Name: assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease
Uploaded: 2018-06-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
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Diese Arbeit wurde von der British Heart Foundation, Richard Bright VEGF Research Trust und MRC unterstützt.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick durchgeführt werden soll. Die entscheidenden Schritte in jeder Methode ermöglichen detaillierte funktionelle, strukturelle und mechanistischen Analyse der glomerulären Funktion, einschließlich der Beurteilung der Durchlässigkeit der Nieren als Ganzes (uACR und Plasma Kreatinin Messungen), die Durchlässigkeit der einzelne Glomeruli (glomerulären LpA / Vich), Prüfung der baulichen Veränderungen (PAS, Trichrome blau und EM), Protein-Lokalisierung (IF) und der glomerulären Genexpression (RT-PCR und Western blotting). Diese Methoden sind der Schlüssel für die vollständige Beurteilung der glomerulären Funktion in Mausmodellen Nierenerkrankung.
Bei der Beurteilung der Durchlässigkeit von der GFB haben viele Studien entschieden, um die herkömmliche uACR oder 24 h-Albumin Ausscheidung Rate als eine wirksame Maßnahme17,18zu verwenden. Obwohl diese Techniken der GFB Durchlässigkeit als Ganzes bewerten, erlaubt es nicht für einzelne glomeruläre Permeabilität Bewertung und Variation unter den Glomeruli. Frühere Studien haben gefunden, Messung der glomerulären LpA / V-i , ein empfindlicher Maß von Änderungen an der GFB Durchlässigkeit5,9. In der Tat in die repräsentativen Ergebnisse in diesem Beitrag gezeigt, bei 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO, VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Mäuse haben einen deutlich geringeren uACR im Vergleich zu VEGF-A KO Mäusen; Dieses Ergebnis spiegelt sich jedoch nicht in der glomerulären LpA / Vich Messungen, wo VEGF-A165b deutlich verhinderte nicht erhöht in der GFB Durchlässigkeit (Abbildung 1 und Abbildung 2)5. Dies zeigt die Bedeutung des Einsatzes mehrerer Assays, um die Niere Durchlässigkeit und die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli zu beurteilen. Darüber hinaus die glomeruläre LpA / Vich Oncometric Assay deutet darauf hin, dass die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli aus der gleichen Niere kann stark variieren, insbesondere Krankheit Modelle5,10, 19. eine Einschränkung zur Messung der glomerulären LpA / Vich ist, dass es nur auf den experimentellen Endpunkt; durchgeführt werden kann So sind regelmäßige uACR Messungen erforderlich, um einen Hinweis auf den experimentellen Endpunkt geben.
Neben der Beurteilung des funktionellen Phänotyps, fördert das vorliegende Verfahren auch die Bewertung der strukturellen und Ultrastrukturforschung Phänotyp. Dies kann mit einer Auswahl an Flecken wie PAS, trichrome, und silbernen Flecken; jeweils zu verschiedene Aspekten der glomerulären Morphologie zu beurteilen. In akuten Modellen der glomeruläre Erkrankung, die oft in Maus-Modellen der Fall ist, ist schwierig sein kann, großen strukturelle Anomalien diese Flecken zu verwenden, es sei denn, du eine ausgebildete renal Pathologen bist zu erkennen. Daher wird EM Durchführung vorgeschlagen, um die Ultrastruktur der GFB ermöglicht die quantitative Messung von Parametern wie der GBM, endotheliale Augenhöhlen Größe und Anzahl und hemolytic Merkmale zu beurteilen. Solche Messungen erfordern minimale Schulung durchzuführen und ermöglicht die Ermittler zu bestimmen, die Zelle-Typen/Strukturen in ein Krankheitsmodell betroffen. Im Beispiel in die repräsentativen Ergebnisse die VEGF-A KO Maus fand ein mildes Modell der glomerulären Erkrankung sein waren somit keine großen strukturellen Anomalien auf PAS Färbung. Hemolytic-spezifische VEGF-A KO jedoch Änderungen an der GBM, Podocytes und Endothelzellen auslösen, bei der Prüfung der glomerulären Ultra-Struktur5. Die Vorbereitung der Niere für die EM in dem vorliegenden Verfahren beschrieben aktivieren leider nicht Erkennung von endothelialen Glycocalyx, die auch bekannt ist, mit erheblichen Auswirkungen auf die Durchlässigkeit des GFB19. Um die Glycocalyx Tiefe genau zu messen, sollte die Niere mit 2,5 % Glutaraldehyd mit 1 % Alcian blau zur Kennzeichnung von endothelialen Glycocalyx durchspülen-fixiert sein Oltean Et Al19beschrieben.
Sobald der funktionelle und strukturelle Phänotyp beurteilt wurden, können der Ausdruck/Aktivierungsmuster von verschiedenen Genen und Wege dann gezielt in den Glomeruli beurteilt werden. Ultra-strukturellen Bewertung könnte einige Informationen über die Zelle Arten/glomeruläre Strukturen beteiligt, gibt an, ob hemolytic oder Endothel-spezifische Gene/Wege geprüft werden sollte. Beispielsweise wurde eine Verringerung der Zahl der endothelialen Augenhöhlen in die repräsentativen Ergebnisse von den VEGF-A KO-Mäusen (Abbildung 3D) beobachtet; Daher wurde der glomerulären Protein-Expression eine endotheliale Marker bekannt, in dem VEGF-A Weg einbezogen untersucht; VEGFR-2 (Abbildung 4 b)5. Neben der Expression von Proteinen in den Glomeruli kann ihre Lokalisierung auch mit wenn visualisiert werden. In einer Studie von Zhang Et Al20wurde hemolytic-spezifische Überexpression des GLUT1 in der Podocytes von bestätigt, wenn die erhöhte GLUT1 mit Podocin Co lokalisieren.
