Heute werden wir die Technik der transdermalen Messung der glomerulären Filtration oder tGFR bei Mäusen demonstrieren. Es gibt eine Reihe von Merkmalen dieser Methode, die meiner Meinung nach erwähnenswert sind. Zuallererst ist derzeit tGFR die genaueste Methode zur Beurteilung der Nierenfunktion bei Mäusen.
Zweitens wird tGFR bei bewussten, frei beweglichen Mäusen durchgeführt, so dass es die Komplikationen der Anästhesie vermeidet. Drittens, sobald Sie die Technik gemeistert haben, ist es vernünftig, 30 bis 40 tGFR Messungen an einem einzigen Tag durchführen zu können. Schließlich können tGFR-Messungen wiederholt an in vitro Mäusen durchgeführt werden.
Das bedeutet, dass wir serielle Messungen der Nierenfunktion bei akuten und chronischen Erkrankungen durchführen können. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie es Forschern ermöglicht, die Glomeruläre Filtrationsrate oder GFR bei bewussten, frei beweglichen Mäusen mit hoher Präzision und Empfindlichkeit zu messen. Ein bis zwei Tage vor der tGFR-Messung, nachdem sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen bestätigt hat, legen Sie eine anästhesierte Maus in die anfällige Position auf einem Wärmepolster.
Mit einem elektrischen Rasierer, trimmen gegen die Richtung des Wachstums, um den größten Teil des Fells von einer Seite der Maus Rücken von der Oberseite der Hinterbeine bis zum Hals und über die Rippen zu entfernen. Verwenden Sie eine Baumwollknospe, um eine dünne Schicht Enthaarungscreme auf die exponierte Haut gegen die Wachstumsrichtung aufzutragen, um sicherzustellen, dass die Creme so nah wie möglich an der Haut aufgetragen wird und entfernen Sie die Creme nach ein bis drei Minuten mit sauberen Wattestäbchen und warmem Wasser. Schneiden Sie am Tag des Eingriffs einen sechs mal drei Zentimeter großen Klebebepflaster auf die Größe des GFR-Geräts, bevor Sie die Rückseite des Pflasters abziehen und das Gerät an die Klebeseite des Pflasters kleben, wobei die Leuchtdioden direkt über dem klaren Fenster positioniert sind.
Dann kleben Sie ein kleines Stück des Patches auf die Batterie. Um den Monitor mit der anästhesierten Maus in der anfälligen Position zu befestigen, reinigen Sie die vorrasierte Haut mit 70% Ethanol und passen Sie die Breite eines ca. 12 Zentimeter großen Bandstücks an, indem Sie sie längs zerreißen. Legen Sie das Band unter die Maus mit zwei Zentimetern auf einer Seite des Tieres falten über eine Kante der rechten Seite des Bandes für eine einfache Platzierung und Entfernung nach der Messung.
Schließen Sie als Nächstes die Batterie an das Gerät an, entfernen Sie die Sicherung aus der Batterie und legen Sie die Batterie sicher auf das Gerät. Das Gerät ist einsatzbereit und die Datenerfassung beginnt, wenn die blauen LEDs zu blinken beginnen. Entfernen Sie die Unterstützung vom Patch auf dem Gerät und legen Sie das Gerät auf die rasierte Haut, so dass sich das Fenster, das die LEDs freilegt, über den Rippen befindet, die die rechte Seite des Geräts mit Klebeband sichern.
Es ist wichtig, eine sichere Befestigung des Geräts zu gewährleisten, ohne die Beweglichkeit der Maus einzuschränken oder zu viel Druck auf die Haut auszuüben. Dann wickeln Sie die linke Seite des Bandes fest um die Maus und das Gerät. Erlauben Sie dem Gerät, einen stabilen Hintergrundwert für drei Minuten aufzuzeichnen.
