Diese Arbeit wurde von der New York State Department of Health (C026878) unterstützt. MS war ein New York Stem Cell Foundation-Druckenmiller Fellow. Unterstützt in Part von Research Grant No 5-WJ11-571 aus der March of Dimes Foundation.

Ein. Vorbereitung der Feeder-Zellen Beachten Sie, dass alle Reagenzien im Folgenden beschriebenen steril vorbereitet werden (siehe Tabellen 1 und 2). Dieses Protokoll nutzt die JK1 Zelllinie (Cell Biolabs, Inc., Katalog # CBA-315) als Zubringer, die eine transformierte Derivat des erwachsenen Maus Hoden somatischen Zellen ist und wurde an anderer Stelle 3 beschrieben. Beachten Sie auch, dass alle Tierversuche im Einklang mit den institutionellen Richtlinien und Vorschriften durchgeführt werden. <ol><li> JK1 Zellen in Kultur gehalten werden und erfolgreich als Zubringer aufgebraucht, um den Durchgang 39. Kultur JK1 Zellen in einer 100 mm Zellkulturschale (BD Falcon, Katalog # 353.003) mit 10 ml steril filtriert Feeder Wachstumsmedium (DMEM, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum [FBS], 2 mM L-Glutamin und Antibiotika). Wenn die Kultur 95% Konfluenz erreicht, spaltete sich die Zellen 1.06 -1:10 Verhältnis. </li><li> Entfernen Medium von konfluenten JK1 Feederzellschicht monoSchicht. </li><li> Waschen Zellschicht einmal mit PBS ohne Calcium und Magnesium. </li><li> Hinzufügen vorgewärmten Trypsin / EDTA, 1x (0,05% trypsin/0.53 mM EDTA; Corning Cellgro, Katalog Nr. 25-051-CI), und Inkubieren bei 37 ° C für 5-10 min. </li><li> Inaktivieren Trypsin mit einem gleichen Volumen von Feeder Wachstumsmedium. Sammle Zellen und zentrifugieren bei 300 xg für 5 min. Resuspendieren Zellen in Feeder Wachstumsmedium. </li><li> Pre-coat Multi-Well-Zellkultur-Platten, indem genug 0,4% Gelatinelösung zur Deckung der gut und entfernen Sie nach 5 min bei Raumtemperatur. </li><li> Platte ~ 250 Zellen pro mm 2 in Gelatine-beschichteten Zellkulturplatte (z. B. 48-Well-oder 6-Well-Format). Inkubieren bei 37 ° C für 16 bis 24 Stunden. </li><li> Entfernen Kulturmedium aus Brunnen. ACHTUNG: Um das Zellwachstum zu inaktivieren, fügen Sie eine frische Lösung von Mitomycin-C mit 10 ug / ml in DMEM verdünnt, um jede Vertiefung (zB 200 ul / Vertiefung für eine 48-Well-Platte). Mitomycin-C toxisch ist. Behandeln und entsorgen Sie es mit Sorgfalt. Inkubation bei37 ° C für 4 Stunden. </li><li> Entfernen Mitomycin-C-Lösung von Zellen. 3 x waschen mit DMEM vor dem Beschichten Stammzellen. </li><li> Entfernen DMEM von Feeder-Zellen Brunnen und fügen Sie genug Stammzellen Medium (100 &amp;mgr; l / Well einer 48-Well-Platte, siehe Tabelle 3), um ein Austrocknen der Anleger während der Passage zu verhindern. Fügen SSCs am selben Tag, wie unten in den Abschnitten 3.1 bzw. 3.4 beschrieben, mit angegebenen Größen von Brunnen mit Feeder. </li></ol> 2. Dissoziation von Maus Hodengewebe Erhalten Donor Germ Cells <ol><li> Ernte erwachsenen Maus Hoden in sterile Mode und vorübergehend die Hoden in einem überdachten Petrischale (ohne Flüssigkeit hinzugefügt). Das Gericht muss sofort auf Eis gestellt Austrocknung zu verhindern und zu pflegen Lebensfähigkeit der Zellen. </li><li> Mit einer sterilen feinen Pinzette und eine feine Schere in einer