Im Vergleich zu alternativen Methoden in der Literatur zur Beurteilung der glomerulären Funktion vorgestellt ermöglicht den Einsatz der Methode skizziert in diesem Papier auf die Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung den glomerulären Phänotyp aus vollständig ausgewertet werden mehrere Aspekte. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermittelt und bewertet den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Diese wichtigen Informationen über den Mechanismus der Krankheit ist erforderlich, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht. Diese Methode kann leicht auf zukünftige Untersuchungen glomerulären Funktion bei der Bewertung von Krankheit Phänotypen und mögliche Therapie angewendet werden.
Abschließend beschreibt diese generischen und anpassungsfähige Protokoll einen vollständige Niere Work-Up für Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick abgerufen werden. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Die Verwendung von murinen Modellen um menschliche Nierenerkrankung zu imitieren ist immer häufiger. Solchen murinen Modellen gehören spontane Modelle wie spontan Hypertensive Ratten (SHR)1, Streptozocin (STZ)-induzierte diabetischen Ratten und Mäuse2und die Db/Db Typ II diabetischen Mäusen3, gentechnisch hergestellten Modelle wie primäre hemolytic-spezifische fokal segmentale glomeruläre Sklerose (FSGS) Modelle4, den hemolytic-spezifische vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF-A) Knock Out (VEGF-A KO) Modell5, und Alport-Syndrom6Modelle und erworben Modelle wie die 5/6 Nephrektomie7 und die einseitige Harnleiter Obstruktion (UUO) Modell8. Bei der Beurteilung der verschiedenen Aspekte der glomerulären Funktion in diesen Modellen stehen verschiedene Techniken zur Verfügung. Diese Methode Papier soll eine umfassende Aufarbeitung zu demonstrieren, die in Mausmodellen der Nierenerkrankung durchgeführt werden sollte, um der glomerulären Funktion umfassend zu bewerten.
Die Gründe für die Verwendung dieser Methode ist, dass es den glomerulären Phänotyp vollständig unter mehreren Gesichtspunkten ausgewertet werden kann. Dabei bewerten die glomeruläre Permeabilität, Protein und Wasser, die glomeruläre strukturelle Anomalien und Änderungen in den Ausdruck/Spleißen von mRNAs und Proteinen für normale glomerulären Funktion wesentlich. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermittelt und bewertet den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Dies ist wichtige Informationen über den Mechanismus der Krankheit, die erforderlich ist, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht.
In der Literatur ist es ein gemeinsames Auftreten mit einem Maus-Modell der glomerulären Erkrankung vorgestellt werden wobei der Phänotyp durch ein erhöhtes Maß an Albumin im Urin bestimmt wird. Allerdings gibt es Hinweise darauf, dass eine einzelne Methode zur Bestimmung der glomerulären Funktion nicht immer wirksam ist; Messung der Harn Albumin-Ausscheidung Rate oder der Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis (uACR) informiert nur auf die gesamte Nierenfunktion, und nicht der einzelne Glomeruli. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Durchlässigkeit in verschiedenen Glomeruli aus den gleichen Niere5,9,10variieren kann. Darüber hinaus beurteilt die Durchlässigkeit der einzelnen Glomeruli ein empfindlicher Weise zur Beurteilung der glomerulären Funktion; die Technik zur Messung der individuellen glomerulären Wasserdurchlässigkeit (LpA / Vich) hat gezeigt, dass empfindlicher auf Veränderungen in der glomerulären Funktion werden als bei der Messung der uACR9. Dieser Assay ist vorteilhaft in Mausmodellen, Proteinurie, wie Sie auf einem Hintergrund c57BL/611resistent sind. Der Vorteil des vorliegenden Papiers Methode ist, dass es sowohl die total renal Durchlässigkeit an Albumin als auch die einzelnen glomeruläre Permeabilität für Wasser untersucht.
Prüfung der glomerulären strukturelle Anomalien wird oft durch eine Batterie von Flecken wie Perjodsäure Schiff (PAS), trichrome, und Silber Flecken beurteilt. Diese ermöglichen eine ausgebildete renal Pathologe, das Niveau der Nierenerkrankung über ein scoring-Methode zu bewerten. Obwohl alle gute Methoden, Veränderungen der glomerulären Makro-Struktur in nicht immer eingehalten werden Modelle akuten Nierenversagens Verletzungen12. Diese Methode schlägt vor, dass neben der Durchführung der oben beschriebenen renal Histologie-Techniken, die glomeruläre Ultra-Struktur auch über Elektronenmikroskopie (EM) zu beurteilen. Gefärbten Glomerulus kann unter einem normalen Lichtmikroskop relativ normal aussehen; jedoch wird bei der Bewertung mit EM, kleine Änderungen in der glomerulären Basalmembran (GBM) Breite hemolytic Fuß Prozess Auslöschung, endotheliale Fenestrationen und die Sub-hemolytic Raum Berichterstattung analysiert. Daher ist es wichtig, dass die glomeruläre Ultra-Struktur und die Mikro-Struktur wird bewertet, um den Mechanismus der glomerulären Dysfunktion zu bestimmen.
Neben der Beurteilung der glomerulären struktureller Anomalien, sollten Änderungen in mRNA und Protein-Expression und Spleißen, sowie Protein-Aktivierung (z.B. Phosphorylierung), untersucht werden, um die Mechanismen der glomerulären Erkrankungen weiter aufzuklären. Bei der Betrachtung der glomerulären Erkrankung oder z. B. beim KO/over-expressing ein Gen gezielt in glomerulären Zellen, z. B. in der hemolytic-spezifische VEGF-A KO Maus5, es wichtig ist, dass die Protein- und mRNA-Änderungen nur innen geprüft werden die glomeruläre Zellen, und nicht die ganze Niere. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die Glomeruli sind isoliert von der Maus Niere Kortex, und dann die Protein/RNA isoliert sind. Dadurch können spezifische Analyse von Protein/mRNA Dysregulation in der Glomeruli das Krankheitsmodell.
Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

