Die Autoren bedanken sich bei Dr. Silvia B Campos-Bilderback und George J Rhodes für den Abschluss chirurgische Verfahren, die Platzierung von venösen Zugang Linien danken. Sie möchte auch Sara E Wean für die Aufrechterhaltung der Munich-Wistar Kolonien, bestehend aus den beiden Simonsen und Frömter Stämme danken.

Ein. Konjugation von Rattenserumalbumin zu Sulfo-Rhodamin 101 Sulfonsäurechlorid (Texas Red) <ol><li> Man löst 100 mg Rattenserumalbumin (RSA) in 6.667 ml von 100 mM Natriumhydrogencarbonat pH 9,0; Endkonzentration 15 mg / ml in einem 50 ml konischen Röhrchen. </li><li> Platz Lösung in Eis / Wasser Becherglas und kühl, zwischen 0 bis 4 ° C. </li><li> In 200 ul hochwertigen wasserfreien Dimethylformamid (DMF) zu einer 10 mg-Ampulle von Texas Red Sulfonsäurechlorid (TRSC); Vortex auf Medium für 15 sek. </li><li> Vortex RSA Lösung auf mittlere und fügen Sie die gelösten TRSC. </li><li> Wrap 50 ml konischen in Folie (Parafilm kann verwendet werden, um eine gute Abdichtung zu gewährleisten werden gebildet), statt horizontal im Eiskübel w / Eis nur und auf Wippe Lösung langsam rühren (Bildung von Blasen zu vermeiden), erlauben Reaktion bei 0 weiter bis 4 ° C für 1 Stunde. </li><li> Mache 5 L von 0,9% iger Kochsalzlösung, und befeuchten Sie ein 50 kDa Molekulargewicht off Kammer geschnitten, die entweder a) Dialysemembran mit Clips sein kann, b) dialysis-Schlauchmaterial nach einem Schwimmer-a-analysator, oder c) Slide-a-lysator Kassette (alle geeignet für die Entfernung unkonjugierten TRSC). </li><li> Platz Reaktionsmischung im Dialysekammer und Platz in der 5 L Kanister w / der 0,9% iger Kochsalzlösung, Dialyse über Nacht bei 4 ° C mit einem leichtem Rühren mit einem Rührstab. </li><li> Ändern Sie den 5 L Dialysierlösung morgens und am späten Nachmittag bis eine Inkubation über Nacht Ergebnisse in praktisch keiner Farbänderung (Dies dauert in der Regel 48 ~ hr mit mindestens 4 Austausch). Zusätzlich mit der MWCO von 50 kDa, so nah an der MW von RSA, 66 kDa, es ist möglich, niemals eine klare Lösung, dies hängt von der Verteilung der Porengröße der Membran; 60 Stunden und 5 Austausch ist mehr als ausreichend Zeit. </li><li> Measure Volumen und teilen die Einwaage von 100 mg von der Lautstärke auf ungefähre Konzentration von TR-RSA geben, in der Regel Konzentrationen reichen von 10 bis 13 mg / ml. Die endgültige Farbstoff: Albumin-Verhältnis sollte ~ 4:1 1 Fluorophor je 15,00 sein0 Dalton Protein MW. Lagerung bei 4 ° C; NIE frieren die TR-RSA-Lösung, wie sie sich die Fragmentierung, die auftreten können Permeabilitätswerte verändern wird. </li></ol> 2. Vorbereiten des Inverses Mikroskop Bühne Imaging / Microscope Einstellungen <ol><li> Platz ~ 4-7 Stücke Autoklavenband (etwa ¾ &quot;long) perfekt übereinander in einem 50-mm-Schale mit 40 mm Deckglas Boden (Deckglas unteren Schale) gestapelt. Diese sollten näher zu einem der Ränder angeordnet werden, so dass die Rand des Bandes wird mit dem Rand der Krümmung der Niere zu machen, aber nicht blockieren Ziel Lichtweg (1A und 1B), größere Ratten mehr Raum zwischen dem Band und der Rand Schale erfordern. </li><li> Platz 2 Repti-therm Pads neben der Bühne neben dem 50 mm-Schale (Abbildung 1A). Legen Sie eine Erwärmung Wassermantel Decke über der Bühne. </li><li> Maximieren Sie die Effizienz beim Erfassen von Bildern durch die Gewährleistung der Objektivrevolver hat eine 10x Luft or 20x (Luft oder Wasser Immersion) und eine höhere angetriebene Wasserimmersionsobjektiv, um Bilder für die Quantifizierung zu sammeln. </li><li> Bei der Bebilderung der effizienteste Weg, um Wasser zu den Zielen hinzuzufügen ist, um sie zur Seite drehen und Wasser unter Verwendung einer 1 ml-Spritze mit einem langen Stück PE-200 Rohr, das die Spitze der Ziele erreichen kann. </li><li> Stellen Sie die Intensität der Anregung 10watt Laser zu ~ 15-20% mit den Graufilter auf der Software. Die Gallium-Arsenid-Phosphid nichtdescannten Photodetektoren auf 750 eingestellt, um grün-Emissionen und 625 sammeln, um rot-Emissionen zu sammeln. Blau-Emission (wie Nuklearfarbstoff Hoechst 33342) gesammelt unter Verwendung eines Standard-non descanned multialkaline Detektor mit einem Wert zwischen 750-800. </li><li> Um die korrekte Erhebung der geringen Intensität Emissionen innerhalb der Bowman-Raum