We would like to thank the members of the Montgomery and Madison labs for helpful discussion. We acknowledge the funding received from the following sources in this research: NFNZ, AMRF, Marsden Fund, HRC, and NIH.

Tierethikerklärung: Die in dieser Handschrift beschriebenen Protokolle folgen den Richtlinien der Tierpflege von der University of Auckland und der Stanford University gegründet. P7 Rattenjungen wurden durch schnelle Enthauptung getötet. Hippocampus-Präparation wird dann sofort durchgeführt, wie unten beschrieben. 1. Organotypische hippokampalen Slice-Kultur <ol><li> Vorbereitung <ol><li> Bereiten Dissektion Medium (nur für das Gehirn sezieren verwendet wird). Kombinieren 200 ml Minimum Essential Medium mit 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 5 ml HEPES-Pufferlösung, 2 ml 1 M Tris-Stammlösung (pH 7,2) und sterilfiltriert mit 0,22 um-Filter . Zuführen Hippocampus Dissektion in eiskaltem Dissektion Medium. </li><li> Kühlen Sie die Dissektion Medium. Platzieren Sie die Dissektion Medien im Gefrierfach etwa 1 Stunde vor dem Beginn der Präparation, bis die Flüssigkeit sehr kalt ist. Sie ermöglichen große Eis cr nichtystals zu bilden. Lagerung auf Eis, bis sie benötigt. </li><li> Bereiten Kulturmedium (für alles verwendet, außer Dissektion der Hippocampus). Kombinieren 100 ml Minimum Essential Medium (1x Konzentration, Flüssigkeit) w / Hank-Salze, W / L-Glutamin, 2 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung (flüssig, 10.000 Einheiten jeweils in 0,85% NaCl), 2,5 ml HEPES 1 M Puffer Lösung, 50 ml Hanks Balanced Salt Solution, 50 ml Pferdeserum (definiert, Hitze inaktiviert) und Filter zu sterilisieren mit 0,22 um Filter. </li><li> Bereiten Sie die Kulturschalen. Platz 1 ml Kulturmedium pro 35 mm Kulturschale, und fügen Sie eine Membraneinsatzes zu jedem Gericht. Zu sieben dieser Gerichte Aufmachungen in eine 150 mm Petrischale (bezeichnet als &quot;Platte&quot; genannt). Die Platte wird in einem CO 2-Inkubator für mindestens eine Stunde, bevor die Dissektion beginnt, so dass das Kulturmedium in den Gerichten erreicht die richtige Temperatur und pH-Wert. </li></ol></li><li> Präparation der Hippocampi von Rattenjungen am postnatalen Tag 7 (P7) <ol><li> Pre-sterilisieren alle Dissektionswerkzeuge unter UV-Licht vor dem Eingriff. </li><li> Nach schneller Enthauptung, entfernen Sie das Gehirn und Ort in gekühlte Medium in eine Schüssel, und entfernen Sie sie dann auf ein Stück feuchten Filterpapier für die Dissektion. Necken die Rinde vom Mittelhirn mit stumpfen glatten Kunststoff-beschichtet Miniatur-Spatel, Aussetzen des Hippocampus. Schneiden Sie das Scheidengewölbe, und dann sanft zu arbeiten den Spatel unter dem Hippocampus, sie ausflippen (Abbildung 1A). HINWEIS: Erfolgreiche Schnittkulturen kann mit Tieren bis P10 hergestellt werden. </li><li> Schneiden Sie die isolierten Hippocampus weg vom Rest des Gehirns. Übertragen Sie die hippocampi in eine neue Kaltschale mit Dissektion Medien mit einem angefeuchteten weichen Pinsel (zB weiß Zobel # 4). </li><li> Reinigen Sie die Unterseite (dh der flacheren Seite) des Hippocampus von Plexus bei der Präparation, da diese schwammig, meninge artigen Gewebe machen es schwierig, Hippocampus trennenScheiben