Zellkultur Kapuze, einen Querinzision in der Tunica albuginea, ohne sie komplett Durchtrennung der Hoden (dh Schnitt ~ ½ - ¾ Abstand through) und verwenden Pinzette zu verdrängen Samenkanälchen in eine Ecke der Platte; discard Tunica und die angeschlossenen Gewebe. Halten Platte auf Eis überall zu halten Gewebe gekühlt und somit die Erhaltung seiner Integrität und verhindert Verdunstung. </li><li> Schnell Hackfleisch Tubuli mit feiner Feder Schere mindestens 3 min pro Hoden, während Platte auf Eis. </li><li> Sammeln die Tubulus-Fragmente in einem 50 ml konischen Röhrchen und waschen in ~ 40 ml gekühltem PBS / 1% Rinderserumalbumin. </li><li> Zentrifugieren bei 60 × g für 10 min, um Fragmente aus Tubulus Spermatozoen und Schutt zu trennen. Überstand verwerfen. </li><li> In einem 15 ml konischen Röhrchen, das Pellet in 3 ml pro Testis vorgewärmtes Dissoziationspuffers (DMEM, 0,05% Trypsin, 0,03% Collagenase Typ I, 80 U / ml DNAse I und 0,5% Rinderserumalbumin; Siehe Tabelle 2 für mehr spezifische Details Dissoziationspuffer). </li><li> Platzieren Sie die konischen Rohr horizontal in einem Gestell in einem Schüttler bis 150 Upm bei 37 ° C für 15 min, um eine Maximierunggitation. </li><li> Spin-Down bei 60 xg für 10 min zu trennen einzelner Zellen aus undissoziierten Brocken. </li><li> Speichern Sie die Pellets, welche Brocken bis zum nächsten Schritt. Collect Überstand aus Schritt 2.8 und 3 ml DMEM/10% fötalem Rinderserum, um Dissoziationspuffers neutralisieren. Zeigen Röhrchen auf Eis vorübergehend. </li><li> Wiederholen Sie Schritt 2,6 bis 2,7 mit dem gespeicherten Pellet aus Schritt 2,9 bis wieder Digest Stücke, die nach Schritt 2,8. </li><li> Hinzufügen eines gleichen Volumens von DMEM/10% FBS zu Dissoziationspuffers neutralisieren. </li><li> Rekombinieren Suspension aus Schritt 2,11 mit gespeicherten Zellsuspension aus Schritt 2.9. Zentrifuge 5 min bei 300 x g beträgt. </li><li> Pellet in Stammzellen Medium in einem Volumen von 16 ml pro Paar Hoden (siehe Tabelle 3). </li></ol> 3. Beschichtung von Hodenkrebs Zellsuspension <ol><li> Plate 2 ml Zellsuspension pro Well in einer 6-Well-Platte mit Feeder-Zellen mit Mitomycin-C und in einer Zellkultur-Inkubator bei 37 &amp; mitotisch-inaktiviertdeg, C in 5% CO 2. </li><li> Nach 48 Stunden absaugen medium, 2 ml frisches Medium und zum Inkubator. </li><li> Nach 48 Stunden, 0,5 ml frische Stammzellen Medium in jede Vertiefung und zum Inkubator. </li><li> Nach 48 Stunden, anschließend füttern Zellen dreimal pro Woche danach wie folgt bis große, diskrete Kolonien (&gt; 50 Zellen) erscheinen (innerhalb von 7 bis 21 Tage). Für die erste und zweite Fütterung pro Woche (zB Montag und Mittwoch) zu entfernen ~ 50% der mittleren und wieder hinzufügen 50% Vol. frisches Medium. Für das dritte Fütterung (z. B. Freitag), absaugen alle mittel-und ersetzen mit 2 ml frisches Medium. Dieser Ansatz basiert auf der Überlegung, dass die Vermeidung von Vollmedium Veränderungen Schwankungen in Konzentrationen von parakrine Signale, die in das Kulturmedium sezerniert werden minimiert 9 basiert. </li></ol> 4. Colony Picking für First Passage <ol><li> Entfernen Medium aus Vertiefungen mit Kolonien passagiert werden