<table><tbody><tr><td>Metabolic Cages</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-6731</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffered saline (10x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5912-1L</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Albumin ELISA Quantitation Set</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>E90-134</td><td></td></tr><tr><td>TMB ELISA Substrate solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>34028</td><td></td></tr><tr><td>Sulphuric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741</td><td></td></tr><tr><td>SPECTRstar nano</td><td>BMG Labtech</td><td>SPECTRstar nano or equivalent</td><td></td></tr><tr><td>RNAlater stabilisation solution</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>4-15% precast protein gel</td><td>BIORAD</td><td>4568084</td><td></td></tr><tr><td>4x Laaemmli Sample buffer</td><td>BIORAD</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot cell</td><td>BIORAD</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris running buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue Dye</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>20278</td><td></td></tr><tr><td>Creatinine Companion</td><td>Exocell</td><td>1012 Strip Plate</td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldehyde Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5882</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Cacodylate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0250</td><td></td></tr><tr><td>10x Phosphate Buffered Saline</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Acetate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Phosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342483</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium Sulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2643</td><td></td></tr><tr><td>Calcium Chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>D(+)Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Blood Collection tubes</td><td>BD</td><td>367835</td><td></td></tr><tr><td>23-25G Needle</td><td>BD</td><td>PMC0735</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Glass Vial</td><td>Thomas Scientific</td><td>0914X10</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 ml Polypropylene Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10110101</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml Tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10681894</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Tissue Molds</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>22-363-553</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Surgical Disection Kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-005-204</td><td></td></tr><tr><td>Optimal Cutting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23-730-571</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>Glass Capillary Tubes</td><td>Harvard Apparatus</td><td>EC1 64-0770</td><td></td></tr><tr><td>Glomerular Permeability Rig</td><td>Built at the Univeristy of Bristol - not comercially available</td><td>Citation of LpA rig: Salmon et al. 2006; J. Physiol</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Sieves</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-59984</td><td></td></tr><tr><td>Periodic Acid-Schiff (PAS) Staining System</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>395B-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3136</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>MerckMillipore</td><td>108298</td><td></td></tr><tr><td>Poly-Prep Slides</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0425-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Medium</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8030</td><td></td></tr><tr><td>Osmium tetroxide solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75632</td><td></td></tr><tr><td>Aradite Resin</td><td>Agar Scientific</td><td>CY212</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl Acetate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1260A</td><td></td></tr><tr><td>Lead Citrate</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1210</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>e.g. 957000H</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophobic Pen</td><td>Abcam</td><td>ab2601</td><td></td></tr><tr><td>Nephrin (1243-1256) Antibody</td><td>Acris</td><td>BP5030</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Podocin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0372-200UL</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor Secondary Antibody</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A32732</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Labs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>NP40 Cell Lysis Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>FNN0021</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78437X4</td><td></td></tr><tr><td>10x Transfer Buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610734</td><td></td></tr><tr><td>PVDF Membrane</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2002</td><td></td></tr><tr><td>HRP-Conjugated Secondary Antibodies</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td></td></tr><tr><td>ECF Substrate for Western Blotting</td><td>Fisher</td><td>10713387</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>M-MLV Reverse Transcriptase</td><td>New England Biolabs</td><td>M053S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo dT</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18418012</td><td></td></tr><tr><td>Random Primers</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>48190011</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>18427088</td><td></td></tr><tr><td>Ribonuclease Inhibitor</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10777019</td><td></td></tr><tr><td>DEPC Water</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9915G</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Light Miscroscope</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image J Analysis Software</td><td>Image J</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM Microscope</td><td>Britannica</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of kidney function in mouse models of glomerular disease

