Ich danke Dr. Jessica Dominguez Rieg für die kritische Durchsicht des Manuskripts. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association (Scientist Development Grant 10SDG2610034), einem Carl W. Gottschalk Forschungsstipendium der amerikanischen Gesellschaft für Nephrologie, der National Institute of Diabetes and Digestive und Nierenkrankheiten O&#39;Brien Center for Acute Kidney Injury Forschung ( P30DK079337) und das Department of Veterans Affairs.

1. Lösungen <ol><li> 0,85% NaCl: 8,5 g NaCl / 1 l ddH 2 O (8,5 g / L). </li><li> 0,5 mol / l HEPES pH 7,4 (59,6 g gelöst in 0,5 L HEPES ddH 2 0 und pH-Wert auf 7,4 mit 10 N NaOH). </li></ol> 2. Herstellung von FITC-Inulin Injektionslösung <ol><li> Wiegen FITC-Inulin eine 5% ige Lösung herzustellen und in 0,85% NaCl (in der Regel 100 mg / 2 ml 0,85% NaCl) aufgelöst durch Erwärmen auf 90 ° C bis zur vollständigen Auflösung. </li><li> Wiegen Sie gelösten FITC-Inulin-Lösung und Gewichtsangaben beachten. </li><li> Schneiden Sie ein 20 cm Stück Dialysemembran (molecular weight cut-off: 1.000) und in ddH2O für 30 min, um das restliche NaN 3 von der Membran zu entfernen und bündig ein paar Mal danach. </li><li> Füllen gelöst FITC-Inulin in Dialysemembran und Dichtung richtig mit Verschlüssen. </li><li> Wiegen gesamte Dialysemembran. </li><li> Legen Sie die Dialysemembran in 1 L 0,85% NaCl-Lösung und langsam rühren für 24 h bei ro-Licht geschütztom Temperatur. </li><li> Wiegen gesamte Dialysemembran wieder und berechnen Sie die neue Konzentration (Wasser osmotisch in die Membran und ungebundenen FITC verschieben oder gebunden FITC-Inulin &lt;1.000 Molekulargewicht bewegen wird aus der Membran, damit die Konzentration von FITC-Inulin wird erheblich verringern) . </li><li> Die neue FITC-Inulin-Konzentration (c) berechnet sich nach folgender Formel: c = n / V, wobei n = initial FITC-Inulin Menge, V = new Volumen (Unterschied im Gewicht von Dialyseschlauch vor und nach der Dialyse sowie Volumen der anfänglichen FITC-Inulin-Lösung). </li><li> Vor dem Gebrauch sterilisieren dialysierten FITC-Inulin Lösung durch Filtration durch ein 0,22 um Filter Spritze. </li><li> FITC-Inulin aus Licht (Aluminiumfolie) Halten bei 4 ° C geschützt Dialysiert und sterilisiert FITC-Inulin kann für bis zu 2 Wochen verwendet werden. Teilgenommen FITC-Inulin durch erneutes Erwärmen kann bei 90 ° C werden für ein paar Minuten gelöst. </li></ol> Hinweis: Wenn SieFITC-Sinistrin 16-18, die keine Dialyse können alle Schritte für die Dialyse erforderlichen übersprungen. 3. Injektions-und Blutentnahme <ol><li> Nehmen Körpergewicht (KG) der Mäuse vor dem Experiment. </li><li> Anesthetize Mäuse kurz mit Isofluran. </li><li> Für hohen Durchsatz von 6 Mäusen folgen Sie bitte Protokoll in Abbildung 3 vorgesehen. </li><li> Spritzen 2 ul / g bw dialysiertes FITC-Inulin in den Plexus retroorbitalen 24 durch die Verwendung eines G30 ½ in Nadel (entfernen Luftblasen aus 100 ul Hamilton Spritze indem Sie zuerst eine G26 ½ in Nadel-und dann der Wechsel zu einem G30 ½ in Nadel für Injektion). </li><li> Cut 1 mm von Maus Schwanz mit einer Schere einmal sammeln und Blut bei 3, 5, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 min nach der Injektion in Na-Heparin minicapillaries. Seal minicapillaries nach der Blutentnahme mit Cha-Siegel. </li><li> Die Proben vor Licht geschützt. </li><li> Setzen versiegelten minicapillaries innerhalb Hämatocrit Kapillaren und Zentrifuge für 5 min. </li><li> Brechen minicapillaries mithilfe eines Diamantschneiders und Transfer gesamte Plasma durch Pipettieren in einer 0,2-ml-Tube. </li><li> Machen Sie eine 1:10-Verdünnung mit 2 ul Plasma und 18 ul 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4) in neuen 0,2 ml Röhrchen (Proben konnten über Nacht bei 4 ° C gelagert werden für die Fluoreszenz-Messungen). </li><li> Maßnahme 2 ul verdünnte Probe mit NanoDrop 3300 in Duplikate. Die Beschreibung und die Nutzung des Instruments ist hier 5 beschrieben. </li></ol> 4. Herstellung von Standards <ol><li> Sammle Blut von Mäusen aus dem gleichen Hintergrund Stamm in Heparin beschichtet Hämatokritkapillaren, Spin-down und 1:10 verdünnen mit 0,5 mol / L HEPES (pH 7,4), in der Regel 80 ul Plasma + 720 ul HEPES. </li><li> Verdünnen FITC-Inulin Injektionslösung mit verdünnter Mäuseplasma folgende Standardverdünnungen erhalten: 01.10: 10 ul unverdünnt FITC-Inulin-Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma 1:100: 10 &amp; mu; L (1:10) Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma 1:1000: 10 ul (1:100) Lösung + 90 ul verdünnte Mäuseplasma 1:2.000: 30 ul (1:1)-Lösung + 30 ul verdünnte Mäuseplasma 1:10.000: 10 ul (1:5)-Lösung + 40 ul verdünnte Mäuseplasma 1:20.000: 20 ul (1:1)-Lösung + 20 ul verdünnte Mäuseplasma 1:100.000: 10 ul (1:5)-Lösung + 40 ul verdünnte Mäuseplasma Die Konzentration der Standards auf der Dialyse abhängig und wird immer für jede Zubereitung von FITC-Inulin. Es ist notwendig, die Konzentration des Standard-Kurve immer wieder neu ein. </li><li> Analysieren von Daten zu GFR mit der entsprechenden Software (zB GraphPad Prism) berechnen durch Verwendung eines Zwei-Phasen-exponentiellen Funktion wie in hier 15, 20 beschrieben und in Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. </li></ol>

