Spuren. Hinweis: Unsere Beispiele sind in der Regel Durchschnittswerte von 10-50 einzelnen Sweeps. </li></ol></li><li> Schätzen Sie die scheinbare Membran Zeit durch den Einbau einer monoexponentiellen Kurve, um den Zerfall der Antworten auf die kleinste Hyperpolarisation Stromimpulse konstant. </li><li> Analysieren Aktionspotential Wellenform Schwelle, Amplitude (Schwelle zur Spitze) und Dauer (Breite gemessen in halber Höhe) von Schwellenwert depolarisierende Stromimpulse ausgelöst bestimmen. </li><li> Analysieren GABA B R vermittelten IPSCs von Voltage-Clamp-Aufnahmen. Filter zeichnet off-line zu500 Hz (Gauß-Filter) und bewertet die Spitzenamplitude und die Latenz des GABA B R vermittelte Reaktion (im Mittelwerte von mindestens 10 Spuren). </li><li> Erkennen die Wirkung von GABA B Rs auf der inhibitorischen Ausgang INs als eine Änderung der Spitzenamplitude des GABA A R-vermittelten IPSCs zwischen Peak und der vorhergehenden Ausgangswert gemessen. Berechnen Sie die mittlere Amplitude von ≥50 Spuren für die Steuerperiode und der stationären aller pharmakologischen Epochen. </li></ol> 7. Visualisierung und Immunocytochemistry der FS-Ins <ol><li> Nach den Aufnahmen, fixieren die Scheiben durch Eintauchen in 4% Paraformaldehyd mit 0,1 M Phosphatpuffer (PB, pH = 7,35) O / N bei 4 ° C. </li><li> Ggf. Scheiben kann PB für bis zu ca. 1 Woche vor der Verarbeitung übertragen und gespeichert werden. </li><li> Wasch Scheiben reichlich frische PB und anschließend in 0,025 M PB mit 0,9% NaCl (PBS, pH = 7,35). </li><li> Um nicht-spezifische Antikörper Bindung zu reduzieren, blockieren die Scheiben for 1 h bei RT in einer Lösung mit 10% normalem Ziegenserum (NGS), 0,3% Triton-X100 (ein Detergens, Membranen durchdringbar) und 0,05% NaN 3 in PBS hergestellt. </li><li> Für PV Ausdruck kennzeichnen, verwendet eine Anti-PV monoklonalen Maus-Antikörpers in einer Lösung, die 5% NGS, 0,3% Triton-X100, 0,05% NaN 3 in PBS verdünnt. Inkubieren Primärantikörper für 2-3 Tage bei 4 ° C 12. Spülen Sie gründlich in PBS Scheiben. </li><li> Anwenden fluoreszierenden Anti-Maus-Sekundärantikörper (zB AlexaFluor-546.) Zusammen mit dem Biotin-Bindungsprotein Streptavidin, konjugiert an ein Fluorochrom (zB AlexaFluor-647); und Inkubation in einer Lösung, enthaltend 3% NGS, 0,1% Triton-X100, 0,05% NaN 3, verdünnt in PBS und Inkubation O / N bei 4 ° C ist. </li><li> Zügig spülen Scheiben 2-3 x mit PBS, gefolgt von 2-3 Spülungen in PB. Montieren Sie die Scheiben auf Glasobjektträger. Verwenden Sie ein 300 um Agar Abstandshalter an der Scheibe vor dem Kollaps zu verhindern. Deckglas Scheiben mit einer LeuchtstoffCent Montagemedium und Dichtung mit Nagellack. </li></ol> 8. Imaging und Rekonstruktion der Visualisierte FS-Ins <ol><li> Visualisieren Sie die Scheiben mit einem konfokalen Mikroskop, mit dem Reporter aufgeregt fluorochome mit der entsprechenden Laserlinie (635 nm Diodenlaser für AlexaFluor-647; Helium-Neon-543 nm-546 für AlexaFluor Kennzeichnung für PV-und Argon 488 oder 515 nm für Venus / YFP). </li><li> Aufnehmen von Bildern an einer geeigneten Z-Auflösung (typischerweise 0,5-1 um Schritte mit einem 20x-Objektiv), um ein Z-Stapel von der ganzen Zelle zu erzeugen. Mehrere Stapel werden üblicherweise Bildes benötigt die gesamte Zelle, die digital off-line unter Verwendung Fiji / ImageJ Software (5A) genäht werden kann. </li><li> Rekonstruieren die Zelle aus dem Bildstapel genäht mit einem halbautomatischen Ablaufverfolgungsmethode (Simple Neuriten Tracer-Plugin in Fiji / ImageJ-Software-Paket 17, Bild C). </li><li> Schließlich bewerten die PV-Immunreaktivität des interneuron mit einer hohen numerischen Apertur Objektivlinse (60X siliciumSion, NA = 1,3). Machen Sie Bilder des Soma, proximalen Dendriten und Axon proximalen oder alternativ von Axonterminalen wenn somatische Auswaschen der PV ist zu stark. Zellen werden als immunreaktiv für PV, wenn Immunmarkierung ist zu sehen, mit den Biocytin-markierten Strukturen (5B) auszurichten. </li></ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Wir beschreiben eine Methode, die elektrophysiologische und neuroanatomische Techniken kombiniert, um funktionell zu charakterisieren morphologically- und neurochemisch identifizierten Neuronen in vitro; insbesondere die verschiedenen Arten von kortikalen inhibitorischen Ins. Schlüsselaspekte des Verfahrens sind: (1) Vorauswahl der potenziellen IEE; (2) die intrazelluläre Aufnahme und Neuron Visualisierung; und schließlich (3) morphologische und immunzytochemische Analyse von aufgezeichneten Ins. Obwohl diese Studie ...