Die Verwendung von murinen Modellen um menschliche Nierenerkrankung zu imitieren ist immer häufiger. Unsere Forschung konzentriert sich auf die Beurteilung der glomerulären Funktion bei diabetischer Nephropathie und hemolytic-spezifische VEGF-A Knock-out-Mäusen; Dieses Protokoll beschreibt daher die vollständige Niere Aufarbeitung in unserem Labor verwendet werden, um diese Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung, ermöglichen eine große Menge an Informationen über Niere und glomerulären Funktion aus einem einzigen Mausklick zu bewerten. Im Vergleich zu alternativen Methoden in der Literatur zur Beurteilung der glomerulären Funktion vorgestellt ermöglicht die Nutzung der in diesem Artikel beschriebene Methode den glomerulären Phänotyp vollständig unter mehreren Gesichtspunkten ausgewertet werden. Mithilfe dieser Methode kann der Forscher den Niere Phänotyp des Modells ermitteln und bewerten den Mechanismus, warum der Phänotyp entwickelt. Diese wichtigen Informationen über den Mechanismus der Krankheit ist erforderlich, wenn mögliche therapeutische Wege in diesen Modellen untersucht. Die Methoden können detaillierte funktionale Bewertung der glomerulären Filtration Barriere durch Messung der Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis und individuelle glomerulären Wasserdurchlässigkeit sowie Struktur- und Ultra-strukturelle Prüfung mit Hilfe der Perjodsäure Schiff Fleck und Elektronenmikroskopie. Darüber hinaus ermöglicht die Analyse von Genen Dysregulated Ebene der mRNA und Protein mechanistischen Analyse der glomerulären Funktion. Dieses Protokoll beschreibt die generische aber anpassungsfähigeren Methoden, die alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden können.

