Wir danken J. Cappellani und J. Qiu für technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Mittel aus dem National Cancer Institute (U01 CA141451), der Starr Cancer Consortium, Susan G. Komen for the Cure, Long Island 2 Day Walk to Breast Cancer, Manhasset Damen Coalition Against Breast Cancer gegen mich zu kämpfen, und einem unterstützten Pre-Doc-Stipendium der vom Kongress Regie Breast Cancer Research Program, ist USA ESNESN auch der Empfänger der Leslie C. Schnelle und William Randolph Hearst Foundation Fellowships aus dem Watson School of Biological Sciences. HAA wurde durch Mittel aus dem Research Council of Norway (160698/V40 und 151.882) und Southeastern Regional Health Authorities (2.007.060) unterstützt.

<ol>
	<li>Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumors+as+organs:+complex+tissues+that+interface+with+the+entire+organism.">Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism.</a> Dev. Cell. 18, 884-901 (2010).</li><li>Ahn, G. -. O., Tseng, D., Liao, C. -. H., Dorie, M. J., Czechowicz, A., Brown, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Mac-1+(CD11b/CD18)+enhances+tumor+response+to+radiation+by+reducing+myeloid+cell+recruitment.">Inhibition of Mac-1 (CD11b/CD18) enhances tumor response to radiation by reducing myeloid cell recruitment.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 8363-8368 (2010).</li><li>Tlsty, T. D., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+and+regulation+of+cancer+development.">Tumor stroma and regulation of cancer development.</a> Annu. Rev. Pathol. 1, 119-150 (2006).</li><li>DeNardo, D. G., Brennan, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+complexity+predicts+breast+cancer+survival+and+functionally+regulates+response+to+chemotherapy.">Leukocyte complexity predicts breast cancer survival and functionally regulates response to chemotherapy.</a> Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).</li><li>Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tumor-stroma+interactions+during+chemotherapy+reveals+contributions+of+the+microenvironment+to+resistance.">Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance.</a> Cancer Cell. 21, 488-503 (2012).</li><li>Kim, J. B., Stein, R., O'Hare, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+in+vitro+tissue+culture+models+of+breast+cancer--+a+review.">Three-dimensional in vitro tissue culture models of breast cancer-- a review.</a> Breast Cancer Res. Treat. 85, 281-291 (2004).</li><li>Gilbert, L. A., Hemann, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage-mediated+induction+of+a+chemoresistant+niche.">DNA damage-mediated induction of a chemoresistant niche.</a> Cell. 143, 355-366 (2010).</li><li>Pittet, M. J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging.">Intravital imaging.</a> Cell. 147, 983-991 (2011).</li><li>Lohela, M., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+imaging+of+stromal+cell+dynamics+in+tumors.">Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 20, 72-78 (2010).</li><li>Boissonnas, A., Fetler, L., Zeelenberg, I. S., Hugues, S., Amigorena, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+cytotoxic+T+cell+infiltration+and+elimination+of+a+solid+tumor.">In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and elimination of a solid tumor.</a> J. Exp. Med. 204, 345-356 (2007).</li><li>Breart, B., Lema&#238;tre, F., Celli, S., Bousso, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+imaging+of+intratumoral+CD8++T+cell+cytotoxic+activity+during+adoptive+T+cell+therapy+in+mice.">Two-photon imaging of intratumoral CD8+ T cell cytotoxic activity during adoptive T cell therapy in mice.</a> J. Clin. Invest. 118, 1390-1397 (2008).</li><li>Engelhardt, J. J., Boldajipour, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Marginating+dendritic+cells+of+the+tumor+microenvironment+cross-present+tumor+antigens+and+stably+engage+tumor-specific+T+cells.">Marginating dendritic cells of the tumor microenvironment cross-present tumor antigens and stably engage tumor-specific T cells.</a> Cancer Cell. 21, 402-417 (2012).