Hippocampus neuronale Schaltkreise sind seit langem Gegenstand intensiver Kontrolle, sowohl in Bezug auf die Anatomie und Physiologie, die aufgrund ihrer wesentlichen Rolle bei Lernen und Gedächtnis sowie räumliche Navigation bei Mensch und Nager. Ebenso die prominenten, aber einfache laminare Organisation des Hippocampus macht diese Region zu einem beliebten Thema der Studien zu strukturellen und funktionellen Eigenschaften der kortikalen Netzwerke. Hippocampus-Schaltungen sind von exzitatorischen Hauptzellen (&gt; 80%) und einer kleineren (10-20%), aber sehr unterschiedliche Gruppe von hemmenden Inter 1-3 besteht. Interfrei γ-Aminobuttersäure (GABA) aus ihrer Axonterminalen, die bei schnellen ionotropen GABA A-Rezeptoren wirkt (GABA A Rs) und langsamen metabo GABA-B-Rezeptoren (GABA B Rs) 4. Diese inhibitorischen Mechanismen entgegenzuwirken Anregung und regulieren deren Erregbarkeit der Hauptzellen und damit dieir Timing und Muster der Entladung. GABA von Inter freigegeben wirkt jedoch nicht nur von den Hauptzellen, sondern auch auf die Inter sich 5,6. Pre-und postsynaptischen Rezeptoren vermitteln Feedback-Regulation und hemmenden Wechselwirkungen zwischen den verschiedenen Arten von Interneuron. Diese hemmenden Mechanismen im Intern Netzwerke sind vermutlich zentral für die Erzeugung und Gestaltung der Bevölkerung Aktivitätsmustern, insbesondere Schwingungen zu sein bei verschiedenen Frequenzen 7. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufzeichnung ist eine gut etablierte Methode für die Prüfung der Eigenschaften und der synaptischen Interaktion von Neuronen. Aufgrund der hohen Vielfalt Interntypen, die Untersuchung von hemmenden Inter erfordert jedoch strenge Identifizierung der Zellen aufgenommen. Wie Hippocampus Interntypen werden durch verschiedene morphologische Merkmale und neurochemische Marker Ausdruck, kombiniert anatomischen und immunzytochemische e gekennzeichnetxamination kann ein Mittel, um präzise Intern Identität 6,8,9 zu bestimmen. In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir einen experimentellen Ansatz, in der Ganzzell Patch-Clamp-Aufnahmen von einzelnen Neuronen oder synaptisch gekoppelten Paare werden mit intrazelluläre Markierung kombiniert, gefolgt von Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse, so dass für die Charakterisierung von langsam GABA B Rezeptor-vermittelte hemmende Wirkung in Inter identifiziert. Als ein Beispiel, konzentrieren wir uns auf eine wichtige Art der Intern, einer Untergruppe der so genannten &quot;Korbzellen&quot; (BC), die die Soma und proximalen Dendriten der postsynaptischen Zielinnerviert und wird von einem &quot;schnellen Spick&quot; (FS) gekennzeichnet entladen Muster, ein Axon dicht auf den Zellkörperschicht, und die Expression des Calcium-bindende Protein Parvalbumin (PV) 10,11. Diese Inter anzuzeigen große postsynaptischen inhibitorischen Ströme, sowie prominente vorgesynaptischen Modulation der synaptischen Ausgang in Reaktion auf GABA B-Aktivierung R 12. Die Kombination der hier beschriebenen Techniken können ebenso gut eingesetzt werden, um intrinsische oder synaptischen Mechanismen in einer Vielfalt von anderen identifizierten Neuron Typen zu untersuchen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="725">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:175px;">Name</td>
			<td style="width:148px;">Company</td>
			<td style="width:152px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:251px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Transgenic vGAT-venus rats</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">see Uematsu et al., 2008</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Venus (515&#160;nm) goggles</td>
			<td style="width:148px;">BLS Ltd., Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Dissection tools</td>
			<td style="width:148px;">i.e. FST</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">For brain removal</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Vibratome</td>
			<td style="width:148px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">VT1200S</td>
			<td style="width:251px;">Or other high end vibratome with minimal vertical oscillation</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Slice holding chambers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Upright IR-DIC microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">BX50WI</td>
			<td style="width:251px;">With micromanipulator system; i.e. Luigs and Neumann, Kleindiek etc.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CCD camera</td>
			<td style="width:148px;">Till Photonics</td>
			<td style="width:152px;">VX55</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">505 nm LED system</td>
			<td style="width:148px;">Cairn Research</td>
			<td style="width:152px;">OptiLED system</td>