Urin wurde gesammelt, mit metabolischen Käfige aus Wildtyp (WT), induzierbaren hemolytic-spezifische VEGF-A Knock-out (VEGF-A KO) und VEGF-A KO X Neph-VEGF165b Mäuse (VEGF-A KO Mäusen, die die menschlichen VEGF-A165b Isoform in der Podocytes in over Ausdrücken ein konstitutiven Weise). Bei der Messung der Harn Albumin Kreatinin Ratio 0, 4, 10 und 14 Wochen nach Doxycyclin Induktion der VEGF-A KO entwickelt VEGF-A KO Mäusen progressive Albuminurie von 10 Wochen im Vergleich zum WT stellt Steuerelemente. Die absoluten Werte sehen in Abbildung 2Aund normalisierte die Grundlinie jeder Maus-Werte in Abbildung 2 b. Albuminurie in beobachtet nicht in die VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse (Abbildung 2), ist jedoch darauf hinweist, dass VEGF-A165b schützende im Modell der Albuminurie5.
Die glomeruläre LpAVich wurde in einzelne Glomeruli gesiebt von WT VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Nieren gemessen. Ein Beispiel dafür wie ein Glomerulus gefangen ist und die Schrumpfung beobachtet, wenn Perifused mit 8 % BSA in Abbildung 3Aangezeigt wird. Diese Schrumpfung dient dann zur Bestimmung der glomerulären LpA / Vich für jedes Glomerulus (Abb. 3 b). VEGF-A KO Mäuse hatten eine signifikant erhöhte glomeruläre LpA / Vich bei 14 Wochen post VEGF-KO Induktion im Vergleich zu WT Kontrolle Glomeruli. Obwohl niedriger in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse, die erhöhte glomeruläre LpA / Vich nicht durch Überexpression des VEGF-A165b bei 14 Wochen5verhindert wurde.
PAS Färbung der Niere Kortex Abschnitte 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO ergab glomerulären strukturelle Anomalien in der VEGF-A KO oder VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse (Abb. 4A). Jedoch bei der Analyse der glomerulären Ultra-Struktur über EM VEGF-A KO Mäusen hatte entwickelt eine erhöhte GBM-Breite, verringerte Zahl der endothelialen Augenhöhlen SPS Abdeckung abgenommen und erhöhte durchschnittliche hemolytic Schnittbreite (Abbildung 4-4F ). Die durchschnittliche hemolytic Fuß verarbeiten Breite und Anzahl der Schlitze blieb unverändert (Abb. 3 b und 3 G). Überexpression des VEGF-A165b in den VEGF-A KO-Mäusen verhinderte die Änderungen an der GBM und Schnittbreite (Abbildung 4 und 4F). VEGF-A165b hatte jedoch keinen Einfluss auf die veränderten Augenhöhlen Anzahl und SPS Abdeckung (Abbildung 4 und 4E)5.
RT-PCR durchgeführt auf RNA aus gesiebten Glomeruli extrahiert ergab, dass die menschliche VEGF-A165b mRNA nur in die VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Mäuse (Abbildung 5A) vorhanden ist. Beim Extrahieren von Protein aus gesiebten Glomeruli und Beurteilung der Ebenen von Proteinen über westliche Beflecken, der glomerulären Protein-Expression des VEGFR-2 erwies sich als VEGF-A KO Mäusen verringert werden die Überexpression des VEGF-A165b ( verhinderte Abbildung 5 b 5 c)5.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig1.jpg"> Abbildung 1. Schematische Aufbau die glomeruläre Permeabilität (LpA) Rig. (A) der Glomerulus ist gefangen auf (B) die Mikropipette in einem Halter mit Absaugung, die auf eine Halterung für Stabilität aufgespannt ist. (C) rechteckige Objektträger. (D) 4 X Objektiv des Mikroskops mit einer Videokamera. (E) 1 % BSA Lösung auf 37 ° c erwärmt (F) 8 % BSA Lösung auf 37 ° c erwärmt (G) Fernbedienung, tippen Sie auf Lager Perifusate-haltigen zweizeilig, schnelle Perifusate Austausch ermöglicht. (H) Route des Perifusate in Richtung der Objektträger, die dann den Glomerulus badet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig2.jpg"> Abbildung 2: Harn Albumin-Kreatinin-Verhältnis. (A) die uACR Werte auf 0, 4, 10 und 14 Wochen nach Induktion der VEGF-A KO bei WT, VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A165b-Mäusen. (B) die gleichen uACR Werte normiert auf den Ausgangswert (Woche 0) von jedem einzelnen Mausklick. Die uACR deutlich erhöht bei VEGF-A KO Mäusen in den Wochen 10 und 14 im Vergleich zur WT stellt Steuerelemente, die in den VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäusen verhindert wurde (* p < 0,05; Zwei-Wege-ANOVA, Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 4-12 Mäuse pro Zeitpunkt; Fehlerindikatoren: Standardfehler des Mittelwerts [SEM]). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.5geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig3.jpg"> Abbildung 3. Messung der glomerulären Wasserdurchlässigkeit. (A) der Glomerulus ist gefangen auf die Mikropipette über Absaugung; die Perifusate von 1 % BSA (Ai), 8 % BSA (Aii) umgeschaltet, und glomerulären Schrumpfung wird beobachtet. (B) Messungen vor und nach dem 8 % BSA Schalter sind zur Ermittlung der glomerulären LpA / Vich. (C) VEGF-A KO Mäuse entwickeln eine erhöhte glomeruläre LpA / Vich bei 14 Wochen post Induktion von VEGF-A KO im Vergleich zu WT Kontrollen. Dies verhinderte nicht deutlich in VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäuse (* p < 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 4-9 Mäuse, 15-30 Glomeruli; Fehlerindikatoren: SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig4.jpg"> Abbildung 4. Glomeruläre Strukturanalyse. (A) PAS Färbung der Rinde der Niere keinen Hinweis auf eine strukturellen Anomalien in den Glomeruli von WT, VEGF-A KO und VEGF-A X Neph-VEGF-A165b Mäusen (Ai - Iii). EM offenbart Ultra-strukturelle Anomalien in der VEGF-A KO Glomeruli (Aiv - vi). (B) die durchschnittliche FPW änderte sich nicht zwischen den Gruppen. (C) der GBM erhöht in der VEGF-A KO Glomeruli, die verhinderte VEGF-A165b (D) , die die Anzahl der Augenhöhlen in VEGF-A KO Glomeruli zurückgegangen war die von VEGF-A165B. (E) der SPS Abdeckung unverändert war in VEGF-A KO Glomeruli, die auch von VEGF-A165b. (F) unverändert die durchschnittliche Schnittbreite im VEGF-A KO Glomeruli erhöht blieb wurde verringert, die durch VEGF-A165b. (G) die Schlitz-Nummer verhindert wurde blieb unverändert zwischen den drei Gruppen (* p < 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 3 Mäuse, 9 Glomeruli; Fehlerindikatoren: SEM). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.5geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57764/57764fig5.jpg"> Abbildung 5. mRNA und Protein-Expression von Markern. (A) RT-PCR ergab, dass menschliche VEGF-A165b mRNA Ausdruck nur in den gesiebten Glomeruli von VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Mäusen zeigte. (B) Western blotting darauf hingewiesen, dass VEGFR-2-Protein-Expression in VEGF-A KO Glomeruli nach unten geregelt war, wurde in VEGF-A KO X Neph-VEGF-A165b Glomeruli verhindert (* p < 0,05; One way ANOVA, Bonferroni-Korrektur für den Vergleich zwischen Paaren; n = 3 - 6 Mäuse; Fehlerindikatoren: SEM). Diese Zahl wurde von Stevens Et al.5geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57764/57764fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Beurteilung der Nierenfunktion in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung

The use of murine models to mimic human kidney disease is becoming increasingly common. Our research is focused on the assessment of glomerular function ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

17.5K Aufrufe.  University of Exeter. Dieses Protokoll beschreibt eine vollständige Niere Aufarbeitung, die in Mausmodellen der glomerulären Erkrankung durchgeführt werden soll. Die Methoden können für funktionelle, strukturelle und mechanistische Detailanalyse der glomerulären Funktion, die auf alle Maus-Modellen der glomerulären Erkrankung angewendet werden kann.

Serie: Assessment of Kidney Function in Mouse Models of Glomerular Disease

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often unreported mortality rates that may confound analyses. Bilateral renal pedicle clamping is commonly used to induce IR-AKI, but differences between effective clamp pressures and/or renal responses to ischemia between kidneys often lead to more variable results. In addition, shorter clamp times are known to induce more variable tubular injury, and while mice undergoing bilateral injury with longer clamp times develop more consistent tubular injury, they often die within the first 3 days after injury due to severe renal insufficiency. To improve post-injury survival and obtain more consistent and predictable results, we have developed two models of unilateral ischemia-reperfusion injury followed by contralateral nephrectomy. Both surgeries are performed using a dorsal approach, reducing surgical stress resulting from ventral laparotomy, commonly used for mouse IR-AKI surgeries. For induction of moderate injury BALB/c mice undergo unilateral clamping of the renal pedicle for 26 min and also undergo simultaneous contralateral nephrectomy. Using this approach, 50-60% of mice develop moderate AKI 24 hr after injury but 90-100% of mice survive. To induce more severe AKI, BALB/c mice undergo renal pedicle clamping for 30 min followed by contralateral nephrectomy 8 days after injury. This allows functional assessment of renal recovery after injury with 90-100% survival. Early post-injury tubular damage as well as post injury fibrosis are highly consistent using this model.

We describe models of moderate and severe ischemia-reperfusion-induced kidney injury in which the mice undergo unilateral renal pedicle clamping followed by simultaneous or delayed contralateral nephrectomy, respectively. These models consistently give rise to renal dysfunction and post-injury fibrosis, but injury severity and survival are dependent on mouse background, age and surgical equipment.

Ischämie-Reperfusion-Modell des akuten Nierenschädigung und nach der Verletzung Fibrose bei Mäusen

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

Forschung

Medizin

Renal Ischaemia Reperfusion Injury: A Mouse Model of Injury and Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable during renal transplantation. Experimental models that accurately and reproducibly recapitulate renal IRI are crucial in dissecting the pathophysiology of AKI and the development of novel therapeutic agents. Presented here is a mouse model of renal IRI that results in reproducible AKI. This is achieved by a midline laparotomy approach for the surgery with one incision allowing both a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia of the left kidney. By careful monitoring of the clamp position and body temperature during the period of ischaemia this model achieves reproducible functional and structural injury. Mice sacrificed 24 hr&#160;following surgery demonstrate loss of renal function with elevation of the serum or plasma creatinine level as well as structural kidney damage with acute tubular necrosis evident. Renal function improves and the acute tissue injury resolves during the course of 7 days following renal IRI such that this model may be used to study renal regeneration. This model of renal IRI has been utilized to study the molecular and cellular pathophysiology of AKI as well as analysis of the subsequent renal regeneration.

The mouse model of renal ischaemia reperfusion injury described here comprises of a right nephrectomy that provides control tissue and clamping of the left renal pedicle to induce ischaemia that results in acute kidney injury. This model uses a midline laparotomy approach with all steps performed via one incision.

Renale Ischämie Reperfusionsschaden: Ein Maus-Modell der Schädigung und Regeneration

Renal ischaemia reperfusion injury (IRI) is a common cause of acute kidney injury (AKI) in patients and occlusion of renal blood flow is unavoidable ...

Mouse Kidney Transplantation: Models of Allograft Rejection

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely replicates both the technical and pathological processes that occur in human renal transplantation. Although mouse models of allogeneic rejection in organs other than the kidney exist, and are more technically feasible, there is evidence that different organs elicit disparate rejection modes and dynamics, for instance the time course of rejection in cardiac and renal allograft differs significantly in certain strain combinations. This model is an attractive tool for many reasons despite its technical challenges. As inbred mouse strain haplotypes are well characterized it is possible to choose donor and recipient combinations to model acute allograft rejection by transplanting across MHC class I and II loci. Conversely by transplanting between strains with similar haplotypes a chronic process can be elicited were the allograft kidney develops interstitial fibrosis and tubular atrophy. We have modified the surgical technique to reduce operating time and improve ease of surgery, however a learning curve still needs to be overcome in order to faithfully replicate the model. This study will provide key points in the surgical procedure and aid the process of establishing this technique.