<ol>
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Am. Soc. Nephrol. 19 (4), 722-730 (2008).</li><li>FINGL, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tubular+excretion+of+creatinine+in+the+rat.">Tubular excretion of creatinine in the rat.</a> Am. J. Physiol. 169 (2), 357-362 (1952).</li><li>Keppler, A., Gretz, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+creatinine+determination+in+mice+and+rats:+an+enzymatic+method+compares+favorably+with+a+high-performance+liquid+chromatography+assay.">Plasma creatinine determination in mice and rats: an enzymatic method compares favorably with a high-performance liquid chromatography assay.</a> Kidney Int. 71 (1), 74-78 (2007).</li><li>Levey, A. S., Perrone, R. D., Madias, N. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picric+acid+methods+greatly+overestimate+serum+creatinine+in+mice:+more+accurate+results+with+high-performance+liquid+chromatography.">Picric acid methods greatly overestimate serum creatinine in mice: more accurate results with high-performance liquid chromatography.</a> Anal. Biochem. 144 (1), 285-290 (1985).</li><li>Qi, Z., Breyer, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice.">Measurement of glomerular filtration rate in conscious mice.</a> Methods Mol. Biol. 466, 61-72 (2009).</li><li>Qi, Z., Whitt, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+determination+of+glomerular+filtration+rate+in+conscious+mice+using+FITC-inulin+clearance.">Serial determination of glomerular filtration rate in conscious mice using FITC-inulin clearance.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 286 (3), F590-F596 (2004).</li><li>Schock-Kusch, D., Sadick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+glomerular+filtration+rate+using+FITC-sinistrin+in+rats.">Transcutaneous measurement of glomerular filtration rate using FITC-sinistrin in rats.</a> Nephrol. Dial Transplant. 24 (10), 2997-3001 (2009).</li><li>Schock-Kusch, D., Xie, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+assessment+of+renal+function+in+conscious+rats+with+a+device+for+measuring+FITC-sinistrin+disappearance+curves.">Transcutaneous assessment of renal function in conscious rats with a device for measuring FITC-sinistrin disappearance curves.</a> Kidney Int. 79 (11), 1254-1258 (2011).</li><li>Schreiber, A., Shulhevich, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcutaneous+measurement+of+renal+function+in+conscious+mice.">Transcutaneous measurement of renal function in conscious mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 303 (5), F783-F788 (2012).</li><li>Shemesh, O., Golbetz, H., Kriss, J. P., Myers, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Limitations+of+creatinine+as+a+filtration+marker+in+glomerulopathic+patients.">Limitations of creatinine as a filtration marker in glomerulopathic patients.</a> Kidney Int. 28 (5), 830-838 (1985).</li><li>Sturgeon, C., Sam, A. D., Law, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+determination+of+glomerular+filtration+rate+by+single-bolus+inulin:+a+comparison+of+estimation+analyses.">Rapid determination of glomerular filtration rate by single-bolus inulin: a comparison of estimation analyses.</a> J. Appl. Physiol. 84 (6), 2154-2162 (1998).</li><li>Vallon, V., Blantz, R. C., Thomson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+[corrected]+type+1+diabetes+mellitus:+a+tubulo-centric+view.">Glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early [corrected] type 1 diabetes mellitus: a tubulo-centric view.</a> J. Am. Soc. Nephrol. 14 (2), 530-537 (2003).</li><li>Vallon, V., Eraly, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+the+organic+anion+transporter+OAT3+in+renal+creatinine+secretion+in+mice.">A role for the organic anion transporter OAT3 in renal creatinine secretion in mice.</a> Am. J. Physiol. Renal Physiol. 302 (10), F1293-F1299 (2012).</li><li>Vallon, V., Schroth, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenosine+A(1)+receptors+determine+glomerular+hyperfiltration+and+the+salt+paradox+in+early+streptozotocin+diabetes+mellitus.">Adenosine A(1) receptors determine glomerular hyperfiltration and the salt paradox in early streptozotocin diabetes mellitus.</a> Nephron. Physiol. 111 (1), 30-38 (2009).</li><li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retro-orbital+injections+in+mice.">Retro-orbital injections in mice.</a> Lab Anim. (NY. 40 (5), 155-160 (2011).</li></ol>