zu gewährleisten, stellen Sie sicher, die unteren Grenzen der Detektoren so eingestellt sind, wie diese Werte nicht zu auszuschließen. Visuelle Warnung Marker zeigt an, ob die Empfindlichkeitist zu niedrig, und diese Werte werden eine Intensität von Null gegeben. </li><li> Legen Sie eine 1-ml-Spritze mit ~ 5-8 mg des fluoreszierenden Albumin-Lösung mit 0,9% steriler Kochsalzlösung verdünnt, um das Gesamtvolumen auf 1 cc. </li></ol> 3. Freilegen der Nieren in einer Münchner Wistar Ratte für Intravital 2-Photon Imaging <ol><li> Beginnen Sie mit einem Pre-narkotisierten Ratten mit Pentabarbitol (50 mg / ml Lösung, 120 μl/100 g Körpergewicht), Inactin (130 mg / ml Lösung, 120 μ/100 g Körpergewicht) oder Isofluran (5% Induktion, 1.5 auf 2,5% Wartung), eine innewohnende venösen Zugang Linie (entweder Vena femoralis oder venöse) und die linke Flanke von knapp unterhalb des Brustkorbs bis knapp über den linken Oberschenkel rasiert. </li><li> Legen Sie die Ratte flach auf der rechten Seite, so dass die linke, rasiert Seite nach oben; sicherzustellen, dass es flach auf dem Tisch, mit seiner Haltung länglich und nicht geduckt, mit den Vorderpfoten berühren einander und hinteren Pfoten berühren einander (Abbildung 2A). </li&gt; <li> Sehr vorsichtig abtasten, um die Niere zu bestimmen, wo sie legt natürlich im Retroperitoneum und zeichnen Sie eine gerade Linie parallel zum Körper (vom Brustkorb bis zum Oberschenkel) mit einem Sharpie (2A) fühlen. </li><li> Pick-up die Haut mit einem Paar Hakenpinzette, und nehmen Sie die Haut entlang der gezeichneten Linie mit einem Paar hemostats, um das Gewebe zu vernichten und zu verhindern, Blutungen. Schneiden Sie entlang der Schnitt mit einem Paar chirurgische Schere. Zerkleinern der Außenhaut und die Muskelschichten vor dem Schneiden wird drastisch reduziert und in der Regel beseitigt Blutungen. </li><li> Wiederholen Sie diesen Vorgang für die äußere Muskelschicht, die dünn ist. </li><li> Für den Einschnitt in das innere Muskelschicht, die das Bauchfell freilegt, re-tasten die Niere zu schätzen. Pinch einen Einschnitt Linie kleiner als der Niere; Sicherstellung der Schnitt ist nur über die Niere. Es ist am besten, um diesen Schnitt zu klein und es bei Bedarf vergrößert. Wenn dies wird zu groß, wird Naht erforderlich.Dieser letzte Schnitt ist kritisch, zu weit in jede Richtung über die Stabilität auf der Bühne beeinflussen und induzieren entweder Bewegungsartefakte von der Atmung (best case-Szenario) oder die Nieren Stiel und negativ die renale Perfusion (worst case scenario) dehnen. </li><li> Suchen Sie die Niere (wie in 2B gezeigt) und Griff die umliegende Fett mit einer Pinzette, arbeiten in Richtung der unteren Pol der Niere in der Hand über Hand-Mode. </li><li> Sobald die unteren Pol der Niere erreicht ist, ziehen die Niere durch den Einschnitt zwar sehr leicht zusammendrücken unterhalb der Niere zu exteriorisieren. Wenn der Schnitt ist zu klein, zerdrücken die Muskelschicht und geschnitten, um es zu erweitern, wiederholen Sie den Vorgang, um Nieren exteriorisieren. </li></ol> 4. Platzieren des München Wistar Ratte auf der Bühne für Imaging <ol><li> Zeigen die Niere zum Rand des Deckglases Schale mit der Niere leicht gedreht in Richtung der dorsalen (Rückseite) der Ratte so der Bauchseite der Niere is in Kontakt mit der unteren Schale Deckglas (Abbildung 1A). Fügen Sie einen erwärmten, sterile 09.% Iger Kochsalzlösung in die Schale. </li><li> Schauen Sie durch den 10x oder 20x-Objektiv und überprüfen Sie die Bewegung. Wenn eine Bewegung erkannt wird, rollen die Ratte über etwas so der Brustkorb ist weit weg von dem Deckglas unteren Schale, sicherzustellen, dass die Niere ist wie an den Rand der Schale zu schließen, ohne Dehnung der renalen Stiel (Abbildung 1B). </li></ol> 5. Aufnehmen von Bildern zu Renal Permeabilität von Albumin Quantify <ol><li> Berechnung der glomerulären Permeabilität (Glomeruluar Siebkoeffizienten; GSC) jeder Makromolekül erfordern unter Bezugnahme Hintergrund Bilder der einzelnen Glomeruli vor der Infusion des fluoreszierenden Moleküls. Wenn Ihr Mikroskop mit einem motorisierten Bühne fähig Kennzeichnung Standorte ausgestattet ist, finden und in der Mitte einzelne Glomeruli mit der unteren angetriebenen Ziel und markieren jeden Standort. Ein Dual-Pass