voneinander später. HINWEIS: Lassen Sie diese Gewebe an Ort und Stelle, wenn sie nicht entfernt sanft gehänselt werden. </li><li> Führen Sie die gesamte Präparation so schnell wie möglich, ohne den Hippocampus. HINWEIS: Eine sorgfältige Präparation ist wichtiger als ein schnelles, solange die Versuchsbedingungen gekühlt werden. Schneiden Sie die hippocampi von drei Ratten gleichzeitig. Die Scheibe Gesundheit nicht beeinträchtigt wird, solange die Gesamtzeit vom Start bis zum, wenn die plattierten Scheiben in den Brutschrank gehen, ist unter 30 min. </li></ol></li><li> Slicing <ol><li> Schneiden Sie die hippocampi quer in 400 um Querschnitte mit einem manuellen Gewebeschneidemaschine. Das Verfahren, mit dem die Schneiddurchgeführt wird, nicht wichtig, so lange es nicht allzu schädlich für das Gewebe und erzeugt Scheiben mäßige Dicke mit gut sichtbaren Schichtarchitektur (dh Ammons ist leicht zu sehen, um in dem Gewebe erhalten werden). </li><li> Liegen die hippocampi auf der Bühne des GewebesChopper auf der Spitze eines dreifache Dicke der # 2-Filterpapier. Der Hippocampus sind vollständig, ohne irgendwelche Scheiben einzeln (; eher wie Laibe Brot in Scheiben geschnitten an dieser Stelle; 1B dh die gesamte Hippocampus ist auf der Bühne des Häckslers nach links, bis alle Schnitte vorgenommen wurden) in Scheiben geschnitten. </li><li> Übertragen Sie die hippocampi in Dissektion Medium mit einem weichen Pinsel zu jedem Hippocampus fest nächsten (weiß Zobel # 2). Drücken Sie vorsichtig jeweils Hippocampus zur Seite, um die Haftung zwischen dem Hippocampus und dem zugrunde liegenden Filterpapier brechen. Rollen Sie die Bürste unter jedem Hippocampus, um ihn abzuholen von der Bühne. Legen Sie alle hippocampi in den gleichen 35 mm Petrischale von gekühlten Dissektion Medium. Trennen Sie die hippocampi in einzelnen Scheiben durch manuelles Bewegen der Schale in Wechselstrom und gegen den Uhrzeigersinn Bewegungen. </li><li> Überprüfen Sie die Scheiben unter einem Binokular und entsorgen Sie alle, die beschädigt sind, klein, bzw. nicht deutlich sichtbar Zelle besitzenKörperschichten. HINWEIS: Es wird oft der Fall, dass nicht alle Schichten erfolgreich von ihrer Geschwister auf diese Weise getrennt werden. In diesem Fall können sie, indem sie sie auf der Kante und Drängen sie mit den Spitzen der feinen Pinzette abgetrennt werden. &quot;Gut&quot; Scheiben werden dann mit einem anderen sauberen Petrischale mit gekühltem Dissektion Medium unter Verwendung eines abgeschnitten und feuerpolierten Pasteurpipette (1C-E) übertragen. </li></ol></li><li> Lagerung <ol><li> Legen Sie die einzelnen Scheiben auf die Membranfilter-Einsätze. Mit einer Pasteurpipette abgeschnitten und Feuer poliert, um eine größere Bohrung geben, individuell Scheiben Transfer zu den Kultur-Einsätze. HINWEIS: Die Größe der Bohrung erzeugt wird, wenn das Schneiden und Feuerpolieren der Pipette ist wichtig. Zu klein und die Scheiben nicht so schnell verlassen die Pipette für die Membran. Zu groß, und die überschüssige Flüssigkeit auf der Oberfläche der Membran zusammen mit der Scheibe platziert. Die beste Bohrungsdurchmesser ist in der Regel etwa die Hälfte der diamMesser des Zylinders der Pipette. Beim Schneiden kann