Here, we present a protocol to study the immunology of rejection. The surgical model presented reports a short operating time and a concise technique. Depending on the donor-recipient strain combination, the transplanted kidney may develop acute cellular rejection or chronic allograft damage, defined by interstitial fibrosis and tubular atrophy.

Maus Nierentransplantation: Modelle der Transplantatabstoßung

Rejection of the transplanted kidney in humans is still a major cause of morbidity and mortality. The mouse model of renal transplantation closely ...

Transcutaneous Assessment of Renal Function in Conscious Rodents

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and time-consuming. In addition, serial blood or urine samples are required, with the associated stress for the experimental animals. A recent technique significantly reduces the investment in time and resources, minimizing the invasiveness and the animal stress, but being equally valid as the traditional approaches. The method measures transcutaneously renal function. Using an optical device and the exogenous renal marker fluorescein isothiocyanate (FITC)-sinistrin, this technique is capable of measuring the elimination kinetics of the marker through the skin. With neither blood nor urine samples nor the associated laboratory assays needed, the results of the transcutaneous measurement are almost instantaneously available. The method has been already validated in different species and successfully applied in several models of renal pathology. Moreover, due to its minimally invasive characteristics, it is suitable for sequential measurements within the same animal. Here is provided a detailed protocol to carry out the transcutaneous assessment of renal function in rodents.

Determination of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional procedures to measure this parameter are cumbersome and require a large investment of time. Here we describe a faster and minimally invasive method to determinate GFR transcutaneously.

Transkutane Beurteilung der Nierenfunktion in Conscious Nagetiere

Glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard to assess overall kidney function. However, traditional methods to evaluate GFR are cumbersome and ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

Biologie

Transdermal Measurement of Glomerular Filtration Rate in Mice

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of acute kidney injury and chronic kidney disease. The measurement system consists of a miniaturized fluorescence detector that is directly attached to the skin on the back of conscious, freely moving animals, and measures the excretion kinetics of the exogenous GFR tracer, fluorescein-isothiocyanate (FITC) conjugated sinistrin (an inulin analog). This system has been described in detail in rats. However, because of their smaller size, measurement of transcutaneous GFR in mice presents additional technical challenges. In this paper we therefore provide the first detailed practical guide to the use of transdermal GFR monitors in mice based on the combined experience of three different investigators who have been performing this assay in mice over a number of years.

Here we describe a protocol to measure glomerular filtration rate (GFR) in conscious, freely moving mice using a transdermal GFR monitor.

Transdermale Messung der glomerulären Filtrationsrate bei Mäusen

Transdermal analysis of glomerular filtration rate (GFR) is an established technique that is used to assess renal function in mouse and rat models of ...

Using 2-Photon Microscopy to Quantify the Effects of Chronic Unilateral Ureteral Obstruction on Glomerular Processes

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface glomeruli provide a unique opportunity to investigate physiological and pathophysiological processes using intravital 2-photon microscopy. Quantification of glomerular capillary blood flow and vasoconstriction and dilatation in response to drugs, permeability, and inflammation are just some of the processes that can be studied. In addition, transgenic rats, i.e., podocytes labeled with fluorescent dyes and other molecular biomarker approaches, provide increased resolution to directly monitor and quantify protein-protein interactions and the effects of specific molecular alterations.
In mice, which lack surface glomeruli after four weeks of age, unilateral ureteral obstruction (UUO) for several weeks has been used to induce surface glomeruli. As this induction model does not allow for baseline studies, we quantified the effects of UUO on glomerular processes in the UUO model in Munich Wistar Fr&#246;mter (MWF) rats, which have surface glomeruli under physiologic conditions. The UUO model for five weeks or more induced significant alterations to gross renal morphology, the peritubular and glomerular microvasculature, as well as the structure and function of tubular epithelia. Glomerular and peritubular red blood cell (RBC) flow decreased significantly (p &#60; 0.01), probably due to the significant increase in the adherence of white blood cells (WBCs) within glomerular and peritubular capillaries. The glomerular sieving coefficient of albumin increased from 0.015 &#177; 0.002 in untreated MWFs to 0.045 &#177; 0.05 in 5-week-old UUO MWF rats. Twelve weeks of UUO resulted in further increases in surface glomerular density and glomerular sieving coefficient (GSC) for albumin. Fluorescent albumin filtered across the glomeruli was not reabsorbed by the proximal tubules. These data suggest that using UUO to induce surface glomeruli limits the ability to study and interpret normal glomerular processes and disease alterations.

Here, we present a protocol using 2-photon microscopy in Munich Wistar Fromter rats with surface glomeruli to quantifythe effects of prolonged ureteral obstruction on glomerular dynamics and function.