Fluorescein / Rhodamin Epifluoreszenz filter ist ideal für dieses Verfahren zwar entweder Emission Filter funktionieren wird (Phasenkontrast oder andere Nicht-Fluoreszenz-Lichtquellen, wird nicht funktionieren). Glomeruli wird als leere kreisförmige Strukturen von proximalen Tubuli mit einer inhärenten gelb-orange autoflourescence wenn durch die Dual Tiefpassfilter angesehen umgeben erscheinen. </li><li> Wenn Ihr Mikroskop keinen motorisierten Tisch, scannen die Niere in einem Raster-Muster mit der Low-Power-Ziel und eine rudimentäre Karte, wo die einzelnen Glomeruli befinden; sich auf die natürlichen Sehenswürdigkeiten wie große oberflächliche Blutgefäße oberhalb der Nierenkapsel entfernt Fett oder Patches. </li><li> Schalten Sie den Revolver an die höhere Macht Wasserimmersionsobjektiv und nehmen 3D-Datensätze der einzelnen Glomeruli sicherstellen, dass die Kapillarschlingen und Bowman-Raum sind deutlich sichtbar. Mit einem Pseudo-Palette (etwas anderes als B / W) wird dazu beitragen, diese Strukturen zu visualisieren. </li><li> Fokussierung in auf einer oberflächlichen Blutgefäße langsam in t ziehener fluoreszierende Albumin dafür, dass Zeit gegeben wird, um für die systemische Verteilung zu ermöglichen. Bei Substanzen mit niedrigem GSC ist es wichtig, die Intensitätswerte in dem Plasma zu maximieren, jedoch nicht auf ein Niveau, das die Photodetektoren in dem Mikroskop zu erreichen sättigen. Dies erhöht Nachweisbarkeit filtriert Moleküle. Hinweis: Es ist in der Regel ein 5-7 sec Ablauf zwischen dem Zeitpunkt der fluoreszierenden Albumin zur Zeit eingeführt wird, erscheint es auf dem Bildschirm (Erwerb Vollbilder bei ~ 1 Bild / Sekunde). </li><li> Lassen Sie ca. 10 min, um eventuelle kleine Molekulargewicht Fragmente vor dem Erwerb 3D-Volumen bei 1 &amp;mgr; m-Abständen zur Berechnung Albumin GSC verwendet werden löschen. Typischerweise wird die Simonsen Stamm von München Wistarratten weit weniger Oberfläche Glomeruli hat, so dass alle, die visualisiert werden kann abgebildet und quantifiziert werden. Die Frömter Stamm weist eine weitaus größere Zahl, so dass wir die Zahl quantifiziert, um ~ 10 zu begrenzen. </li><li> Am Ende der Studie wurde die Ratte ist über eine Überdosis des anesthet euthanasiertic verwendet in der Studie. Ein Dual pneumothoracotamy wird durchgeführt, um Sterbehilfe zu versichern. </li></ol> 6. Berechnung GSC für Leuchtstofflampen Albumin aus 3D-Volumes <ol><li> Mit Metamorph Bildverarbeitungssoftware laden Sie die 3D-Datensätze für die einzelnen Glomeruli, sowohl die Hintergrund-Set und Set genommen nach der Infusion des fluoreszierenden Albumin. </li><li> In dem Band mit dem fluoreszierenden Albumin suchen eine oberflächliche Capillarschlinge mit genügend Platz leeren Raum zwischen den definierten Rändern und dem Rand der Bowman-Kapsel. </li><li> Im Hintergrund das gleiche Volumen lokalisieren Brennebene, die alle visuellen Hinweisen der eiweißhaltigen Bild enthalten sollte. Wählen Sie eine Region innerhalb des Capillarschlinge von Interesse und beachten Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Weiter wählen Sie eine Region innerhalb der Bowman-Raum und notieren Sie die durchschnittliche Intensität Lesen. Diese werden als Hintergrund-Werte verwendet werden. </li><li> Zur Quantifizierung, wählen Sie das ähnlich Region innerhalb der Bowman-Raum in der Albumin-containing Bild. Tun Sie dies für mindestens zwei anderen Regionen, um einen Durchschnittswert für die durchschnittliche Intensität innerhalb Bowman-Raum zu nehmen. </li><li> Wählen Sie die Capillarschlinge mit dem hellsten Plasma Intensität und zeichnen Sie eine Region um ihn herum. Weiter mit dem Schwellenwert-Funktion, markieren die hellen Werte innerhalb des zirkulierenden Plasma, die Vermeidung der dunkle Streifen, die zirkulierenden RBC werden. Beachten Sie die durchschnittliche Intensität Werte des ausgewählten Plasma Raum. Es ist wichtig, bevorzugt aus den hellen Bereichen des Plasmas, weil Faktoren im Blut nur dazu dient, um zu bewirken, und Unterschätzung der Plasma Fluoreszenz Ebenen. </li><li> Mit einem Microsoft Excel-Tabelle die Werte, um die GSC wo berechnen: </li></ol><img alt="Abbildung 1" fo:content-width="2.95in" fo:src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50052/50052eq1.jpg" />