Der Autor erhielt die Finanzierung der Kosten dieser Publikation von Thermo Fisher Scientific decken.

Die vorliegende Studie beschreibt eine Technik zur Bestimmung der GFR in wachen Mäusen durch Single-Bolus-Injektion und Analyse von Fluoreszenz in 8 Blutproben mittels Zweiphasen-exponentiellen Abfall. Eine GFR Messung in 1 Maus dauert 75 min. Durch Verwendung eines speziellen Flussdiagramm, ist es möglich, die GFR von 6 Mäusen in 130 min zu messen. Es ist möglich, dieses Flussdiagramm-Protokoll bis zu 4 Mal pro Tag wiederholen und messen GFR in 24 Mäuse. Wir modifizierten diese Methode, so dass es möglich ist, Blut aus einem kleinen Schwanz snip anstatt Schwanzvene Punktion, die schneller und einfacher für Ermittler im Vergleich zu Schwanzvene Punktion durchzuführen sammeln. Durch die Verwendung von 10 ul Hämatokritkapillaren und einer 1:10-Verdünnung, ist es möglich, die gesamte Menge des Blutes benötigt, um &lt;100 ul zu reduzieren. Schließlich wird die Fluoreszenz gemessen mit einem NanoDrop 3300 Fluorospektrometer, die Bestimmung der Fluoreszenz ermöglicht in 1-2 ul verdünnten Probe. Diese Methode wird dem interessierten investigatora wahre GFR Wert. Im Gegensatz dazu haben Kreatinin-Messungen bei Mäusen mehrere Schwachstellen, darunter &quot;Kreatinin-blinden Bereich&quot; und Schwierigkeiten im Zusammenhang mit spezifischen und sensitiven Bestimmung. Die &quot;Kreatinin-blinden Bereich&quot; schränkt seine Funktion als Marker für GFR weil Serum-Kreatinin bleibt im normalen Bereich bis 50% der Nierenfunktion 19 verloren. Da mehrere Forscher genetisch veränderte Mäuse in ihrer Forschung zu Nieren-Physiologie und Pathophysiologie studieren nutzen, trägt dies folgendes Problem: Annahme einer Knockout-Maus von Gen-X würde eine deutlich geringere GFR (um 40%) im Vergleich zu einer Wildtyp-Maus, eine haben einfache Screening durch Vergleich Plasma-Kreatinin würde nicht erkennen diesen Unterschied. Die Notwendigkeit für eine gute genaue Methode zur Bestimmung GFR wird immer kritischer, je kleiner die Unterschiede in GFR geworden. Mäuse haben hohe Konzentrationen von nicht-Kreatinin Chromagene in ihrem Plasma und Urin, die mit kommerziell störenverfügbar Kreatinin-Assays. Als Folge Assays, die auf der alkalischen picrate Jaffé Reaktion Überschätzung Kreatinin-Konzentration im Plasma bezogen sind mit Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) Bestimmung 6, 13 verglichen. Eine weitere Einschränkung ist, dass Serum-Kreatinin ist unterhalb der Nachweisgrenze von mehreren kommerziell erhältlichen Assays im Vergleich zu HPLC-Bestimmung. Durch Verwendung von enzymatischen Reaktionen Ermittler konnten Plasma Kreatinin in Mäusen 10, 22 zu bestimmen. GFR in einem ähnlichen Bereich wurden in wachen Mäusen mit einem vergleichbaren Single-Bolus-Injektion Verfahren sowie Harn-FITC-Inulin-Clearance 14 gefunden. Im Gegensatz zu ihr Protokoll, unser Protokoll mit Schwanz snip erfordern keine besonderen Vorsichtsmaßnahmen, um das Gefäß Integrität gegenüber Schwanzvene oder Vena saphena Punktion zu bewahren. Für den Harn / Plasma basierend FITC-Inulin-Clearance ist es notwendig, chirurgisch Implantat zwei osmotischen minipumps. Zwei Pumpen sind notwendig, um hoch genug Steady-State-Plasmaspiegel FITC-Inulin-Konzentrationen, die deutlich vom Hintergrund zu erzielen. Dies erfordert auch die Nutzung der metabolischen Käfigen für eine vollständige und zeitlich Urinsammlung. Die Käfige müssen zur Rechenschaft für einen Verlust von 25-37% des FITC-Inulin, die sonst tritt ohne Spülung gespült werden. Die Fallstricke der Verwendung dieses FITC-Inulin Verfahren sind begrenzt. Die Ermittler sollten Sie Folgendes beachten: (i) zu gewährleisten, dass es keine Luftblasen in der Spritze für die Injektion des FITC-Lösung verwendet wird, muss (ii) vollständige retrobulbären Injektion erreicht werden, weil die Menge eingespritzt bestimmt die GFR berechnet werden, und ( iii) Mäusen wird höchstwahrscheinlich urinieren während der 75 min GFR Experiment, so dass eine Verschmutzung Blutproben mit Urin, die eine sehr hohe FITC-Inulin Konzentration als Folge der Nieren Konzentrationsfähigkeit haben. Allgemeine Vorteile of diese FITC-Inulin Verfahren umfassen die folgenden: (i) es ist ein nicht-radioaktives Technik, (ii) es möglich ist, wiederholt Messungen mehrfach in der gleichen Maus, (iii) kann der Assay in wachen Mäusen durchgeführt werden ( iv) keine Urinsammlung erforderlich ist, und (v) eine Hochdurchsatz-Option verwendet werden. Nachteile für die einzelnen Bolus-Injektion sind die Notwendigkeit zur Dialyse von FITC-Inulin, das durch die Verwendung eines besser FITC-Marker, FITC-Sinistrin, die jetzt zur Verfügung steht und kann transkutan gemessen werden unter Verwendung eines speziellen miniaturisierten 18 überwunden werden können. Obwohl GFR gemessen wird, ist es nicht möglich, fraktionierte Ausscheidungen von Flüssigkeit oder Ionen mit dieser Methode zu messen. Zusammengenommen bietet dieses Verfahren die Machbarkeit eines High-Throughput-Verfahren zur Messung der GFR in wachen Mäusen. Daher könnte diese Technik von Interesse für andere Forscher, die daran interessiert bei der Bestimmung der Nierenfunktion bei Mäusen sein.