dieser Durchmesser durch Schneiden an der richtigen Stelle auf dem Kegel der Pipette gewählt werden. </li><li> Slice Überweisung <ol><li> Füllen Sie die Pipette mit Medium zuerst, und dann saugen eine einzelne Scheibe mit kleinen Saugkraft. Dies hält die Scheibe in der Nähe der Öffnung der Pipette und verhindert, dass zu viel Medium Vertreibung in den Einsatz, um die Scheibe zu platzieren. </li><li> Tragen Sie einen leichten Druck auf die Lampe, um einen kleinen hängenden Tröpfchen zu bilden, damit die Scheibe in diese Tröpfchen zu regeln, und berühren Sie diese Tröpfchen an der Membran und lassen Sie die Scheibe &quot;Fall&quot; auf die Membran. Regel drei Scheiben werden auf jeder Membran Einsatz gelegt. Hinweis: Wenn der Flüssigkeitströpfchen zu groß ist, werden die Tröpfchen von den drei Scheiben neigen dazu, auf der Membranoberfläche zu verschmelzen, und die Scheiben werden somit alle mit der Mitte der Membran zu sammeln, so dass es schwierig ist, sie für elektrophysiologische Aufzeichnung später zu trennen. </li></ol></li><li> Flüssigkeit Removal <ol><li> Saugen Sie überschüssiges Medium aus der Spitze der Kulturplatte Einsatz für alle Scheiben in dieser Platte (3 Scheiben pro Einsatz = 21 Scheiben pro Platte), so dass Scheiben sind nicht eingetaucht oder durch einen Pool von Dissektion Medium umgeben. </li><li> Führen Sie dies mit einer ungeschnittenen, aber feuerpolierten Pasteurpipette. Lassen Sie die Scheibe, um sich niederzulassen und sich an die Membran für eine Minute vor dem Pipettieren. Achten Sie darauf, die Scheibe bis in die Pipette zu saugen. Durchführung des Flüssigkeitsentzugs für die Einsätze, die zuerst vernickelt werden, um genügend Zeit für die Scheiben absetzen können. </li></ol></li><li> Scheibe Lagerung <ol><li> Speicher Scheibe Kulturen in einem 5,0% CO 2 Inkubator bei 37 ° C aufweist. Beachten Sie die endgültige Anordnung der Kulturen in 1E. Die einzelnen Scheiben ruhen auf einer Kulturplatte Einsatz, der eine poröse Membran eine Unterseite hat, und dieser Einsatz passend in einer Petrischale mit einer kleinen Menge an Medium gefüllt ist; auf diese Weise werden die Scheiben nicht in der mir eingetauchtdium, aber keinen Zugriff auf sie nur durch die Membran am Boden des Kulturplatteneinsatz. </li><li> Optional, entfernen Sie die Scheiben kann für das Studium entweder durch Entfernen des Kulturplatteneinsatz oder durch Ausschneiden eines Abschnitts des Einsatzes Membran, die eine Scheibe. </li></ol></li></ol></li><li> Wartung <ol><li> Tauschen Sie das Medium in den Petrischalen der Tag nach der Herstellung Kulturen. Übertragen der Kulturplatte einfügen, um eine neue Petrischale mit 1 ml frisches Kulturmedium, das in dem Inkubator für mindestens eine Stunde vor der Übertragung ins Gleichgewicht gebracht wird. </li><li> Ändern das Medium wieder in der gleichen Weise am dritten Tag nach der Herstellung Kulturen. Am dritten Tag, übertragen Sie die Kulturen zu einem Brutschrank bei 34 ° C eingestellt. Ändern Sie das Medium zweimal pro Woche (alle 3-4 Tage). </li><li> Identifizieren gesunden Kulturen. Wählen Sie gesunde Kulturen für gepaarte ganze Zelle Aufnahmen. HINWEIS: Gesunde Kulturen haben eine gut definierte Kante und eine klar definierte pyramidalen