<ol>
	<li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+normal+kidney+filters+nephritic+levels+of+albumin+retrieved+by+proximal+tubule+cells;+retrieval+is+disrupted+in+nephritic+states.">The normal kidney filters nephritic levels of albumin retrieved by proximal tubule cells; retrieval is disrupted in nephritic states.</a> Kidney International. 71, 504 (2007).</li><li>Russo, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+tubular+uptake+explains+albuminuria+in+early+diabetic+nephropathy.">Impaired tubular uptake explains albuminuria in early diabetic nephropathy.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 20 (3), 489 (2009).</li><li>Sandoval, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+factors+influence+glomerular+albumin+permeability+in+rats.">Multiple factors influence glomerular albumin permeability in rats.</a> Journal of the American Society of Nephrology. 23 (3), 447 (2012).</li><li>Tojo, A., Endou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrarenal+handling+of+proteins+in+rats+using+fractional+micropuncture+technique.">Intrarenal handling of proteins in rats using fractional micropuncture technique.</a> American Journal of Physiology. 263, 601 (1992).</li><li>Asgeirsson, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+sieving+of+three+neutral+polysaccharides,+polyethylene+oxide+and+bikunin+in+rat:+Effects+of+molecular+size+and+conformation.">Glomerular sieving of three neutral polysaccharides, polyethylene oxide and bikunin in rat: Effects of molecular size and conformation.</a> Acta Physiologica. 191 (3), 237 (2007).</li><li>Sandoval, R. M., Molitoris, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+endocytosis+in+vivo+using+intravital+two-photon+microscopy.">Quantifying endocytosis in vivo using intravital two-photon microscopy.</a> Methods in Molecular Biology. 440, 389 (2008).</li><li>Dunn, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-animal+imaging+of+renal+function+by+multi-photon+microscopy.">Live-animal imaging of renal function by multi-photon microscopy.</a> Curr. Protoc. Cytom. Chapter 12, Unit 12.9 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Schritte hervorgehoben hier darstellen, was wir diejenigen, die eine konsistente und genaue Durchlässigkeit Werte erzeugen wird, weil sie die folgenden Fallstricke zu umgehen fühlen: <ol><li> Streuung: Die Verwendung eines roten emittierende Fluorophore ermöglichen eine effizientere Sammlung von Leichtverpackungen seit längerer Wellenlänge Photonen weniger anfällig zu streuen sind. Mit entweder grün oder blau emittierende Fluorophore einführen größere Variation in der GSC wegen der erhöhten Variabilit...