</li><li>Brown, E., McKee, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors.">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li><li>Yuan, F., Salehi, H. A., Boucher, Y., Vasthare, U. S., Tuma, R. F., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+permeability+and+microcirculation+of+gliomas+and+mammary+carcinomas+transplanted+in+rat+and+mouse+cranial+windows.">Vascular permeability and microcirculation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows.</a> Cancer Res. 54, 4564-4568 (1994).</li><li>Jain, R. K., Munn, L. L., Fukumura, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+tumour+pathophysiology+using+intravital+microscopy.">Dissecting tumour pathophysiology using intravital microscopy.</a> Nat. Rev. Cancer. 2, 266-276 (2002).</li><li>Egeblad, M., Ewald, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Cheng, N., Lambert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammary+Transplantation+of+Stromal+Cells+and+Carcinoma+Cells+in+C57BL/6J.">Mammary Transplantation of Stromal Cells and Carcinoma Cells in C57BL/6J.</a> Mice. J. Vis. Exp. (54), ee2716 (2011).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+vital+signs+for+long-term+survival+of+mice+under+anesthesia.">Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.prot5563 (2011).</li><li>Sounni, N. E., Dehne, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stromal+regulation+of+vessel+stability+by+MMP14+and+TGFbeta.">Stromal regulation of vessel stability by MMP14 and TGFbeta.</a> Dis. Model Mech. 3, 317-332 (2010).</li><li>Magness, S. T., Bataller, R., Yang, L., Brenner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dual+reporter+gene+transgenic+mouse+demonstrates+heterogeneity+in+hepatic+fibrogenic+cell+populations.">A dual reporter gene transgenic mouse demonstrates heterogeneity in hepatic fibrogenic cell populations.</a> Hepatology. 40, 1151-1159 (2004).</li><li>Motoike, T., Loughna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+GFP+reporter+for+the+study+of+vascular+development.">Universal GFP reporter for the study of vascular development.</a> Genesis. 28, 75-81 (2000).</li><li>Fukumura, D., Xavier, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+induction+of+VEGF+promoter+activity+in+stromal+cells.">Tumor induction of VEGF promoter activity in stromal cells.</a> Cell. 94, 715-725 (1998).</li><li>Sugimoto, H., Mundel, T. M., Kieran, M. W., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+fibroblast+heterogeneity+in+the+tumor+microenvironment.">Identification of fibroblast heterogeneity in the tumor microenvironment.</a> Cancer Biol. Ther. 5, 1640-1646 (2006).</li><li>Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic,+long-term+in+vivo+imaging+of+tumor-stroma+interactions+in+mouse+models+of+breast+cancer+using+spinning-disk+confocal+microscopy.">Dynamic, long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy.</a> Cold Spring Harb. Protoc. 2011, pdb.top97 (2011).</li></ol>

Die Autoren haben keine Konflikte von Interesse, um offen zu legen. Alle tierischen Experimente wurden in Übereinstimmung mit IACUC genehmigten Protokollen durchgeführt.

Die Antworten von Tumoren auf systemische Therapien in vivo kann drastisch unterscheiden, die von Krebszellen in vitro, wie der Mikroumgebung sowohl die akute Reaktion und Rückfall 5 beeinflusst. Eines der größten Hindernisse für die Explikation in vivo Chemoresistenz Wege ist die Komplexität der Wechselwirkungen zwischen Krebszellen und ihrer Mikroumgebung. Insbesondere weil festen Tumoren ein Gleichgewicht zwischen Krebs und Stromazellen, Störungen der einen Komponente, z. B. dem Zelltod, die während Antikrebsbehandlung auftritt entwickelt werden, können in der drastischen Auswirkungen auf Gewebeorganisation führen. Die intravitalen Bildgebungstechnik hier bereitgestellten ermöglicht die direkte Visualisierung Krebszelle-Stroma Wechselwirkungen innerhalb der Tumoren von lebenden, narkotisierten Mäusen während der Behandlung mit Anti-Krebs-Arzneimittel. Wir verwenden Schleuderscheibe konfokale Mikroskopie, die eine relative begrenzte Eindringtiefe hat (siehe 17 </sup&gt;), aber unsere chirurgischen und Markierungstechniken kann mit anderen Arten von Mikroskopie verwendet werden. Filme aus diesen Versuchen erfasst kann