Zellschicht. Kulturen Witzh dunkel (wahrscheinlich nekrotischen) Flächen vorhanden sind oder ein vakuolisiertes Aussehen mit abgeflachten Grenzen zurückgewiesen werden. Der Einsatz dieser Kriterien sind in der Regel zwei Drittel der Schnittkulturen ausreichend gesund für die Aufnahme. </li><li> Nutzen Sie diese Kulturen in einem ziemlich kleines Zeitfenster. Nicht verwendeten Gewebe, die für mehr als zwei Wochen kultiviert werden, da die Nervenzellen beginnen, leicht epileptiforme Verhalten, das sich langsam verschlechtert sich mit der Zeit zeigen. Die genaue obere Grenze der neuronalen Überlebens ist nicht bekannt, aber es ist möglich, von dem Funktionieren Pyramidenzellen so spät wie 16 Wochen Kultur zu erfassen. </li></ol></li></ol> 2. Gepaart ganze Zelle Recordings <ol><li> ACSF und der intrazelluläre Lösungen <ol><li> Vorbereitung präsynaptischen Elektrodenlösung durch Mischen (in mM) 120 Kaliumgluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit KOH; Osmolarität: 290 mOsm). Während der gleichen Elektroden Lösung wird postsynaptischen Neuronen, Cäsium-Gluconat verwendet (120 mM) Wird in der Regel als Haupt Salz in der postsynaptischen Elektrode, plus 5 mM QX314 eingesetzt. HINWEIS: Diese ermöglicht eine stabile Spannungsklemm bei positiven Potentialen zu postsynaptischen NMDAR-vermittelten Ströme 8-10,13 aufzeichnen. Es verhindert auch das Kalium-induzierten Übererregbarkeit des präsynaptischen Neurons durch die interne Lösung aus der postsynaptischen Aufzeichnungselektrode fließt, bevor ein Giga-Ohm-Dichtung gemacht. </li><li> Vorbereitung postsynaptischen Elektrodenlösung Zusammen (in mM) 120 Cäsium-Gluconat, 40 HEPES, 5 MgCl 2, 5 QX314, 2 NaATP und 0,3 NaGTP (pH 7,2 mit CsOH, Osmolarität: 290 mOsm). Ziehen Glasmikroelektroden 5-10 MOhm Widerstand und füllen mit gefiltertem interne Lösung. </li><li> Vorbereitung künstlicher Zerebrospinalflüssigkeit (ACSF) Komposition (in mM) 119 NaCl, 2,4 KCl, 1,3 MgSO 4, 2,4 CaCl 2, 1 Na 2 HPO 4, 26,2 NaHCO 3, 11 Glucose, pH 7,4, mit 95% O 2, 5 gesättigte % CO 2. HINWEIS: Wenn AMPAR-vermittelte rAHMEN müssen für die Prüfung der NMDAR EPSCs blockiert werden, gehören 10 uM CNQX oder NBQX in der ACSF. </li></ol></li><li> Erhalten Gekoppelte ganze Zelle Recordings <ol><li> Synaptische Übertragung zwischen zwei einzelnen Neuronen zu untersuchen, bezeichnen ein Neuron als der präsynaptischen Neuron und halten in Stromzange an Aktionspotentiale auslösen und initiieren die synaptische Übertragung. </li><li> Bestimmen Sie die zweite Neuron, wie der postsynaptischen Neuron, und halten Sie sie in Strom oder Spannung Klemme abhängig von der vom Forscher erforderlichen Informationen. Erhalten detaillierte Untersuchung der glutamatergen Strömungen, bei -65 mV mit sucht AMPAR-vermittelte EPSCs und NMDAR-vermittelte EPSCs bei +30 mV 6-16 sucht, indem die postsynaptischen Neuron in Spannungsklemme </li><li> Stellen Sie eine gepaart Aufnahme. Um eine Aufnahme zu etablieren gepaart wird der präsynaptischen Zelle ganze Aufnahme immer zuerst gewonnen, so dass mehrere aufeinander folgende postsynaptischen Neuronen, bis eine, die synaptisch ist connecte erhalten werdend erhalten wird. Bei Durchführung der synaptischen Plastizität Experimente ist es