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Olympus Floview 1000 confocal/Multi-photon microscope</td>
 <td>Olympus America</td>
 <td></td>
 <td>Filters for detectors: Blue 430/100, Green 525/50, Red 605/90</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mode-Locked Ti:Sapphire Mai Tai Laser</td>
 <td>Spectra-Physics</td>
 <td></td>
 <td>Tunable excitation wavelengths: ~750-1150 nm</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gallium arsenide phosphide photodetectors</td>
 <td>Hamamatsu Corp</td>
 <td></td>
 <td>Note: Front or Side mounted configurations available.</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Metamorph Image processing Software</td>
 <td>Molecular Dynamics</td>
 <td></td>
 <td>Note: Version 6.1r1</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Microsoft Excel</td>
 <td>Microsoft Corportation</td>
 <td></td>
 <td>2007 version</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Handling Forceps</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78266-04</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Mayo Dissecting Scissors</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72962</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>CA Micro scissors Model 1C300</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 78180-1C3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kelly Hemostatic Forceps (straight)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 72930</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Water Jacket Blanket + Heating Pad</td>
 <td>Gaymar</td>
 <td></td>
 <td>T/Pump PN 11184-000 Blanket-66N111CC</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Repti-Therm Under Tank Heater</td>
 <td>ZooMed</td>
 <td></td>
 <td>RH-4</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Texas Red Sulfonyl Chloride</td>
 <td>Invitrogen/Molecular Probes</td>
 <td>Cat# T-353</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Rat Serum Albumin</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# A-6272</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High Quality Anhydrous DMF</td>
 <td>Sigma Aldrich</td>
 <td>Cat# 270547</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Strate-Line Autoclave Tape</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>Cat# 11-889-1</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Willco-dish Coverslip Bottom Dishes (50 mm/40 mm coverslip)</td>
 <td>Electron Microscopy Sciences</td>
 <td>Cat# 70665-07</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