verwendet werden, um Prozesse, die Veränderungen in der Fluoreszenz-Intensität (zB durch Infiltration eines markierten Population oder Induktion von Zelltod), Zellmotilität, Verteilung von injizierbaren (zB um Extravasation zu verfolgen), und Co-beinhalten verfolgen Lokalisierung von Fluoreszenzsignalen 5,12,17,20. Wir routinemäßig Bild Mäuse für über 6 Stunden und auch durchgeführt Bildgebung für über 18 Stunden. Dies erfordert die Aufrechterhaltung der Mäuse kontinuierlich unter Narkose für diese lange Zeiträume. Mit der richtigen Anästhesie, überleben mehr als 90% unserer Tiere 6 Stunden und etwa 80% mehr als 18 Stunden überleben. Einzelheiten zur langfristigen Betäubung wurden bisher 19 veröffentlicht. In unserer Erfahrung sind fünf Faktoren entscheidend: die Vermeidung Hypothermie vermeiden Dehydrierung, die Aufrechterhaltung physiologischer Sauerstoffsättigung des Blutes Ebenen, usingen befeuchtet Trägergas für Isofluran und Haltung der Tiere auf der untersten Ebene der Anästhesie, an dem sie nicht zeigen Anzeichen von Schmerzen. Auf Körpertemperatur zu halten, sollten wir Mäuse unter einer Heizdecke (bei 38 ° C). Um Austrocknung zu vermeiden, spritzen wir kleine Mengen von Kochsalzlösung ip während der gesamten bildgebenden Verfahren. Um physiologische Blutsauerstoffsättigung Niveau zu halten, beginnen wir mit 21% Sauerstoff im Trägergas (anstelle der üblichen 100%). Dies ermöglicht uns, eingeatmete Sauerstoff Ebenen, wenn eine Maus zu erhöhen - Stunden in einem Experiment - zeigt eine Abnahme in die Sauerstoffsättigung des Blutes. In unserer Erfahrung, die Erhöhung der eingeatmeten Sauerstoff zu diesem Zeitpunkt (z. B. 30-40%) fast immer stabilisieren wird das Tier unter Berücksichtigung Stunden zusätzliche Bildgebung. Die optimale Höhe der Anästhesie ist für die meisten Mäuse mit 1-1,5% Isofluran und Ergebnisse im Atem Raten 60-65/min und Impulsraten von 400-450/min erreicht. In unserer Imaging-Experimente, wir verwenden in erster Linie transgenen Mausmodells (MMTV-PYMT und C3 [1]-Tag), in der Tumore sind multifokalen, so dass zum Abbilden mehrerer Läsionen in verschiedenen Stadien der Tumorprogression, die parallel in mehreren x, y-Positionen während einer einzigen Bildgebungssitzung. Dies verringert Bedenken hinsichtlich Maus zu Maus Variation bezüglich Experimente bei Identifizieren Stufe-abhängige therapeutische Reaktionen abzielen, und reduziert die Anzahl von Tieren zum Abbilden erforderlich. Die MMTV-PYMT Modell (und andere spontane Krebsentstehung Modelle) gehen durch progressive histopathologischen Stadien, die während intravital Bildgebung erkannt werden kann, obwohl die pathologische Staging des Tumors Läsionen, die während intravital Bildgebung durchgeführt werden kann, ist anders und weniger detailliert, als die histologischen Schnitten 5,17. Im Gegensatz dazu tendieren Transplantationsmodellen bis späten Stadium Tumoren am besten widerspiegeln, wie die Krebszellen meist aus fortgeschrittenen Tumoren isoliert werden. Solche Modelle eignen sie sich zum Studium Tumor-StromaWechselwirkungen der späten Stadium Tumoren als Unterschiede in diesen Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Stadien. Wir zeigen Beispiele, wie man Bild nuklearen strukturellen Veränderungen, die nach der Zelltod durch Therapie induziert auftreten. In Abwesenheit von Anti-Krebs-Behandlung, das Markierungsstrategie vielmehr zu einer Bild Zellteilung in situ verwendet werden, aufzuklären, zum Beispiel, wie Zellproliferation und Keimruhe durch die Mikroumgebung beeinflusst. In der Zukunft kann Fluoreszenzmarkierung mitochondrialen Komponenten ermöglichen, um Bild mitochondrialen Veränderungen, die während Apoptose auftreten. Bei diesem Protokoll, haben wir auch Beispiele zum Bild Krebszelle-Immunzelle Wechselwirkungen nach der Therapie, aber andere Mikroumgebungsbedingungen Komponenten können auch visualisiert und bebilderten gezeigt. Bestehende transgenen Reporter Linien für stromalen Komponenten umfassen solche für Fibroblasten (zB., FSP1-EGFP 17, αSMA-RFP 21, COL1A1-EGFP 21) oder Zellen des Gefäßsystems (zB Tie2-GFP 22; VEGF-GFP 23). Intravital Bildgebung ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der