besonders wichtig, das präsynaptische Neuron zuerst als die Induktion von LTP in dem postsynaptischen Neuron müssen innerhalb von 10 min zum Erhalt der ganzen Zelle Aufnahmen Auswaschen der cytoplasmatischen Faktoren für LTP 8,19 erforderlich verhindern eingeleitet werden erhalten. </li><li> Vermeiden Sie Bewegung induzierten Zellverlust. Eine große Herausforderung bei der Durchführung gepaart ganze Zellableitungen wird die Vibration und Bewegung-induzierte Störung der ersten ganzen Zelle Aufnahme während den Erhalt der zweiten Aufnahme zu vermeiden. <ol><li> Erhalten die ersten Ganzzellaufnahme und bewegen Sie dann den Mikroskop-Objektiv 10-200 um in der x-Achse, so dass die etablierte Aufzeichnung wird am Rand der Fläche auf dem Monitor (2A) sichtbar entfernt. </li><li> Heben Sie die Linse des Mikroskops ~ 5-10 mm, während sichergestellt wird, dass die ACSF noch Kontakt mit der Linse hält. Montieren Sie die zweite Elektrode und führen in die Flüssigkeit Meniskus (2B </sTrong&gt;). </li><li> Bewegen der Elektrode in der xy-Ebene, bis er sich direkt unter der Lichtweg durch die Linse, aber immer noch deutlich über dem festgelegten Aufzeichnungselektrode. Sobald die Elektrode unter dem Mikroskop sichtbar ist, sicherzustellen, dass die Spitze am äußersten Rand des Monitors von der ersten Elektrode. </li><li> Bewegen Sie die zweite Elektrode in Folge mit dem Mikroskop Fokus, bis beide Elektroden in der gleichen Brennebene sind. Es ist wichtig, dass das Niveau der Überdruck ist stark genug, um Spitzen Blockade zu vermeiden, aber nicht zu stark, so dass die erste ganze Zelle die Aufnahme zu unterbrechen. Dies führt zu dem positiven Druck zu induzieren Bewegung in 2-3 Neuronen von der Elektrode beim Eintritt in die erste Scheibe. </li><li> Suchen Sie eine postsynaptischen Partner in einer ähnlichen Brennebene mit dem ersten präsynaptischen Aufnahme (Abbildung 2C). Die Aufnahme wird in der Regel gepaart Obtain Aufnahmen zwischen CA3 Pyramidenzellen der zweite ganze Zelle aus einer 0-200 mm Neuron der ersten recording (2C, D). HINWEIS: Synaptische Übertragung zwischen Nervenpaare sind über Zeiträume von bis zu 3-4 Stunden stabil, wenn über diese Standard-Ganzzellaufnahmetechniken. </li></ol></li></ol></li><li> Synaptische Plastizität: Es war einmal eine erfolgreiche Gewinnung synaptisch verbundenen Pyramidenzelle Paar (3A, B), untersuchen die Eigenschaften der synaptischen Übertragung und Plastizität. <ol><li> LTP Induktion. <ol><li> LTP zu induzieren durch Paarung präsynaptischen Aktionspotentiale (1 Hz) mit postsynaptischer Depolarisation auf -10 bis 0 mV für 1 min (3C) 7-9,12-14. Initiieren Sie die Kopplung innerhalb von 10 min von Einbruch in der postsynaptischen Neuron. HINWEIS: LTP kann auch mit beiden Neuronen Stromklemme durch Paarung präsynaptischen und postsynaptischen Aktionspotentiale bei 1 Hz für 1 min, mit postsynaptischen Aktionspotentiale induziert werden gehalten ausgelöst 10 msec nach der Injektion von Strom in die präsynaptischen Neuron 8 </sbis&gt;. </li></ol></li><li> Weitere induzieren LTD durch Niederfrequenzstimulation (LFS) bei 1 Hz in Kombination mit einer leichten Depolarisation der postsynaptischen Neuron auf -55 mV für 5-10 min (3C) 9. </li></ol></li></ol>