quantifying glomerular permeability of fluorescent macromolecules using 2-photon microscopy in munich wistar rats

Nierenerkrankungen mit Urin Verlust großer wesentlichen Makromoleküle, wie zB Serumalbumin, sind seit langem vermutlich durch Veränderungen in der Permeabilitätsbarriere podocytes umfasst, vaskuläre Endothelzellen und einer Basalmembran zusammen arbeiten verursacht werden. Daten aus unserem Labor mittels intravitaler 2-Photonen-Mikroskopie zeigte eine durchlässiger glomerulären Filtrationsrate Barriere (GFB) als bisher unter physiologischen Bedingungen haben, mit Abruf von gefilterten Albumin vorkommende in einem frühen Untergruppe von Zellen, die sogenannten proximalen Tubuluszellen (PTC) 1,2, 3. Zurück Techniken verwendet, um Nierenfiltration studieren und zur Gründung der Charakteristik der Filtration Barriere beteiligt micropuncture des Lumen dieser frühen Rohrsegmente mit der Probenahme und Analyse Fluidgehalt 4. Diese Studien bestimmt Albumin-Konzentration in der luminalen Flüssigkeit praktisch nicht existent; entsprechend engzu dem, was in der Regel im Urin nachgewiesen. Allerdings ergab die Charakterisierung von Dextran Polymere mit definierter Größe durch diese Technik die von ähnlicher Größe wie Serumalbumin hatte höheren Ebenen in der röhrenförmigen Lumen und Urin, was darauf hindeutet, erhöhte Durchlässigkeit 5. Hier ist eine detaillierte Beschreibung der Technik verwendet, um direkt zu visualisieren und quantifizieren glomerulären fluoreszierenden Albumindurchlässigkeit in vivo. Dieses Verfahren ermöglicht die Erkennung von gefilterten Albumin über den Filtrationsbarriere in Bowman-Raum (die erste Kammer des Urin-Filtration) und erlaubt auch die Quantifizierung von Albumin Reabsorption von proximalen Tubuli und Visualisierung der nachfolgenden Albumin Transzytose 6. Das Fehlen von fluoreszierenden Albumin entlang später Rohrsegmente auf dem Weg zu der Blase wie die Effizienz des Abrufs Weg in den früheren proximalen Tubulus-Segmente. Darüber hinaus, um, wenn diese Technik angewendet wurde, bestimmen Permeabilitätvon Dextranen mit einer ähnlichen Größe wie Albumin praktisch identisch Permeabilitäten wurden 2 angegeben. Diese Beobachtungen unterstützen direkt die Notwendigkeit, den Fokus vieler Nierenerkrankungen mit Proteinurie Krankheiten enthalten Änderungen in proximalen Tubulus Zelle Rückgewinnung erweitern.

Abbildung 3 zeigt ein Beispiel eines Bildes von einer Oberfläche eines Glomerulus München Wistar Frömter Ratte und welche Schritte unternommen wurden, um die Durchlässigkeit von fluoreszierenden Albumin bestimmen gemacht. Der GSC Wert für Albumin von 0,0111 für diese einzelnen Glomerulus fallen in den Bereich in dieser Sorte von München Wistar Ratten, wenn in der Fed Zustand 3 gesehen abgeleitet. Die Stabilität in diesen Bildern zu sehen ist auf die sorgfältige Planung und Ausführun...

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Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Quantifizierung glomeruläre Permeabilität von fluoreszierenden Makromoleküle Verwendung von 2-Photonen-Mikroskopie in München Wistar Ratten

Kidney  diseases involving urinary loss of large essential macromolecules, such as  serum albumin, have long been thought to be caused by alterations in ...

quantifying-glomerular-permeability-fluorescent-macromolecules-using

Research

JoVE Journal

Medicine

10.4K Aufrufe.  Indiana University School of Medicine. Eine Technik, die Verwendung hochauflösende intavital 2-Photonen-Mikroskopie direkt visualisieren und quantifizieren gloemrular Filtration in Oberfläche Glomeruli. Dieses Verfahren ermöglicht die direkte Bestimmung der Durchlässigkeit Eigenschaften von Makromolekülen in normalen und erkrankten Staaten.