und frisches Stammzellen Medium. </li><li> Identifizieren Kolonien mit einem 10x-Ziel. Mit dem Mikroskop leicht defokussiert werden SSC Kolonien am Rand des auch homogen hellen Klumpen, vieler 11-12 Mikrometer Durchmesser Zellen, in denen es schwierig oder unmöglich, die einzelnen Zellrahmen bestehen erkennen erscheinen, da die Zellen gemeinsam auftreten (Abbildung 1A) fusioniert. Non-SSC Kolonien erscheinen dunkler, körnige oder weniger homogenen, mit erkennbaren Grenzen (1A, Einschub). </li><li> Mit einer 200 ul Pipettenspitze mit dem pipetteman auf 50 ul, erster nehmen Medium aus der gut und zu vertreiben, um die Spitze zu benetzen. Dann vorsichtig anzustossen die Kolonie mit der Spitze, bevor sich rasch Rückzug 50 ul Medium, um die Kolonie durch Ansaugen in der Spitze (Abbildung 1B) zu vertreiben. </li><li> Auszustoßen das Medium, das die Kolonie in eine Vertiefung einer 48-Well-Platte, enthaltend inaktivierte feeder-Zellen mit 100 ul Medium Stammzelle (Abbildung 1C). </li><li> Wiederholen Sie Schritt4,3 und bis zu 8 Kolonien auf die gleiche auch ohne Überschreitung 500 ul pro Vertiefung. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4,3 bis 4,5 zusätzliche Vertiefungen der 48-Well-Platte mit Durchgang eins SSC Kolonien vorzubereiten. </li><li> Wells wird bereit sein, aufgeteilt in 7-14 Tagen oder nach großen Klumpen von bis zu 500 Zellen entstanden (Abbildung 1D). </li></ol> 5. Nachfolgende Expansion und Passagieren von SSCs durch Trituration <ol><li> Zellen bei Passage sollte man auf frische Anleger nach bis zu 14 Tagen bei einer Split-Verhältnis von 1:2 für den ersten 3 Passagen und dann 1.04 subkultiviert, um 1:6 (alle 7 Tage) danach wie folgt. Sanft verreiben Kolonien von einer semi-konfluenten Vertiefung (zB ~ 300.000 SSC / Vertiefung von 6-Well-Platte) mit einer 1 ml Pipette durch Waschen Medium über den Zellen. Kolonien erkennbar Ablösen werden. Zu viel Kraft mit dem Strom der Flüssigkeit bewirkt unerwünschte Feederzellen kommen auch ab. </li><li> Sammle triturated Zellen in einem konischen Rohr und Zentrifuge bei 300 xg5 min. Hinweis: Ein Trypsinierung Schritt kann sicher hier hinzugefügt werden, wenn durch den Prüfarzt gewünscht. </li><li> Überstand entfernen und in frischen Stammzellen Medium resuspendieren durch gründliches und Abpipettieren Kolonien stören. </li><li> Platte SSCs auf frisch präparierten Feeder-Zellen mit Mitomycin-C inaktiviert, wie in Abschnitt 1 beschrieben. </li><li> Führen Zellen dreimal pro Woche wie folgt. Für die erste und zweite Fütterung (z. B. Montag und Mittwoch) werden 50% der frischen Medium. Für das dritte Fütterung (z. B. Freitag), absaugen alle mittel-und ersetzen mit 2 ml frisches Medium. Platten werden konfluente in 7-10 Tagen. Kulturen sollte von&gt; 98% Keimzellen (dh &lt;1% kontaminierenden somatische Zellen) nach 5-7 Passagen auf Immunfärbung (zB unter Verwendung der murinen Keim Zellmarker GCNA) an Keimzellen aus somatischen Zellen 10 unterscheiden basierend bestehen. Hinweis: Diese Methoden wurden in Übereinstimmung mit den Vorschriften und Anforderungen, die von der Institution gesetzt entwickeltal Animal Care und Use Committee am Weill Cornell Medical College. </li></ol>