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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology+and+pharmacology+of+unitary+synaptic+connections+between+pairs+of+cells+in+areas+CA3+and+CA1+of+rat+hippocampal+slice+cultures.">Physiology and pharmacology of unitary synaptic connections between pairs of cells in areas CA3 and CA1 of rat hippocampal slice cultures.</a> Journal of Neurophysiology. 73 (3), 1282-1294 (1995).</li><li>Mitra, A., Blank, M., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmentally+altered+inhibition+in+Ts65Dn,+a+mouse+model+of+Down+syndrome.">Developmentally altered inhibition in Ts65Dn, a mouse model of Down syndrome.</a> Brain Research. 1440, 1-8 (2012).</li><li>Hanson, J. E., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+FMR1+genotype+influences+the+degree+of+synaptic+connectivity+in+a+mosaic+mouse+model+of+fragile+X+syndrome.">Presynaptic FMR1 genotype influences the degree of synaptic connectivity in a mosaic mouse model of fragile X syndrome.</a> Journal of Neuroscience. 27 (15), 4014-4018 (2007).</li><li>Hanson, J. E., Blank, M., Valenzuela, R. A., Garner, C. C., Madison, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functional+nature+of+synaptic+circuitry+is+altered+in+area+CA3+of+the+hippocampus+in+a+mouse+model+of+Down's+syndrome.">The functional nature of synaptic circuitry is altered in area CA3 of the hippocampus in a mouse model of Down's syndrome.</a> Journal of Physiology. 579, 53-67 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose

Hier haben wir die Voraussetzungen für die Gründung erfolgreich gepaart ganze Zellableitungen in organotypischen hippokampalen Schnittkulturen beschrieben. Gepaart Aufzeichnungen können auch in mehreren Präparaten, einschließlich akute Scheiben und dissoziiert Kultursysteme 26,27 durchgeführt werden. Während der Fokus hier ist auf die Induktion von mehr Formen der synaptischen Plastizität (LTP und LTD nämlich) gewesen ist, ist es wichtig zu betonen, dass gepaart ganze Zellableitungen in organotypisch...

Glutamat-Rezeptoren vermitteln die Mehrheit der erregenden synaptischen Transmission an Synapsen des zentralen Nervensystems. Die beiden wichtigsten Subtypen von ionotropen Glutamat-Rezeptoren an der Wirbelsäule Kopf der postsynaptischen Membran lokalisiert sind N-Methyl-D-Aspartat (NMDA) und α-Amino-3-hydroxy-5-methylisoxazol-4-Propionsäure (AMPA)-Rezeptoren. Bei Ruhemembranpotentiale, AMPA-Rezeptoren tragen die meisten der postsynaptischen Strom während der synaptischen Übertragung. Im Hippocampus spielt der NMDA-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Auslösung von Änderungen der Anzahl von AMPA-Rezeptoren in der postsynaptischen Membran: durch ein &quot;Koinzidenz-Detektor&quot; 1 wirkenden Änderungen der synaptischen Stärke 1 einzuleiten, nimmt der NMDA-Rezeptor in den synaptischen Mechanismen , die gedacht werden, um Lernen und Gedächtnis bei einem subzellulärer Ebene zu untermauern. In Reaktion auf die Depolarisation der postsynaptischen Neuron parallel präsynaptischen Transmitterfreisetzung tritt Kalzium über den NMDARezeptor AMPA-Rezeptor Einsetzen oder Entfernen 2 einzuleiten. Diese Rezeptordynamik zugrunde liegen Synapse Plastizität: eine Erhöhung der synaptischen Stärke ist Langzeit-Potenzierung 2,3 (LTP), während eine Abnahme der synaptischen Stärke ist die langfristige Vertiefung 4 (LTD). Daher AMPA-Rezeptor Bewegung gedacht für die synaptische Plastizität Expression verantwortlich zu sein, während NMDA-Rezeptoren wird angenommen, dass seine Induktion zu steuern. Die Bestimmung der genauen Mechanismen der synaptischen Übertragung und Plastizität zugrunde liegenden erfordert das Studium kleinen Populationen von Synapsen, idealerweise einzelne Synapsen. Während einige Synapsen sind sehr für Studie aufgrund der kleinen und diffuse Art der synaptischen Verbindungen geeignet auf dieser Ebene, zB der Kelch der gehaltene 5, für die meisten Populationen synaptischen das ist extrem schwierig. Zwei Hauptelektro Techniken entwickelt worden, um einzelne synaptischen Verbindungen zu untersuchen: Die erste ist eine minimale Stimulation where eine präsynaptischen Faser wird vermutet, stimuliert extrazellulär. Die zweite Technik gepaart Aufnahmen, wo zwei gleichzeitige Aufnahmen von ganzen Zelle synaptisch verbundenen Neuronen durchgeführt wird. Ein wesentlicher Vorteil der minimalen Stimulations ist, dass es schnell und relativ einfach durchzuführen, mit Platzierung einer extrazellulären Stimulationselektrode in das axonale Trakt, während gleichzeitig der Aufnahme von einem postsynaptischen Neuron. Das Hauptanliegen bei der Verwendung dieser Technik ist, dass zuverlässige Stimulation einer einzelnen Zelle nur selten gewährleistet Studie nach Studie werden. Im Laufe der letzten fünfzehn Jahre haben wir routinemäßig verwendet zwei synaptisch verbunden Pyramidenzellen 6-17 gepaart Ganzzellableitungen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass nur eine präsynaptische Neuron konsistent und zuverlässig stimuliert. Außerdem können nicht nur elektro Charakterisierung auch pharmakologische Manipulation der präsynaptischen Neuron 6,18 &lt;/ Sup&gt;. Jedoch ist die Wahrscheinlichkeit von synaptischen Verbindungen zwischen Neuronen gering, so verbundenen Paaren schwierig bis 19 zu erhalten. Die Verwendung von organotypischen Hirnschnittkulturen umgeht dieses Hindernis als synaptischer Verbindungen wieder hergestellt werden kann in vitro und außerdem die Art der resultierenden Verbindungs ​​ist ähnlich zu der des natürlichen Gehirngewebe 20. Darüber hinaus organotypischen Kulturen auszudrücken LTP, LTD 7-10,12-15,21 und weitere Formen der kurzfristigen synaptischen Plastizität gepaart mit Puls-Erleichterung (PPF) und Depression (PPD) 6,22,23, so dass Plastizität Mechanismen zur in Paaren von Neuronen untersucht werden. Hier beschreiben wir die detaillierte Methode erfolgreich erreichen gepaart Aufnahmen in diesem in vitro-System beteiligt. Diese Information kann leicht in anderen experimentellen Systemen, einschließlich akuter Scheiben und anderen Hirnregionen angepasst werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="686">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:256px;">Organotypic cultures</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:64px;">Paired recordings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Stable motorized micromanipulators&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicillin-Streptomycin solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Shallow tissue bath</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES buffer solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>DIC camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1M Tris stock solution&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Amplifier</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Computer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Horse Serum&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Vibration isolation table</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">plastic-coated miniature spatulas&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Upright microscope</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">soft paintbrush&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Data acquistion and analysis software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">manual tissue chopper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Electrode puller</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#2 filter paper</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Faraday cage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">#5&#160; forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Membrane inserts</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">CO2 incubator&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dissection hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Class II hood</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paired whole cell recordings in organotypic hippocampal slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Synaptischer Verbindungen ist offensichtlich durch die Stimulation der präsynaptischen Neuron ein Aktionspotential, indem ein Stromimpuls depolarisiert (typischerweise 20-50 pA für 20 msec) über den Aufzeichnungselektroden ausgelöst. Die postsynaptischen Stromspur wird dann für das Vorhandensein einer monosynaptische EPSC sucht evozierte kurzfristig (&lt;5 ms) und konsistente Latenzen nach dem Höhepunkt der präsynaptischen Aktionspotential (3A). In den meisten Experimenten mehrere postsynaptische...