Serie: Quantifying Glomerular Permeability of Fluorescent Macromolecules Using 2-Photon Microscopy in Munich Wistar Rats

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

Forschung

Medizin

Intravital Microscopy of Tumor-associated Vasculature Using Advanced Dorsal Skinfold Window Chambers on Transgenic Fluorescent Mice

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static information and is often not sufficient for a correct interpretation. Intravital evaluation, in which a process is followed in time, provides extra and often unexpected information. With the creation of transgenic animals expressing cell-specific markers and live cell tracers, improvements to imaging equipment, and the development of several imaging chambers, intravital microscopy has become an important tool to better understand biological processes. This paper describes an experimental design for the investigation of tumor vessel development and of therapeutic effects in a spatial and temporal manner. Using this setup, the stage of vessel development, tip cell and lumen formation, blood flow, extravasation, an established vascular bed, and vascular destruction can be visualized and followed. Furthermore, therapeutic effects, intratumoral fate, and the localization of chemotherapeutic compounds can also be followed.

This protocol describes the intravital imaging of transgenic mice expressing cell-specific fluorescent markers. Intravital imaging provides a non-invasive method for high-resolution observations in living animals using implantable windows through which the microscopic visualization of processes is possible. This method is especially useful to study longitudinal processes.

Intravitalen Mikroskopie von Tumor-assoziierten Gefäßsystem mit erweiterten dorsalen Hautfalte Fenster Kammern an transgenen Mäusen fluoreszierende

Tumor and tumor vessel development, as well as tumor response to therapeutics, are highly dynamic biological processes. Histology provides static ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Ein Verfahren zur Quantifizierung der oberen Extremität Leistung im täglichen Leben Accelerometer Verwendung

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

In Vivo Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&#232;re's Disease Ears and Normal Hearing Ears

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this patient group but has yet to be confirmed. This protocol describes a method of in vivo evaluation of neural changes especially well suitable for cranial nerve analysis using magnetic resonance imaging (MRI). MD-patients and normal hearing persons were examined in a 3-T MR-scanner using a scan protocol including strongly T2-weighted 3D gradient-echo-sequence (3D-CISS). In the patient group, MD was additionally confirmed using MRI-based assessment of endolymphatic hydrops. Morphometric analysis was performed using a freeware DICOM viewer. Evaluation of cranial nerves included measurements of cross-sectional areas (CSAs) of the nerves at different levels as well as orthogonal diametric measurements.

&lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Morphometric Analysis of Human Cranial Nerves Using Magnetic Resonance Imaging in Meni&amp;#232;re&#039;s Disease Ears and Normal Hearing Ears

To evaluate morphological changes of cranial nerves such as loss of neural structures or swelling of cranial nerves in Meni&#232;re&#39;s Disease (MD) or in healthy persons in vivo, a protocol of evaluation has been developed using magnetic resonance imaging (MRI). Additional MRI-based confirmation of MD was performed.

In Vivo Morphometrische Analyse der menschlichen Hirnnerven mittels Kernspintomographie in der Menière Krankheit Ohren und Normal hörende Ohren

Analysis of neural structures in Meni&#232;re's Disease (MD) is of importance, since a loss of such structures has previously been proposed for this ...

Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function in diabetic nephropathy and podocyte-specific VEGF-A knock-out mice; therefore, this protocol describes the full kidney work-up used in our lab to assess these mouse models of glomerular disease, enabling a vast amount of information regarding kidney and glomerular function to be obtained from a single mouse. In comparison to alternative methods presented in the literature to assess glomerular function, the use of the method outlined in this paper enables the glomerular phenotype to be fully evaluated from multiple aspects. By using this method, the researcher can determine the kidney phenotype of the model and assess the mechanism as to why the phenotype develops. This vital information on the mechanism of disease is required when examining potential therapeutic avenues in these models. The methods allow for detailed functional assessment of the glomerular filtration barrier through measurement of the urinary albumin creatinine ratio and individual glomerular water permeability, as well as both structural and ultra-structural examination using the Periodic Acid Schiff stain and electron microscopy. Furthermore, analysis of the genes dysregulated at the mRNA and protein level enables mechanistic analysis of glomerular function. This protocol outlines the generic but adaptable methods that can be applied to all mouse models of glomerular disease.