Interaktionen und Prozesse, die in vivo nach Verabreichung der Chemotherapie auftreten. Mit der Technologie, die derzeit verfügbar sind, haben wir große Fortschritte im Verständnis, wie myeloischen Zellen beeinflussen therapeutische Reaktion gemacht, aber weil der Tumor-Mikroumgebung ist so komplex, große Fortschritte sind erforderlich, um beginnen zu mechanistisch tief in die zugrunde liegenden Prozesse umwelt-vermittelten Resistenz. Einer der wichtigsten Fortschritte noch erforderlich ist die Identifizierung besser Marker für spezifische Zellpopulationen. Die Bedeutung einer besseren Marker ist mit zwei der herausragenden Stromazellen Komponenten des Brusttumor Mikroumgebung, Fibroblasten und Immunzellen veranschaulicht. α-smooth muscle actin (αSMA) wird häufig verwendet, um zu identifizierenFibroblasten, aber das Protein auch von vaskulären glatten Muskelzellen und Myoepithelzellen 24 exprimiert. So, obwohl αSMA-GFP-Reporter Mäusen vorhanden sind, die Bestimmung der spezifischen Zelltyp ist folgende während einer intravital Imaging-Experiment ist eine Herausforderung. Ebenso wird ein einzelner fluoreszierender Marker, wie zB EGFP unter der c-fms-Promotors exprimiert kennzeichnen häufig mehrere Subpopulationen von Immunzellen 12,17. Obwohl also ein idealer möchten eine einzelne Markierung zu verwenden, um einen bestimmten Zelltyp zu identifizieren die Komplexität der zugrunde liegenden Biologie eine große Herausforderung bei der Verwendung dieses Ansatzes. Eine Teillösung für dieses Problem ist die injizierbare Etiketten verwenden, um weiter zu differenzieren Subpopulationen von Zellen, die den gleichen fluoreszierenden Reporter. Beispielsweise werden fluoreszierende Dextrane von Makrophagen aufgenommen und können die Makrophagen Subpopulationen, die durch die c-fms-EGFP und FSP1-EGFP transgenen Reportermäuse markiert sind zu markieren <sup&gt; 17. Antikörper, konjugiert an fluoreszierenden Sonden wurden ebenfalls verwendet, um spezifische Subpopulationen (zB die Gr1-positiven Population von myeloiden Zellen durch die c-fms-EGFP-Reporter 17 beschriftet) identifizieren. Anders als Tumor-Antwort-Kurven durch Dickenmessung, die wenig mechanistische Informationen oder warum Tumore reagieren auf das verabreichte therapeutische oder histologische Reihe von Geweben zu verschiedenen Zeitpunkten, die große Kohorten Tiere benötigen geerntet wurden bereitzustellen erzeugt, stellt unsere Technik direkte, quantifizierbare Daten auf der Dynamik des Zelltods und auf die Wechselwirkungen von Stromazellen mit Krebszellen in kleinen Kohorten. Damit ist der Vorteil der Verwendung des Verfahrens hier berichtet, dass sie dynamische Informationen Medikament Reaktionen liefert im Kontext eines intakten Tumormikroumgebung in Echtzeit. Solche Informationen können wichtige Einblicke in die zugrunde liegenden Prozesse, die therapeutische Reaktionen fahren 5 führen &lt;/ Sup&gt;.

Krebszellen und den Stromazellen Bestandteile (beide zellulären und nicht-zellulären), die bei der Aufrechterhaltung eines geeigneten Umfelds für das Tumorwachstum 1 Assist: Solide Tumoren bestehen aus zwei großen Fächern zusammen. Diese Stromatumoren Bestandteile spielen eine entscheidende Rolle in der Entwicklung, Progression und Metastasierung von vielen Arten von Krebs, einschließlich derjenigen der Brust 2-5. Die Stromazellen Milieu beeinflusst auch therapeutische Reaktionen 2,4,5. Somit bestimmen, wie Krebszellen zu konventionellen und neuartige Therapien ansprechen im Kontext des intakten Mikroumgebung ist, das Verständnis der Krebsbiologie und Verbesserung der derzeitigen therapeutischen Strategien wichtig. Darüber hinaus definiert, wie Krebszellen-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung der Therapie zu ändern, ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der Biologie des Tumors Rückfall. Organotypischen Kokultur Systeme wurden für die Untersuchung Tumor-Stroma-Interaktionen nützlich <sbis&gt; 6, aber es ist offensichtlich, dass die derzeit verfügbaren Methoden nicht erfolgreich rekapitulieren die intakte Tumormikroumgebung in vitro, insbesondere bezüglich Gefäßfunktion und Rekrutierung von Immunzellen. Tatsächlich