			<td style="width:251px;">Or mercury lamp or other LED system i.e. CooLED.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Multiclamp 700B&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Axon Instruments</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:251px;">Alternatively 2x Axopatch 200B amplifiers&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">WinWCP acquisition software</td>
			<td style="width:148px;">John Dempster, Strathclyde University</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any quality acquisition software could be used, i.e. EPHUS, pClamp, Igor etc.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Electrode Puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter</td>
			<td style="width:152px;">P-97</td>
			<td style="width:251px;">Used with box-filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Borosilicate pipette glass</td>
			<td style="width:148px;">Hilgenberg, Germany</td>
			<td style="width:152px;">1405020</td>
			<td style="width:251px;">2&#160;mm outer, 1&#160;mm inner diameter, no filament</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:148px;">Gilson</td>
			<td style="width:152px;">Minipuls</td>
			<td style="width:251px;">Other pumps or gravity feed could be used instead</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Thermometer</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Custom made</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Digital Manometer</td>
			<td style="width:148px;">Supertech, Hungary</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;">Isolated constant voltage stimulator</td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Digitimer, Cambridge</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">DS-2A</td>
			<td rowspan="2" style="width:251px;">-</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="34" rowspan="2" style="height:34px;width:175px;"><a name="RANGE!A19:D34">Biocytin</a></td>
			<td rowspan="2" style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td rowspan="2" style="width:152px;">B1592</td>
			<td rowspan="2">Otherwise known as &#949;-Biotinoyl-L-Lysine&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DL-AP5(V) disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120271</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">DNQX disodium salt</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120169</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively NBQX or CNQX</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Gabazine (SR95531)</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120042</td>
			<td style="width:251px;">Alternatively bicuculline methiodide</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">R-Baclofen</td>
			<td style="width:148px;">Abcam Biochemicals</td>
			<td style="width:152px;">ab120325</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">CGP-55,845 hydrochloride</td>
			<td style="width:148px;">Tocris</td>
			<td style="width:152px;">1248</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Streptavidin 647</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">S32357</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-PV mouse monoclonal antibody</td>
			<td style="width:148px;">Swant, Switzerland</td>
			<td style="width:152px;">235</td>
			<td style="width:251px;">Working concentration 1:5000-1:10,000</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">anti-mouse secondary antibody&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:152px;">A11030</td>
			<td style="width:251px;">If using Venus or GFP rodent using a red-channel (i.e. 546 nm) is advisable.</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Normal Goat Serum</td>
			<td style="width:148px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:152px;">S-1000</td>
			<td style="width:251px;"></td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Microscopy slides</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Any high quality brand&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Glass coverslips</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Usually 22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Agar spacers</td>
			<td style="width:148px;">-</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">Agar block, cut on vibratome to 300 &#956;m</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:175px;">Laser scanning confocal microscope</td>
			<td style="width:148px;">Olympus, Japan</td>
			<td style="width:152px;">Fluoview FV1000</td>
			<td style="width:251px;">Or other comparable system</td>
		</tr>
		<tr height="17">
			<td height="17" style="height:17px;width:175px;">Fiji (Fiji is just ImageJ)</td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:152px;">-</td>
			<td style="width:251px;">See Schindelin et al., 2012</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-cell patch-clamp recordings from morphologically- and neurochemically-identified hippocampal interneurons