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Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

paired-whole-cell-recordings-in-organotypic-hippocampal-slices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.6K Aufrufe.  University of Auckland. Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Serie: Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Gepaart Patch Clamp Messungen von Motor-Neuron-und Target Skelettmuskulatur bei Zebrafisch

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Forschung

Neurowissenschaften

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotypischen hippokampalen Slice-Kulturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Whole Cell Aufnahme von einem organotypischen Vorbereitung der Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-Elektroden-Array Recordings neuronaler Lawinen in organotypischen Kulturen

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Dual-Elektrophysiologische Recordings synaptisch-evozierte astrogliale und neuronale Antworten in Acute Hippocampusschnitte

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures As a Model to Study Neuroprotection and Invasiveness of Tumor Cells

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. This model is suitable for addressing different research questions that involve studies on neuroprotection, electrophysiological experiments on neurons, neuronal networks or tumor invasion. The hippocampal architecture and neuronal activity in multisynaptic circuits are well conserved in OHSC, even though the slicing procedure itself initially lesions and leads to formation of a glial scar. The scar formation alters presumably the mechanical properties and diffusive behavior of small molecules, etc. Slices allow the monitoring of time dependent processes after brain injury without animal surgery, and studies on interactions between various brain-derived cell types, namely astrocytes, microglia and neurons under both physiological and pathological conditions. An ambivalent aspect of this model is the absence of blood flow and immune blood cells. During the progression of the neuronal injury, migrating immune cells from the blood play an important role. As those cells are missing in slices, the intrinsic processes in the culture may be observed without external interference. Moreover, in OHSC the composition of the medium-external environment is precisely controlled. A further advantage of this method is the lower number of sacrificed animals compared to standard preparations. Several OHSC can be obtained from one animal making simultaneous studies with multiple treatments in one animal possible. For these reasons, OHSC are well suited to analyze the effects of new protective therapeutics after tissue damage or during tumor invasion. 
The protocol presented here describes a preparation method of OHSC that allows generating highly reproducible, well preserved slices that can be used for a variety of experimental research, like neuroprotection or tumor invasion studies.

Organotypic hippocampal slice cultures (OHSC) represent an in vitro model that simulates the in vivo situation very well. Here we describe a vibratome-based improved slicing protocol to obtain high quality slices for use in assessing the neuroprotective potential of novel substances or the biological behavior of tumor cells.

Organotypischen Hippocampal Slice Kulturen als Modell zur Studie Neuroprotektion und Invasivität der Tumorzellen

In organotypic hippocampal slice cultures (OHSC), the morphological and functional characteristics of both neurons and glial cells are well preserved. ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings for Electrophysiological Determination of Ion Selectivity in Channelrhodopsins

Over the past decade, channelrhodopsins became indispensable in neuroscientific research where they are used as tools to non-invasively manipulate electrical processes in target cells. In this context, ion selectivity of a channelrhodopsin is of particular importance. This article describes the investigation of chloride selectivity for a recently identified anion-conducting channelrhodopsin of Proteomonas sulcata via electrophysiological patch-clamp recordings on HEK293 cells. The experimental procedure for measuring light-gated photocurrents demands a fast switchable &#8211; ideally monochromatic &#8211; light source coupled into the microscope of an otherwise conventional patch-clamp setup. Preparative procedures prior to the experiment are outlined involving preparation of buffered solutions, considerations on liquid junction potentials, seeding and transfection of cells, and pulling of patch pipettes. The actual recording of current-voltage relations to determine the reversal potentials for different chloride concentrations takes place 24 h to 48 h after transfection. Finally, electrophysiological data are analyzed with respect to theoretical considerations of chloride conduction.

This article describes how the ion selectivity of channelrhodopsin is determined with electrophysiological whole-cell patch-clamp recordings using HEK293 cells. Here, the experimental procedure for investigating chloride selectivity of an anion-selective channelrhodopsin is demonstrated. However, the procedure is transferable to other channelrhodopsins of distinct selectivity.