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	<li>Kanatsu-Shinohara, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+proliferation+in+culture+and+germline+transmission+of+mouse+male+germline+stem+cells.">Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells.</a> Biol. Reprod. 69, 612-616 (2003).</li><li>Seandel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+functional+multipotent+adult+stem+cells+from+GPR125++germline+progenitors.">Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR125+ germline progenitors.</a> Nature. 449, 346-350 (2007).</li><li>Kim, J., Seandel, M., Falciatori, I., Wen, D., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD34++testicular+stromal+cells+support+long-term+expansion+of+embryonic+and+adult+stem+and+progenitor+cells.">CD34+ testicular stromal cells support long-term expansion of embryonic and adult stem and progenitor cells.</a> Stem Cells. 26, 2516-2522 (2008).</li><li>Ogawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+and+morphological+characterization+of+mouse+spermatogonial+stem+cell+lines.">Derivation and morphological characterization of mouse spermatogonial stem cell lines.</a> Arch. Histol. Cytol. 67, 297-306 (2004).</li><li>Schmidt, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+and+in+vitro+aging+is+detrimental+to+mouse+spermatogonial+stem+cell+function.">In vivo and in vitro aging is detrimental to mouse spermatogonial stem cell function.</a> Biology of Reproduction. 84, 698-706 (2011).</li><li>Zhang, X., Ebata, K. T., Robaire, B., Nagano, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+of+male+germ+line+stem+cells+in+mice.">Aging of male germ line stem cells in mice.</a> Biology of Reproduction. 74, 119-124 (2006).</li><li>Hobbs, R. M., Seandel, M., Falciatori, I., Rafii, S., Pandolfi, P. 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MS Lizenzgebühren von Weill Cornell Medical College in einer Lizenz to Cell Biolabs, Inc. JK1 Zellen verteilen.