Mit der 2-Photonen-Mikroskopie die Auswirkungen einer chronischen einseitigen Harnleiterobstruktion auf glomeruläre Prozesse quantifizieren

Applying novel microscopy methods to suitable animal disease models to explore the dynamic physiology of the kidney remains a challenge. Rats with surface ...

A Murine Model of Hemodialysis Access-Related Hand Dysfunction

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement therapies such as hemodialysis continues to increase. Autogenous arteriovenous fistula (AVF) placement remains a primary vascular access option for ESRD patients. Unfortunately, approximately half of the hemodialysis patients experience dialysis access-related hand dysfunction (ARHD), ranging from subtle paresthesia to digital gangrene. Notably, the underlying biologic drivers responsible for ARHD are poorly understood, and no adequate animal model exists to elucidate the mechanisms and/or develop novel therapeutics for the prevention/treatment of ARHD. Herein, we describe a new mouse model in which an AVF is created between the left common iliac artery and vein, thereby facilitating the assessment of limb pathophysiology. The microsurgery includes vessel isolation, longitudinal venotomy, creation of arteriovenous anastomosis, and venous reconstruction. Sham surgeries include all the critical steps except for AVF creation. Iliac AVF placement results in clinically relevant alterations in central hemodynamics, peripheral ischemia, and impairments in hindlimb neuromotor performance. This novel preclinical AVF model provides a useful platform that recapitulates common neuromotor perturbations reported by hemodialysis patients, allowing researchers to investigate the mechanisms of ARHD pathophysiology and test potential therapeutics.

This protocol details the surgical steps of murine common iliac arteriovenous fistula creation. We developed this model to study hemodialysis access-related limb pathophysiology.

Ein murines Modell der Hämodialysezugangsbedingten Handfunktionsstörung

Chronic kidney disease is a major public health problem, and the prevalence of end-stage renal disease (ESRD) requiring chronic renal replacement ...

Glomerular Outgrowth as an Ex Vivo Assay to Analyze Pathways Involved in Parietal Epithelial Cell Activation

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of pathways involved in parietal epithelial cell activation could therefore be a tool to attenuate the progression of glomerular diseases. This article describes a method to culture and analyze parietal epithelial cell outgrowth of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. After dissecting isolated mouse kidneys, the tissue is minced, and glomeruli are isolated by sieving. Encapsulated glomeruli are collected, and single glomeruli are cultured for 6 days to obtain glomerular outgrowth of parietal epithelial cells. During this period, parietal epithelial cell proliferation and migration can be analyzed by determining the cell number or the surface area of outgrowing cells. This assay can therefore be used as a tool to study the effects of an altered gene expression in transgenic- or knockout-mice or the effects of culture conditions on parietal epithelial cell growth characteristics and signaling. Using this method, important pathways involved in the process of parietal epithelial cell activation and consequently in glomerulosclerosis can be studied.

This article describes a method for culturing and analyzing glomerular parietal epithelial cell outgrowths of encapsulated glomeruli isolated from mouse kidney. This method can be used to study pathways involved in parietal epithelial cell proliferation and migration.

Glomeruläres Outgrowth als Ex-Vivo-Assay zur Analyse von Pfaden, die an der Parietalepithel Cell Activation beteiligt sind

Parietal epithelial cell (PEC) activation is one of the key factors involved in the development and progression of glomerulosclerosis. Inhibition of ...

Fluoreszenzmarkierung von Glomeruli in geklärten Mausnieren für die Mikroskopie

An Efficient and Fast Method for Labeling and Analyzing Mouse Glomeruli

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological imaging provides intuitive information; thus, it is of great significance to label and observe the glomeruli. However, the glomeruli observation methods currently in use require complicated operations, and the results may lose label details or three-dimensional (3D) information. The clear, unobstructed brain imaging cocktails and computational analysis (CUBIC) tissue clearing technology has been widely used in renal research, allowing for more accurate detection and deeper detection depth. We found that mouse glomeruli can be rapidly and effectively labeled by tail vein injection of medium molecular weight FITC-Dextran followed by the CUBIC clearing method. The cleared mouse kidney could be scanned by a light-sheet microscope (or a confocal microscope when sliced) to obtain three-dimensional image stacks of all the glomeruli in the entire kidney. Processed with appropriate software, the glomeruli signals could be easily digitized and further analyzed to measure the number, volume, and frequency of the glomeruli.

Autor im Rampenlicht: Unterstützung der Forschung in der Nierenbiologie durch Markierung von Glomeruli in geklärten Geweben 

This study presents an easy-to-use, complete, and simple set of methods to label and analyze glomeruli from CUBIC-cleared mouse kidneys. Data such as glomerulus number and volume can be obtained easily and reliably using fluorescein isothiocyanate (FITC)-Dextran, light sheet fluorescence microscopy (LSFM), or common confocal microscopy and software such as Imaris.

Eine effiziente und schnelle Methode zur Markierung und Analyse von Mausglomeruli

The glomeruli are fundamental units in the kidney; hence, studying the glomeruli is pivotal for understanding renal function and pathology. Biological ...