This protocol describes a full kidney work-up that should be carried out in mouse models of glomerular disease. The methods allow for detailed functional, structural, and mechanistic analysis of glomerular function, which can be applied to all mouse models of glomerular disease.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei Mäusen

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Highly Sensitive Measurement of Glomerular Permeability in Mice with Fluorescein Isothiocyanate-polysucrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the glomerulus and reabsorbed in the tubular system up until the absorption limit is reached. Early increases in pathological albumin filtration may, thus, be missed by analyzing albuminuria. Therefore, the use of tracers to test glomerular permselectivity appears advantageous. Fluorescently labeled tracer fluorescein isothiocyanate (FITC)-polysucrose (i.e., FITC-Ficoll), can be used to study glomerular permselectivity. FITC-polysucrose molecules are freely filtered by the glomerulus but not reabsorbed in the tubular system. In mice and rats, FITC-polysucrose has been investigated in models of glomerular permeability by using technically complex procedures (i.e., radioactive measurements, high-performance liquid chromatography [HPLC], gel filtration). We have modified and facilitated a FITC-polysucrose tracer-based protocol to test early and small increases in glomerular permeability to FITC-polysucrose 70 (size of albumin) in mice. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes (5 &#181;L). This protocol contains information on how the tracer FITC-polysucrose 70 is applied intravenously and urine is collected via a simple urinary catheter. Urine is analyzed via a fluorescence plate reader and normalized to a urine concentration marker (creatinine), thereby avoiding technically complex procedures.

Here, we present a protocol to test glomerular permeability in mice using a highly sensitive, nonradioactive tracer. This method allows repetitive urine analyses with small urine volumes.

Hochempfindliche Messung der Glomerularpermeabilität bei Mäusen mit Fluorescein-Isothiocyanat-Polysukrose 70

The loss of albumin in urine (albuminuria) predicts cardiovascular outcome. Under physiological conditions, small amounts of albumin are filtered by the ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolierung und Kultur residenter kardialer Makrophagen aus dem murinen sinoatrialen und atrioventrikulären Knoten

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Analyzing Long-Term Electrocardiography Recordings to Detect Arrhythmias in Mice

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ineffective in many patients. To improve patient care, novel and innovative therapeutic concepts causally targeting arrhythmia mechanisms are needed. To study the complex pathophysiology of arrhythmias, suitable animal models are necessary, and mice have been proven to be ideal model species to evaluate the genetic impact on arrhythmias, to investigate fundamental molecular and cellular mechanisms, and to identify potential therapeutic targets.
Implantable telemetry devices are among the most powerful tools available to study electrophysiology in mice, allowing continuous ECG recording over a period of several months in freely moving, awake mice. However, due to the huge number of data points (&gt;1 million QRS complexes per day), analysis of telemetry data remains challenging. This article describes a step-by-step approach to analyze ECGs and to detect arrhythmias in long-term telemetry recordings using the software, Ponemah, with its analysis modules, ECG Pro and Data Insights, developed by Data Sciences International (DSI). To analyze basic ECG parameters, such as heart rate, P wave duration, PR interval, QRS interval, or QT duration, an automated attribute analysis was performed using Ponemah to identify P, Q, and T waves within individually adjusted windows around detected R waves. 
Results were then manually reviewed, allowing adjustment of individual annotations. The output from the attribute-based analysis and the pattern recognition analysis was then used by the Data Insights module to detect arrhythmias. This module allows an automatic screening for individually defined arrhythmias within the recording, followed by a manual review of suspected arrhythmia episodes. The article briefly discusses challenges in recording and detecting ECG signals, suggests strategies to improve data quality, and provides representative recordings of arrhythmias detected in mice using the approach described above.

Here we present a step-by-step protocol for a semiautomated approach to analyze murine long-term electrocardiography (ECG) data for basic ECG parameters and common arrhythmias. Data are obtained by implantable telemetry transmitters in living and awake mice and analyzed using Ponemah and its analysis modules.

Analyse von Langzeit-Elektrokardiographie-Aufnahmen zum Nachweis von Arrhythmien bei Mäusen

Arrhythmias are common, affecting millions of patients worldwide. Current treatment strategies are associated with significant side effects and remain ...