Die Geschwindigkeit der Bildung von Plasma-Ultrafiltrat am Glomerulus hat sich die Grundlage für die Beurteilung der Nierenfunktion (glomeruläre Filtrationsrate, GFR). Der ideale Marker GFR bestimmen sollte frei gefiltert werden, weder sezerniert oder resorbiert und nicht metabolisiert. Ein solches Verhalten wurde festgestellt, dass für Inulin wahr, und Inulin-Clearance hat sich eine Gold-Standard zur Bestimmung der GFR 3. Während die Clearance von Kreatinin wird weitgehend als ein Maß der GFR bei Menschen und Tieren eingesetzt werden, stellt Kreatinin erfüllen nicht die Anforderungen an ein ideales GFR-Marker. Rund 10 - 40% der Kreatinin-Clearance beim Menschen ist die Folge der aktive tubuläre Sekretion 1, 11, und die renale Sekretion von Kreatinin ist auch prominent in Mäusen und Ratten 4, 7, 9, 22. Nierenfunktionsstörung ist bekannt, dass die röhrenförmige Sekretion von Kreatinin, was deren Wert begrenzt als Marker der GFR 1, 2 erhöhen. Wir haben bereits, dass organisches Anion Transporter Isoform gezeigt3 (OAT3) trägt zur Maus Kreatinin-Sekretion 22. Jedoch Inulin-Clearance erfordert typischerweise die Verwendung von radioaktiv markierten Inulin (3 H oder 14 C). Die radioaktive Bestimmung von Inulin kann sowohl betäubt und wachen Mäusen verwendet werden, sondern birgt den Nachteil zahlreicher Sicherheitsvorschriften und Handhabung strenge Fragen bei der Verwendung radioaktiver Isotope. Entlang dieser Linien, sind chirurgische Clearance Vorbereitungen zur Bestimmung der GFR zeitaufwendig sowie Terminal in der Natur. 1999 Lorenz et al. 12 eingeführt FITC-Inulin als Marker der einzige Nephron GFR bei narkotisierten Mäusen. Fünf Jahre später Qi et al. Bestimmt ganze 15 GFR in wachen Mäusen mit FITC-Inulin. Alternative Protokolle sind jetzt mit FITC-Inulin als exogene Marker GFR in bewusste und narkotisierten Mäusen messen. Diese Protokolle behalten die Empfindlichkeit des radioaktiven Inulin mit Fluoreszenz DETECTIauf und umgeht die Nachteile der Zusammenarbeit mit einem radioaktiv markierten Marker. Die FITC-Inulin Assay wurde von anderen 7, 8 und uns 22, 23 modifiziert werden, um die Vorteile der Mikrovolumen Fähigkeit des NanoDrop 3300 Fluorospektrometer nehmen. Dies ermöglicht die Verringerung der gesamten Probenmenge benötigt, um &lt;100 ul Blut pro GFR-Messung. Mit dem Verfahren und Hochdurchsatz-Protokoll in dieser Veröffentlichung zeigen wir die Machbarkeit von Mess-GFR in bis zu 24 Mäuse pro Tag bewusst. Diese Technik könnte nützlich sein, um andere Forscher studieren Maus GFR und wir hoffen, dass es weniger genaue Methoden als Indizes für die Nierenfunktion, wie Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC-inulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3272</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7706</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Webster Veterinary</td>
			<td>78366551</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis membrane (MWCO 1000)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132636</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Membrane closure</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>132736</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 &mu;l Hematocrit capillaries</td>
			<td>Drummond Scientific</td>
			<td>22362566</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematocrit centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Micro-MB</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 &mu;l Na+-Heparin minicaps</td>
			<td>Hirschmann</td>
			<td>9000210</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (100 &mu;l)</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>80601</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorospectrometer</td>
			<td>Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td>NanoDrop 3300</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (0.22 &mu;m)</td>
			<td>Spectrum Laboratories</td>
			<td>880-26464-UE</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sealant</td>
			<td>Ch&acirc;-seal</td>
			<td>510</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles (G26 &frac12; and G30 &frac12;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>305111 &amp; 305106</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput method for measurement of glomerular filtration rate in conscious mice