Diese Methode zur Ableitung Erwachsenen SSCs mit adulten Hoden-derived Feeder-Zellen ist robust und gelungen, wenn gemeinsame genetische Herkunft (zB FVB, C57Bl6 und gemischte 129SV/C57Bl/6) und verschiedene Mutanten 2,3,7,14 beschäftigt waren. In der Tat ist die Mikroumgebung von der Kultur-System angelegt ausreicht, um einige der genetischen Barrieren zur Aufrechterhaltung erwachsenen SSCs in vivo (zB im Falle von PLZF - / - Tieren) überwunden 7. Während wir JK1 Ze...

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Verdünnungsmittel für Dissoziationspuffer </td></tr><tr><td> Trypsin / EDTA </td><td> Mediatech </td><td> 25-051-CI </td><td></td></tr><tr><td> Stammzell-Basismedium (StemPro-34) </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td> Benötigt Supplementierung nach Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> Stammzell-Medium ergänzt </td><td> verschiedene </td><td> siehe Tabelle 3 </td><td> Benötigt Supplementierung nach Shinohara et al. (2003) * </td></tr><tr><td> JK1 Zellen </td><td> Zelle Biolabs, Inc. </td><td> CBA-315 </td><td> Kann mit adulten Hoden Stromazellen nach Seandel et al ersetzen. (2007) </td></tr><tr><td> Mitomycin-C (ACHTUNG) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M4287 </td><td> Giftig; Handle with care. </td></tr><tr><td> Gelatine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G1890 </td><td> 0,4% ige Lösung in Wasser </td></tr><tr><td> EVOS xl digitalen inversen Mikroskop </td><td> Advanced Microscopy Gruppe </td><td> - </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 1. Reagenzien und Ausrüstung. * Siehe Tabelle 3 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Corning </td><td> 10-013 </td><td> Verdünnungsmittel für Dissoziationspuffer </td></tr><tr><td> Trypsin (1:250) </td><td> Life Technologies </td><td> 27250-018 </td><td> Dissoziationspuffer: Final 0,05% wt / vol </td></tr><tr><td> Kollagenase, Typ I, 235 U / ml </td><td> Worthington </td><td> CLS1 235 </td><td> Dissoziationspuffer: Final 0,03% wt / vol </td></tr><tr><td> DNAse I </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> DN25 </td><td> Dissoziationspuffer: Final 80 U / ml </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE-100g </td><td> Dissoziationspuffers: Final 0,5% wt / vol </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 2. Dissoziationspuffers </td></tr><tr><td> StemPro-34 SFM </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> StemPro-34 Nahrungsergänzung </td><td> Life Technologies </td><td> 10639-011 </td><td></td></tr><tr><td> Zusatzgebühren ** </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nicht-essentielle Aminosäuren </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M7145 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> MEM Vitaminlösung </td><td> Life Technologies </td><td> 11120-052 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> L-Glutamin </td><td> Mediatech </td><td> 25-005 </td><td> 2 mM </td></tr><tr><td> Rinderserumalbumin </td><td> ICP Bio </td><td> ABRE </td><td> 0,50% </td></tr><tr><td> Antibiotika-Antimykotika-Lösung </td><td> Mediatech </td><td> 30-004-CI </td><td> 1X </td></tr><tr><td> D (+) Glucose </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G8769 </td><td> 6 mg / ml </td></tr><tr><td> β-Östradiol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E2758 </td><td> 30 ng / ml </td></tr><tr><td> Progesteron </td><td> Calbiochem </td><td> 5341 </td><td> 60 ng / ml </td></tr><tr><td> fötales Rinderserum </td><td> Variable </td><td> n / a </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Rinder Holo-Transferrin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1283 </td><td> 100 pg / ml </td></tr><tr><td> Insulin </td><td> Gemini Bio-Produkte </td><td> 700-112P </td><td> 25 ug / ml </td></tr><tr><td> menschlichen GDNF </td><td> Leben Technologien </td><td> PHC7041 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> Human bFGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0023 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> Maus-EGF </td><td> Life Technologies </td><td> PHG0313 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> Putrescin </td><td> Research Organics </td><td> 0778P </td><td> 60 uM </td></tr><tr><td> Natriumselenit </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S5261 </td><td> 30 nM </td></tr><tr><td> Brenztraubensäure </td><td> Alfa Aesar </td><td> A13875 </td><td> 30 ug / ml </td></tr><tr><td> DL-Milchsäure </td><td> JT Baker </td><td> 0196-04 </td><td> 1 pg / ml </td></tr><tr><td> β-Mercaptoethanol </td><td> Life Technologies </td><td> 21985-023 </td><td> 50 uM </td></tr><tr><td> Askorbinsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4544 </td><td> 100 uM </td></tr><tr> &lt;td&gt; D-Biotin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B4639 </td><td> 10 ug / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tabelle 3. Stammzell-Medium </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> * Hinweis: In Ergänzung unten, bevor Sie Mediums. Filtern sterilisieren und halten bei 4 ° C. Das Medium ist für mindestens 2 Wochen stabil. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> ** Wir haben verschiedene Hersteller, Formulierungen und / oder Chargennummern dieser Reagenzien ohne offensichtliche schädliche Auswirkungen beschäftigt. Im Allgemeinen sollte die Zellkultur Reagenzien eingesetzt werden. </td></tr></tbody></table>

serial enrichment of spermatogonial stem and progenitor cells (sscs) in culture for derivation of long-term adult mouse ssc lines

Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) der Hoden sind ein klassisches Beispiel für adulten Stammzellen und die Erhaltung der Fruchtbarkeit für fast die gesamte Lebensdauer des Tieres. Während die genauen Mechanismen, die Selbsterneuerung und Differenzierung in vivo zu regeln Studie sind anspruchsvoll, wurden verschiedene Systeme zuvor murinen SSCs in vitro unter Verwendung einer Kombination von speziellen Kulturmedien und Feeder-Zellen 1-3 Propagation entwickelt. Die meisten in vitro Streifzüge in die Biologie der SSCs haben Zelllinien von Neugeborenen, möglicherweise aufgrund der Schwierigkeiten bei der Beschaffung Erwachsenen Zelllinien 4 abgeleitet. Jedoch weiterhin die Hoden zu reifen bis ~ 5 Wochen alt in den meisten Mausstämmen. In den frühen postnatalen Phase treten dramatischen Veränderungen in der Architektur der Hoden und in der Biologie der sowohl somatische und spermatogenen Zellen, einschließlich Änderungen in Expression von zahlreichen Stammzellen-bezogeneGene. Daher kann abgeleitet SSC neonatal-Linien nicht vollständig rekapitulieren die Biologie von erwachsenen SSCs, die nach der erwachsenen Testis einen stationären Zustand erreicht hat persistieren. Mehrere Faktoren haben die Produktion von Erwachsenen SSC Linien behindert historisch. Erstens kann der Anteil an funktionellen Stammzellen im Erwachsenenalter verringern, entweder durch intrinsische oder extrinsische Faktoren 5,6. Weiterhin, wie bei anderen adulten Stammzellen, ist es schwierig gewesen, um ausreichend SSCs bereichern aus Gesamt erwachsenen Hodenzellen ohne Verwendung einer Kombination von Immunselektion oder andere Sortier Strategien 7. Üblicherweise eingesetzten Strategien zählen die Verwendung von Mäusen kryptorchiden als Quelle von Donorzellen aufgrund einer höheren Verhältnis von Stammzellen zu anderen Zelltypen 8. Basierend auf der Hypothese, dass die Entfernung von somatischen Zellen aus der Vorkultur Interaktionen mit der Stammzell-Nische, die für SSC Überleben stört, haben wir bisher entwickelten Methoden zur Ableitung von Erwachsenen lines die keine Immunselektion und kryptorchiden Spendern einzusetzen sondern seriellen Anreicherung von SSC in Kultur, nachfolgend als 2,3 SESC. Das nachfolgend beschriebene Verfahren führt zu einer einfachen Prozedur zum Ableiten erwachsenen SSC Linien durch Dissoziieren erwachsenen Spenders Samenleiter, durch Plattieren von Zellen auf einer Feeder testikulären stromalen Zelllinie (JK1) 3 umfasst gefolgt. Durch serielle Passagierung, stark haftenden, nicht-verunreinigenden Keimzellen aus der Kultur bei gleichzeitiger Anreicherung von SSCs abgereichert. Kulturen auf diese Weise hergestellte enthalten eine Mischung aus Spermatogonien in verschiedenen Stadien der Differenzierung, welche enthalten SSC, über langfristige Selbsterneuerung Fähigkeit auswählt. Der Kern des SESC Methode ist, dass SSCs ermöglicht, den schwierigen Übergang von der Selbst-Erneuerung in vivo-bis langfristigen Selbsterneuerung in vitro in einer radikal anderen Mikroumgebung zu machen, produziert langfristige SSC Linien, frei von verunreinigendensomatischen Zellen und ermöglicht dadurch anschließenden experimentellen Manipulation von SSCs.

Das Aussehen der Passage Null Wildtyp wird Erwachsenen SSC Kolonien nach 7 Tagen in Abbildung 1 dargestellt. Dreidimensionale Kolonien werden aus einer Schicht aus flachen Zellen, die an die Speiser oder underling extrazellulären Matrix abgeschieden durch den Abzweigen mit mehreren Schichten von SSCs wachsenden oben besteht. Während gesunde SSCs hell und gleichmäßig refractile 11-12 Mikrometer Durchmesser sind, sind die Zellgrenzen schwierig zu unterscheiden, und die Größe der Kolonien kann sehr v...

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Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Eine einfache Methode zur Ableitung und pflegen Spermatogonien Stamm-und Vorläuferzellen Zelllinien aus erwachsenen Mäusen wird hier vorgestellt. Das Verfahren nutzt Feeder-Zellen, die aus dem somatischen Zellkompartiment der adulten Maus Hoden. Diese Technik ist für die gemeinsame Mausstämmen, auch transgenen Knock-out und Knock-in Mäusen.