GABAergen inhibitorischen Inter spielen eine zentrale Rolle in neuronalen Schaltkreisen des Gehirns. Inter umfassen eine kleine Teilmenge der neuronalen Population (10-20%), zeigen aber eine hohe physiologische, morphologische und neurochemische Heterogenität, was ihre vielfältigen Funktionen. Daher Untersuchung von Inter bietet wichtige Einblicke in die Organisationsprinzipien und Funktion neuronaler Schaltkreise. Dies erfordert jedoch einen integrierten physiologischen und neuroanatomische Ansatz für die Auswahl und Identifizierung der einzelnen Interntypen. Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen von akuten Hirnschnitten von transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine ​​unter den Promotoren von Internspezifische Marker, ein effizientes Verfahren zur gezielten elektrophysiologisch zu charakterisieren intrinsischen und synaptischen Eigenschaften bestimmter Interntypen. Verbindung mit intrazellulären Farbstoff Kennzeichnung kann dieser Ansatz mit post-hoc mo verlängertrphological und immunzytochemische Analyse zur systematischen Identifizierung von aufgezeichneten Neuronen. Diese Verfahren können angepaßt werden, um eine breite Palette von wissenschaftlichen Fragen zu funktionellen Eigenschaften der verschiedenen Arten von kortikalen Neuronen entsprechen.