Die Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard in der Nierenfunktion Einschätzung. Zurzeit bestimmen Ermittler GFR durch Messen des Pegels des endogenen Biomarker Kreatinin oder exogen applizierten radioaktiv markierten Inulin (3 H oder 14 C). Kreatinin hat den wesentlichen Nachteil, dass proximalen tubulären Sekretion Konten für ~ 50% der gesamten Kreatinin-Ausscheidung und damit Kreatinin kein verlässlicher Marker GFR. Je nach Experiment durchgeführt, kann Inulin-Clearance durch eine intravenöse einzigen Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion (intravenös oder osmotische Minipumpe) bestimmt werden. Beide Ansätze erfordern die Sammlung von Plasma oder Plasma und Urin sind. Andere Nachteile von radioaktiv markierten Inulin enthalten sind die Nutzung von Isotopen, zeitaufwendig chirurgische Vorbereitung der Tiere, und die Forderung nach einer Terminal Experiment. Hier beschreiben wir eine Methode, die einen einzigen Bolus-Injektion von verwendetFluoreszeinisothiocyanat-(FITC) markiert Inulin und die Messung der Fluoreszenz in 1-2 ul verdünntem Plasma. Durch die Anwendung eines Zwei-Kammer-Modell mit 8 Blutsammlungen pro Maus, ist es möglich, in GFR messen bis zu 24 Mäuse pro Tag mit einem speziellen Workflow-Protokoll. Diese Methode erfordert nur kurze Isofluran-Narkose mit allen Blutproben in einer nicht-zurückhaltend und wach Maus gesammelt. Ein weiterer Vorteil ist, dass es möglich ist, Mäusen über einen Zeitraum von mehreren Monaten und Behandlungen (dh tun gepaart Experimente mit Veränderungen in der Ernährung oder medikamentöse Anwendungen) folgen. Wir hoffen, dass diese Technik von Mess-GFR nützlich für andere Forscher studieren Maus Nierenfunktion und weniger genaue Methoden zur Schätzung der Nierenfunktion, wie Plasma-Kreatinin und Blut-Harnstoff-Stickstoff zu ersetzen.