Serielle Anreicherung von Spermatogonien Stamm-und Progenitorzellen (SSC) in der Kultur für die Ableitung des langfristigen adulten Maus SSC Linien

Spermatogonial stem and progenitor cells (SSCs) of the testis represent a classic example of adult mammalian stem cells and preserve fertility for nearly ...

serial-enrichment-spermatogonial-stem-progenitor-cells-sscs-culture

Research

JoVE Journal

Biology

Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells (SSCs) in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

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Serie: Serial Enrichment of Spermatogonial Stem and Progenitor Cells SSCs in Culture for Derivation of Long-term Adult Mouse SSC Lines

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are derived from the blastocyst of the early embryo and are pluripotent in differentiative ability.  Their vast differentiative potential has made them the focus of much research centered on deducing how to coax them to generate clinically useful cell types.  The successful derivation of hematopoietic stem cells (HSC) from mouse ESC has recently been accomplished and can be visualized in this video protocol.  HSC, arguably the most clinically exploited cell population, are used to treat a myriad of hematopoietic malignancies and disorders.  However, many patients that might benefit from HSC therapy lack access to suitable donors.  ESC could provide an alternative source of HSC for these patients.  The following protocol establishes a baseline from which ESC-HSC can be studied and inform efforts to isolate HSC from human ESC.  In this protocol, ESC are differentiated as embryoid bodies (EBs) for 6 days in commercially available serum pre-screened for optimal hematopoietic differentiation.  EBs are then dissociated and infected with retroviral HoxB4.  Infected EB-derived cells are plated on OP9 stroma, a bone marrow stromal cell line derived from the calvaria of  M-CSF-/- mice, and co-cultured in the presence of hematopoiesis promoting cytokines for ten days.  During this co-culture, the infected cells expand greatly, resulting in the generation a heterogeneous pool of 100s of millions of cells.  These cells can then be used to rescue and reconstitute lethally irradiated mice.

This protocol details the derivation of transplantable hematopoietic stem cells from mouse embryonic stem cells (ESC) and their subsequent injection into lethally irradiated recipient mice. Briefly, ESC are differentiated as embryoid bodies, which are then infected with retroviral HoxB4 and co-cultured with OP9 stromal cells and hematopoietic cytokines.

Ableitung von hämatopoetischen Stammzellen aus embryonalen Stammzellen der Maus

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Forschung

Biologie

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

Isolation und großräumige Ausdehnung der erwachsenen Menschen Endothelial Colony Forming Progenitorzellen

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Isolation and Derivation of Mouse Embryonic Germinal Cells

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum (dpc) mouse embryos.  Developing gonadal ridges from mouse embryos (C57BL6J) were dissociated by mechanical disruption with collagenase, then plated in a mouse embryo fibroblast feeder layer (MEF-CF1) that was previously mitotically inactivated with mitomycin C in the presence of knockout media and supplemented with Leukemia Inhibitor Factor (LIF), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), and Stem Cell Factor (SCF).  Using these optimized methods for PCG identification, isolation, and establishment of culture conditions permits long term cultures of EG cells for more than 40 days.  The embryonic germinal cell lines showed embryonic phenotype and expression of common used markers of the pluripotent state.  Isolation and derivation of germinal cells in culture provide a tool to understand their development in vitro and offer the opportunity to monitor cumulative damage at genetic and epigenetic levels after exposure to oxidative stress.

The ability of embryonic germinal cells to differentiate into primordial germinal cells during early development stages is a perfect model to address our hypothesis about cancer and infertility. This protocol shows how to isolate primordial germinal cells from developing gonads in 10.5-11.5 days post coitum mouse embryos.

Isolation und Ableitung von embryonalen Maus-Keimzellen

The ability of embryonic germinal cells (EG) to differentiate into primordial germinal cells (PGCs) and later into gametes during early developmental ...