Vorausgesetzt, dass Scheibenqualität ist spürbar gut, die Aufnahme von beiden CA1-PCs und FS-Ins können mit minimalen Schwierigkeiten erreicht werden. Die transgenen Rattenlinie, Venus / YFP unter der VGAT Promotor 13 nicht eindeutig identifizieren FS-Ins oder auch BC. Allerdings Aufnahmen von INS in und um str. pyramidale, wo die Dichte der FS-ins ist typischerweise hoch 1, ergibt sich eine hohe Wahrscheinlichkeit der Auswahl FS-Ins (2B). FS-Ins durch ihre charakterist...

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Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

whole-cell-patch-clamp-recordings-from-morphologically

Research

JoVE Journal

Neuroscience

24.3K Aufrufe.  Charité Universitätmedizin.  Kortikaler Netzwerke werden von einem kleinen, aber vielfältige Reihe von hemmenden Inter gesteuert. Funktionelle Untersuchung von Inter erfordert daher gezielte Aufnahme und strenge Identifizierung. Hier beschrieben wird, ist ein kombinierter Ansatz, der Ganzzellableitungen von einzelnen oder synaptisch gekoppelten Paare von Neuronen mit intrazelluläre Markierung, Post-hoc-morphologische und immunzytochemische Analyse. 

Serie: Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Patch Clamp Messungen von Mouse Netzhautneuronen in einem Dark-Scheiben angepasst Vorbereitung

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated from a variety of species have been described previously1-4 but this video represents the first application of those techniques to hair cells from zebrafish. Here we demonstrate a method to isolate healthy, intact hair cells from all of the inner ear end-organs: saccule, lagena, utricle and semicircular canals. Further, we demonstrate the diversity in hair cell size and morphology and give an example of the kinds of patch clamp recordings that can be obtained. The advantage of the use of this zebrafish model system over others stems from the availability of zebrafish mutants that affect both hearing and balance. In combination with the use of transgenic lines and other techniques that utilize genetic analysis and manipulation, the cell isolation and electrophysiological methods introduced here should facilitate greater insight into the roles hair cells play in mediating these sensory modalities.

The purpose of this video is to demonstrate procedures for obtaining healthy, intact hair cells from the inner ear organs of adult zebrafish and then using them for patch clamp studies aimed at characterizing the biophysical properties of their voltage-gated channels.

Patch-Clamp-Aufnahmen im inneren Haarsinneszellen Isoliert von Zebrafisch

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

It has been demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to elicit electrical responses in neural tissue, independent of any further modification of the target tissue. Infrared neural stimulation has been reported in a variety of peripheral and sensory neural tissue in vivo, with particular interest shown in stimulation of neurons in the auditory nerve. However, while INS has been shown to work in these settings, the mechanism (or mechanisms) by which infrared light causes neural excitation is currently not well understood. The protocol presented here describes a whole cell patch clamp method designed to facilitate the investigation of infrared neural stimulation in cultured primary auditory neurons. By thoroughly characterizing the response of these cells to infrared laser illumination in vitro under controlled conditions, it may be possible to gain an improved understanding of the fundamental physical and biochemical processes underlying infrared neural stimulation.

Infrared nerve stimulation has been proposed as an alternative to electrical stimulation in a range of nerve types, including those associated with the auditory system. This protocol describes a patch clamp method for studying the mechanism of infrared nerve stimulation in a culture of primary auditory neurons.

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subzellulärer Patch-Clamp-Aufnahmen aus der somatodendritische Domain nigraler Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.

Ganzzellige Patch-Clamp-Aufnahmen zur elektrophysiologischen Bestimmung der Ionenselektivität in Channelrhodopsinen

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate ...

Auditory Brainstem Response and Outer Hair Cell Whole-cell Patch Clamp Recording in Postnatal Rats

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to amplify the weak vibration of low-level sound signal. The morphology and electrophysiological property of outer hair cells (OHCs) develop in early postnatal ages. The maturation of outer hair cell may contribute to the development of the auditory system. However, the process of OHCs development is not well studied. This is partly because of the difficulty to measure their function by an electrophysiological approach. With the purpose of developing a simple method to address the above issue, here we describe a step-by-step protocol to study the function of OHCs in acutely dissociated cochlea from postnatal rats. With this method, we can evaluate the cochlear response to pure tone stimuli and examine the expression level and function of the motor protein prestin in OHCs. This method can also be used to investigate the inner hair cells (IHCs).

This protocol describes methods to record the auditory brainstem response from postnatal rat pups. To examine the functional development of outer hair cells, the experimental procedure of whole-cell patch clamp recording in isolated outer hair cells is described step-by-step.

Auditory Brainstem Response und äußeren Haarzellen Whole-Cell Patch Clamp Aufnahme bei postnatalen Ratten

The outer hair cell is one of the two types of sensory hair cells in the mammalian cochlea. They alter their cell length with the receptor potential to ...