GFR wird anhand der folgenden Formel berechnet werden: GFR = n / (A/K1 + B/K2), wo n = eingespritzte Menge (n = c • V, wobei c = FITC-Inulin Konzentration, V = injizierte Volumen) A = span1, der Beseitigung y-Achsenabschnitt K1 = Abklingkonstante zur Beseitigung B = span2, y-Achsenabschnitt der Verteilung K2 = Zerfallskonstante für den Vertrieb Hinweis: A, K1, K2 und B Abkürzungen von GraphPad Prism, jede Software geeignet zur Analyse von zwei Phase exponentiellen Abfall gegeben genutzt werden kann, aber auch andere wissenschaftliche Software können unterschiedliche Abkürzungen verwenden. Durch die Verwendung eines Zwei-Phasen-exponentiellen Kurvenanpassung, die auf Plasma FITC-Inulin-Konzentrationen basiert, sollte eine Kurve vergleichbar mit der in Fig. 1 gezeigt ist, erhalten werden. Berechnung GFR durch die oben gezeigte Formel (und, wie hier beschrieben &lt;sup&gt; 20) ermöglicht eine Beeinträchtigung der Nierenfunktion 15 oder glomeruläre Hyperfiltration 8, 23 zu erkennen als bei Mäusen mit Diabetes mellitus Typ 1 (Abbildung 2). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig1.jpg" /> Abbildung 1. Um GFR in wachen Mäusen messen, Plasmakinetik von FITC-Inulin nach einer Einzel-Dosis intravenöse Injektion verwendet wird. Für die Berechnung der GFR wird ein Zwei-Kammer-Modell eingesetzt. In dem Zwei-Kammer-Modell stellt die anfänglichen schnellen Abklingphase Umverteilung von FITC-Inulin aus der intravaskulären Abteil der extrazellulären Flüssigkeit. Die späteren Phase mit langsamer Zerfall in FITC-Inulin Konzentration, vorherrschend spiegelt systemische Clearance aus dem Plasma. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig2.jpg" /> Abbildung 2. Detection der diabetischen Hyperfiltration in Wildtyp-Mäusen. Typ I-Diabetes mellitus wurde durch intraperitoneale Anwendung von Streptozotocin (STZ, 50 mg / kg an 5 aufeinanderfolgenden Tagen). GFR wurde vor (basal) und 5 Wochen nach Induktion des Diabetes bestimmt. Aufgrund tubuloglomerulären Feedback bewirkt eine Zunahme der primären proximalen Resorption frühen diabetischen Hyperfiltration 21 ein Befund, der reproduzierbar ist in Wildtyp-Mäusen (n = 10, p &lt;0,01 vs basale gleichen Maus). <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/50330/50330fig3.jpg"/> Abbildung 3. Flussdiagramm für die Messung der GFR in einem Satz von 6 Mäusen. Um ganze GFR durch den einzigen Bolus-Injektion Verfahren zu messen, muss 8 Blutproben bei 3, 5 gesammelt werden, 7, 10, 15, 35, 56 und 75 min nach FITC-Inulin Injektion. Die Zahlen geben Zeitpunkten. Die Zahlen in Klammern geben Stichprobengröße. Die Zeitpunkte der vertikale rote Linie links zeigen InjektionZeitpunkten (bei 0, 11, 22, 33, 44 und 55 min). Jede Maus wird mit einer anderen Farbe markiert. Um sequentielle Blutsammlungen bekommen folgen Sie den Pfeilen. Graue Felder zeigen an, wann die nächste Maus für Isofluran-Narkose vor der Injektion muss vorbereitet werden. Über dieses Protokoll die minimale Zeit zwischen 2 Blutentnahmen aus verschiedenen Mäusen ist 1 min.

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A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard für die Beurteilung der Nierenfunktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die die Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen unter Verwendung einer einzigen Bolusinjektion Bestimmung Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Inulin in Plasma und Berechnung der GFR durch eine Zwei-Phasen-exponentiellen Modell ermöglicht.

Ein High-Throughput-Verfahren zur Messung der glomerulären Filtrationsrate in Conscious Mäuse

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

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Research

JoVE Journal

Biology

43.1K Aufrufe.  University of California, San Diego. Messung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) ist der Goldstandard für die Beurteilung der Nierenfunktion. Hier beschreiben wir ein Verfahren mit hohem Durchsatz, die die Bestimmung der GFR bei wachen Mäusen unter Verwendung einer einzigen Bolusinjektion Bestimmung Fluoresceinisothiocyanat (FITC)-Inulin in Plasma und Berechnung der GFR durch eine Zwei-Phasen-exponentiellen Modell ermöglicht.

Serie: A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

A high-throughput method to globally study the organelle morphology in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help achieve an comprehensive understanding of molecular pathways. In Saccharomyces cerevisiae, with the development of the non-essential gene deletion array, we can globally study the morphology of different organelles like the endoplasmic reticulum (ER) and the mitochondria using GFP (or variant)-markers in different gene backgrounds. However, incorporating GFP markers in each single mutant individually is a labor-intensive process. Here, we describe a procedure that is routinely used in our laboratory. By using a robotic system to handle high-density yeast arrays and drug selection techniques, we can significantly shorten the time required and improve reproducibility. In brief, we cross a GFP-tagged mitochondrial marker (Apc1-GFP) to a high-density array of 4,672 nonessential gene deletion mutants by robotic replica pinning.  Through diploid selection, sporulation, germination and dual marker selection, we recover both alleles. As a result, each haploid single mutant contains Apc1-GFP incorporated at its genomic locus. Now, we can study the morphology of mitochondria in all non-essential mutant background. Using this high-throughput approach, we can conveniently study and delineate the pathways and genes involved in the inheritance and the formation of organelles in a genome-wide setting.

GFP-fusion proteins are widely used to visualize organelles by confocal microscopy. However, screening for mutations that affect the morphology of organelles generally requires individual mutagenesis and is time consuming. Here, we demonstrate a method to simultaneously incorporate organelle-GFP markers in almost 5,000 non-essential genes in yeast.