In der Zwischenzeit den Schwanz mit einem Kopfpolster erwärmen und eine Insulinspritze mit dem entsprechenden Versuchsvolumen von FITC-Sinistrin für die Injektion auf die nächsten 10 Mikroliter aufladen. Das FITC-Sinistrin intravenös in einem glatten, aber schnellen Bolus verabreichen. Es ist wichtig, dass der Benutzer mit IV-Injektionen vertraut ist, da es notwendig ist, die FITC-Sinistrin erfolgreich in einem Bolus zu verabreichen, anstatt über mehrere Versuche, die zu mehreren Spitzen in der Clearance-Kurve führen.
Um den tGFR zu messen, legen Sie die Maus in einen eigenen Käfig mit Überwachung bis zur vollen Rekumbenz und lassen Sie die FITC-Sinistrin-Clearance für 1,5 Stunden aufgezeichnet werden. Legen Sie am Ende des Messzeitraums die Maus auf das Drahtgestell auf dem Käfig und lassen Sie die Maus die Metallstangen greifen, ziehen Sie das Band unter dem Bauch in einer schnellen glatten Bewegung. Entfernen Sie dann jedes Band vom Gerät und den Patch von der Haut, wobei darauf geachtet wird, dass sich die Batterie nicht vom Gerät löst, und geben Sie die Maus in ihren Käfig zurück.
Um die Daten auszuwerten, trennen Sie den Akku vorsichtig und verwenden Sie ein USB-Kabel, um das Gerät mit dem Computer zu verbinden. Öffnen Sie die Lesesoftware und klicken Sie auf Verbinden, Lesen, Umbenennen und Speichern. Schließen Sie dann das Programm und verarbeiten und werten Sie die Daten in der Analysesoftware gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.
Während FITC-Sinistrin bei gesunden Mäusen schnell aus dem Kreislauf geräumt wird, verzögert sich diese Clearance bei Mäusen mit akuten Nierenverletzungen dramatisch. Bei Mäusen mit sehr schweren akuten Nierenverletzungen kann es während des gesamten 90-minütigen Messzeitraums nur sehr wenige oder gar keine Clearance der FITC-Sinistrinfluoreszenz geben, was auf ein völliges Fehlen einer glomerulären Filtration hindeutet. Die transdermale GFR-Messung ist minimalinvasiv und kann daher verwendet werden, um Veränderungen der Nierenfunktion bei einzelnen Tieren über mehrere Zeitpunkte hinweg zu überwachen.
Tatsächlich zeigten sequenzielle Messungen in diesem repräsentativen Experiment Veränderungen der Nierenfunktion bei Null, ein, zwei und vier Tage nach einer Anreicherungsverletzung der Ischämie. In diesem Modell mit chronischen Nierenerkrankungen kann die umgekehrte Beziehung der FITC-Sinistrin-Halbwertszeit zu GFR direkt mit der bei diesen Tieren beobachteten eingeschränkten Nierenfunktion korreliert werden. Tatsächlich korreliert die FITC-Sinistrin-Halbwertszeit eng mit der semiquantitativen histologischen Beurteilung von tubulären Verletzungen über das gesamte Spektrum der GFR-Messungen bei unverletzten Mäusen und bei Mäusen mit unterschiedlichen Schweregraden der Ischämie-Reperfusionsverletzung, die eine akute Nierenverletzung verursacht.
Im Gegensatz dazu zeigen Serumkreatinin und Harnstoffstickstoff im Blut eine positive, aber schwächere Korrelation mit der FITC-Sinistrin-Clearance, die auf die transkutanen GFR-Messungen hinweist, die ein zuverlässigeres Maß für Nierenverletzungen liefern als entweder Serumkreatinin oder Harnstoffstickstoff im Blut. Die transdermale Messung von GFR ist ein empfindlicheres Maß für die Nierenfunktion als herkömmliche Biomarker wie Kreatinin und BUN. Dies liefert eine genauere Bewertung der Wirksamkeit neuartiger Therapien für Nierenerkrankungen in der präklinischen Forschung.
Die wichtigsten Schritte bei dieser Methode sind die richtige Befestigung des Geräts am Rücken der Maus und die erfolgreiche IV-Administration von FITC-Sinistrin. Diese Schritte sind unerlässlich, um eine genaue Bewertung von GFR bei Mäusen zu erhalten.