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the trophectoderm mediates implantation and generates the fetal part of the placenta. As a result, the development of this lineage is essential for embryo survival. Derivation of trophoblast stem (TS) cells from mouse blastocysts was first described by Tanaka et al. 1998. The ability of TS cells to preserve the trophoblast specific property and their expression of stage- and cell type-specific markers after proper stimulation provides a valuable model system to investigate trophoblast lineage development whereby recapitulating early placentation events. Furthermore, trophoblast cells are one of the few somatic cell types undergoing natural genome amplification. Although the molecular pathways underlying trophoblast polyploidization have begun to unravel, the physiological role and advantage of trophoblast genome amplification remains largely elusive. The development of diploid stem cells into polyploid trophoblast cells in culture makes this ex vivo system an excellent tool for elucidating the regulatory mechanism of genome replication and instability in health and disease. Here we describe a protocol based on previous reports with modification published in Chiu et al. 2008.

In this video, we demonstrate the isolation of mouse blastocysts and the derivation of trophoblast stem cells from blastocysts. We also describe conditions for maintenance of the stem cell property as well as induction of differentiation in culture.

Ableitung der Maus Trophoblast Stammzellen aus Blastozysten

Specification of the trophectoderm is one of the earliest differentiation events of mammalian development. The trophoblast lineage derived from the ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

Isolierung und Kultivierung von Adult epithelialen Stammzellen aus menschlicher Haut

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish water and sediment. The choice of biological indicators must be based on reliable scientific knowledge and, possibly, on the availability of standardized procedures. In this article, we present a standardized protocol that used the marine crustacean Artemia to evaluate the toxicity of chemicals and/or of marine environmental matrices. Scientists propose that the brine shrimp (Artemia) is a suitable candidate for the development of a standard bioassay for worldwide utilization. A number of papers have been published on the toxic effects of various chemicals and toxicants on brine shrimp (Artemia). The major advantage of this crustacean for toxicity studies is the overall availability of the dry cysts; these can be immediately used in testing and difficult cultivation is not demanded1,2. Cyst-based toxicity assays are cheap, continuously available, simple and reliable and are thus an important answer to routine needs of toxicity screening, for industrial monitoring requirements or for regulatory purposes3. The proposed method involves the mortality as an endpoint. The numbers of survivors were counted and percentage of deaths were calculated. Larvae were considered dead if they did not exhibit any internal or external movement during several seconds of observation4. This procedure was standardized testing a reference substance (Sodium Dodecyl Sulfate); some results are reported in this work. This article accompanies a video that describes the performance of procedural toxicity testing, showing all the steps related to the protocol.

Long-term Lethal Toxicity Test with the Crustacean Artemia franciscana

This study concerns the development and standardization of a valuable methodological protocol to determine long-term (14 days) lethal toxicity exerted by chemical substances, industrial wastewater or sewage and liquid environmental samples on the saltwater crustacean, Artemia franciscana.

Langfristige letale Toxizität Test mit dem Krustentier Artemia franciscana</em

Our research activities target the use of biological methods for the evaluation of environmental quality, with particular reference to saltwater/brackish ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

Isolation und Kultur der einzelnen Muskelfasern und ihre Satelliten aus adulten Skelettmuskel

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

Isolation und Kultur der Dental epithelialen Stammzellen aus dem erwachsenen Maus Schneidezahn

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the organic and inorganic matrices of bone means that they play a key role in regulating skeletal remodeling. Together, osteoblasts and osteoclasts are responsible for the dynamic coupling process that involves both bone resorption and bone formation acting together to maintain the normal skeleton during health and disease.
As the principal bone-resorbing cell in the body, changes in osteoclast differentiation or function can result in profound effects in the body. Diseases associated with altered osteoclast function can range in severity from lethal neonatal disease due to failure to form a marrow space for hematopoiesis, to more commonly observed pathologies such as osteoporosis, in which excessive osteoclastic bone resorption predisposes to fracture formation.
An ability to isolate osteoclasts in high numbers in vitro has allowed for significant advances in the understanding of the bone remodeling cycle and has paved the way for the discovery of novel therapeutic strategies that combat these diseases. 
Here, we describe a protocol to isolate and cultivate osteoclasts from mouse bone marrow that will yield large numbers of osteoclasts.

Osteoclasts are the principal bone-resorbing cell in the body. An ability to isolate osteoclasts in large numbers has resulted in significant advances in the understanding of osteoclast biology. In this protocol, we describe a method for isolation, cultivating and quantifying osteoclast activity in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...