Ein High-Throughput-Verfahren zur global Studie der Organellen-Morphologie in S. cerevisiae

High-throughput methods to examine protein localization or organelle morphology is an effective tool for studying protein interactions and can help ...

Forschung

Biologie

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to the original protocol that both streamline the procedure and increase sample uniformity.  First, we normalize all sperm volumes using freezing media that does not contain the cryoprotectant. Second, cryopreserved sperm are stored in cryovials instead of capillary tubes.  The rates of sperm freezing and thawing (&delta;&deg;C/time) are probably the two most critical variables to control in this procedure.  For this reason, do not substitute different tubes for those specified.  Working in teams of 2 it is possible to freeze the sperm of 100 males per team in ~2 hrs.  Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility (measured as the number of viable embryos generated in an in vitro fertilization divided by the total number of eggs fertilized) and this percent fertility is stable over many years.

A High-Throughput Method For Zebrafish Sperm Cryopreservation and In Vitro Fertilization

This is a high-throughput sperm cryopreservation protocol for zebrafish. Sperm cryopreserved using this protocol has an average of 25% fertility in subsequent vitro fertilization and is stable over many years.

Ein High-Throughput-Methode für Zebrabärblinge Sperma Kryokonservierung und In Vitro Fertilisation

This is a method for zebrafish sperm cryopreservation that is an adaptation of the Harvey method (Harvey et al., 1982).  We have introduced two changes to ...

A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins (RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding location often influences function of a splicing factor.  However, as with any sampling strategy the chance of identifying an RNA bound to a splicing factor is proportional to its cellular abundance.  We have developed a novel in vitro approach for surveying binding specificity on otherwise transient pre-mRNA. This approach utilizes a specifically designed oligonucleotide pool that tiles across introns, exons, splice junctions, or other pre-mRNA.  The pool is subjected to some kind of molecular selection. Here, we demonstrate the method by separating the oligonucleotide into a bound and unbound fraction and utilize a two color array strategy to record the enrichment of each oligonucleotide in the bound fraction. The array data generates high-resolution maps with the ability to identify sequence-specific and structural determinates of ribonucleoprotein (RNP) binding on pre-mRNA.  A unique advantage to this method is its ability to avoid the sampling bias towards mRNA associated with current IP and SELEX techniques, as the pool is specifically designed and synthesized from pre-mRNA sequence. The flexibility of the oligonucleotide pool is another advantage since the experimenter chooses which regions to study and tile across, tailoring the pool to their individual needs.  Using this technique, one can assay the effects of polymorphisms or mutations on binding on a large scale or clone the library into a functional splicing reporter and identify oligonucleotides that are enriched in the included fraction.  This novel in vitro high-resolution mapping scheme provides a unique way to study RNP interactions with transient pre-mRNA species, whose low abundance makes them difficult to study with current in vivo techniques.  



A Rapid High-throughput Method for Mapping Ribonucleoproteins RNPs on Human pre-mRNA

Due to the transient nature of pre-mRNA, it can be difficult to isolate and study in vivo. Here, we present a novel in vitro approach to investigate RNA-protein interactions using a synthetic oligo pool that tiles across selected regions of pre-mRNA.

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Sequencing RNAs that co-immunoprecipitate (co-IP) with RNA binding proteins has increased our understanding of splicing by demonstrating that binding ...

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Environmental Samples

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1. Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since they do not react with colorimetric reagents2,3. Enzymatic hydrolysis (EH) is an emerging method for accurately characterizing organic P forms in environmental samples4,5. This method is only trumped in accuracy by Phosphorus-31 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (31P-NMR) -a method that is expensive and requires specialized technical training6. We have adapted an enzymatic hydrolysis method capable of measuring three classes of phosphorus (monoester P, diester P and inorganic P) to a microplate reader system7. This method provides researchers with a fast, accurate, affordable and user-friendly means to measure P species in soils, sediments, manures and, if concentrated, aquatic samples. This is the only high-throughput method for measuring the forms and enzyme-lability of organic P that can be performed in a standard laboratory. The resulting data provides insight to scientists studying system nutrient content and eutrophication potential.

This protocol describes a high-throughput method of enzymatic hydrolysis that utilizes a microplate reader to measure and classify soil phosphorus as P monoesters, P diesters and inorganic P. Up to 96 samples can be measured at one time in a standard laboratory.

High-Throughput Measurement and Classification of Organic P in Umweltproben

Many types of organic phosphorus (P) molecules exist in environmental samples1.  Traditional P measurements do not detect these organic P compounds since ...

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping project is to collect a tissue sample from each individual plant. The traditional approach to this task is to sample plants one-at-a-time. If one wishes to genotype hundreds or thousands of individuals, however, using this strategy results in a significant bottleneck in the genotyping pipeline. The Ice-Cap method that we describe here provides a high-throughput solution to this challenge by allowing one scientist to collect tissue from several thousand seedlings in a single day 1,2. This level of throughput is made possible by the fact that tissue is harvested from plants 96-at-a-time, rather than one-at-a-time.
The Ice-Cap method provides an integrated platform for performing seedling growth, tissue harvest, and DNA extraction. The basis for Ice-Cap is the growth of seedlings in a stacked pair of 96-well plates. The wells of the upper plate contain plugs of agar growth media on which individual seedlings germinate. The roots grow down through the agar media, exit the upper plate through a hole, and pass into a lower plate containing water. To harvest tissue for DNA extraction, the water in the lower plate containing root tissue is rapidly frozen while the seedlings in the upper plate remain at room temperature. The upper plate is then peeled away from the lower plate, yielding one plate with 96 root tissue samples frozen in ice and one plate with 96 viable seedlings. The technique is named "Ice-Cap" because it uses ice to capture the root tissue. The 96-well plate containing the seedlings can then wrapped in foil and transferred to low temperature. This process suspends further growth of the seedlings, but does not affect their viability. Once genotype analysis has been completed, seedlings with the desired genotype can be transferred from the 96-well plate to soil for further propagation. We have demonstrated the utility of the Ice-Cap method using Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings. We expect that the method should also be applicable to other species of plants with seeds small enough to fit into the wells of 96-well plates.

Ice-Cap: A Method for Growing Arabidopsis and Tomato Plants in 96-well Plates for High-Throughput Genotyping

The Ice-Cap method allows one to grow plants in 96-well plates and non-destructively harvest root tissue from each seedling. DNA extracted from this root tissue can be used for genotyping reactions. We have found that Ice-Cap works well for Arabidopsis thaliana, tomato, and rice seedlings.

Ice-Cap: Ein Verfahren zur Züchtung von Arabidopsis Und Tomatenpflanzen in 96-well-Platten für High-Throughput-Genotypisierung

It is becoming common for plant scientists to develop projects that require the genotyping of large numbers of plants. The first step in any genotyping ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

High-Throughput-Kristallisation von Membranproteinen mit dem Lipidische Bicellen Methode

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

Hochdurchsatz-Mikroinjektionen von Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.

Messung der Stoffwechselrate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Mit Respirationstest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...

Physiology Lab Demonstration: Glomerular Filtration Rate in a Rat

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function in health and disease. GFR is measured as the steady state renal clearance of inulin which is filtered at the glomerulus, but not secreted or reabsorbed along the nephron. The fractional excretion of Na and K can be determined from the concentration of Na and K in plasma and urine. The renal clearance of inulin can be demonstrated in an anesthetized animal which has catheters in the femoral artery, femoral vein and bladder. The equipment and supplies used for this procedure are those commonly available in a research core facility, and thus makes this procedure a practical means for measuring renal function. The purpose of this video is to demonstrate the procedures required to perform a lab demonstration in which renal function is assessed before and after a diuretic drug. The presented technique can be utilized to assess renal function in rat models of renal disease.

The purpose of this protocol is to demonstrate the principles and techniques for measuring and calculating glomerular filtration rate, urine flow rate, and excretion of sodium and potassium in a rat. This demonstration can be used to provide students with an overall conceptual understanding of how to measure renal function.

Physiology Lab Demonstration: glomeruläre Filtrationsrate in einem Ratten-

Measurements of glomerular filtration rate (GFR), and the fractional excretion of sodium (Na) and potassium (K) are critical in assessing renal function ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays focus on transcriptional regulation, being essentially aimed at the identification of promoter-targeting molecules. As a result, post-transcriptional mechanisms are largely uncovered by gene expression targeted drug development. Here we describe a cell-based assay aimed at investigating the role of the 3&#39; untranslated region (3&#8217; UTR) in the modulation of the fate of its mRNA, and at identifying compounds able to modify it. The assay is based on the use of a luciferase reporter construct containing the 3&#8217; UTR of a gene of interest stably integrated into a disease-relevant cell line. The protocol is divided into two parts, with the initial focus on the primary screening aimed at the identification of molecules affecting luciferase activity after 24 hr of treatment. The second part of the protocol describes the counter-screening necessary to discriminate compounds modulating luciferase activity specifically through the 3&#8217; UTR. In addition to the detailed protocol and representative results, we provide important considerations about the assay development and the validation of the hit(s) on the endogenous target. The described cell-based reporter gene assay will allow scientists to identify molecules modulating protein levels via post-transcriptional mechanisms dependent on a 3&#8217; UTR.

Here we describe a cell-based reporter gene assay as a valuable tool to screen chemical libraries for compounds modulating post-transcriptional control mechanisms exerted through 3&#8217; UTR.

Hochdurchsatz-Screening für Chemische Modulatoren der Post-transkriptionell regulierten Genen

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...