sind Krebszelle Reaktionen auf Therapien, die in vitro beobachtet werden oft erheblich von denen in vivo, wo der Mikroumgebung intakt 5 beobachtet. So kann in vivo Modelle für das Studium Tumor-Stroma-Interaktionen und deren Auswirkungen auf therapeutische Reaktion besser widerspiegeln klinisch relevanten Mechanismen sieben. Die primäre Mittel des Studiums Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie in vivo haben durch Messungen der Tumorgröße und histologische Untersuchung von Gewebe aus behandelten Tieren oder Patienten gewonnen wurden. Allerdings haben Fortschritte in der Mikroskopie und Fluoreszenz-Reporter in den vergangenen zwei Jahrzehnten die Visualisierung der inter-und intrazellulären Prozesse aktiviertmit hoher Auflösung in live, narkotisierten Tieren (intravital imaging) 8. Diese Intravitalmikroskopie Technologien haben sich als besonders wertvoll für räumlich und zeitlich sezieren die in vivo Dynamik der Tumor-Stroma-Interaktionen auf zellulärer und sub-zellulärer Auflösung 8,9. Prozesse, die von intravitalen Imaging wurden entwirrt umfassen Anti-Tumor-T-Zellen-Cytotoxizität 10,11, Interaktionen zwischen T-Zellen und myeloiden Zellen 12, die Dynamik der Veränderungen in Kollagenzusammensetzung und Organisation nach therapeutischer Behandlung 13, Makrophagen-abhängigen Krebszelle Intravasation und Metastasierung 14 und Gefäßpermeabilität 15. Es gibt drei wesentliche Voraussetzungen für intravital Bildgebung. Dazu gehören eine angemessene Vorbereitung und Belichtung von Geweben für die Bildgebung, Fluoreszenzmarkierung der Gewebe-Komponenten von Interesse, und eine gepaarte Mikroskopie-Kamera system Lage des Erwerbs Bilder 16. Die häufigsten verwendeten Strategien, um diese Anforderungen zu erfüllen sind: 1) heterotope Zubereitungen (zB Impfung am Ohr oder Auge orbital), permanent Bildgebung Fenster oder exteriorisierten Zubereitungen (zB dorsalen Hautlappen); 2) Transgene fluoreszierenden Reporter und.. fluoreszierenden Injektabilia zu etikettieren Gewebekomponenten und 3) Multiphotonen oder konfokalen Mikroskopie-Systeme mit Photovervielfacherröhren oder Charge-Coupled Device (CCD)-Kameras bzw. 9 gepaart. Wir verwenden eine chirurgisch präparierten Hautlappen Modell, um die Leistengegend Brustdrüse für die Bildgebung in narkotisierten Tieren, die Transgene kodieren fluoreszierenden Reporter auszudrücken aussetzen. Bilder werden über einen Zeitraum von 12 bis 40 Stunden unter Verwendung einer intensivierten CCD (ICCD)-Kamera mit einem Vier-Laser Schleuderscheibe konfokalen Mikroskopsystem 17 gepaarten erhalten. Imaging in dieser Weise hat uns erlaubt, solche Prozesse in vivo Verteilung von Medikamenten, Bühne-abhängige ch studierenemotherapeutic Reaktionen, der Art der Chemotherapie-induzierten Zelltod und myeloide Zellverhalten 5. Wir stellen ein Protokoll für die intravitalen Bildgebung Krebszelle Reaktionen auf Anti-Krebs-Therapie und Tumor-Stroma-Interaktionen in Mausmodellen von Brustkrebs. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um die Einstellungen und den Tod beider Krebszellen und Stromazellen Komponenten mit einer Vielzahl von transgenen und injizierbare Fluoreszenzmarkierungen in beiden transgenen und Transplantationsmodellen für Zeiträume von bis zu 40 Stunden in einem einzigen Bildgebungssitzung verfolgen.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagens </td></tr><tr><td> MMTV-PYMT Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 2374 </td><td></td></tr><tr><td> C3 (1)-Tag Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 13591 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-ECFP Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 3773 </td><td></td></tr><tr><td> ACTB-H2B-EGFP Mäusen </td><td> Jackson Laboratory </td><td> 5418 </td><td></td></tr><tr><td> 1 x PBS </td><td> Made in-house </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 2 MD Dextran, Fluorescein-konjugierte </td><td> Invitrogen </td><td> D-7137 </td><td> Rekonstituieren in dH 2 O (4 mg / ml, Lagerung bei -20 ° C); verdünnten bis 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> 10 kD Dextran, Alexa Fluor 647-konjugierten </td><td&gt; Invitrogen </td><td> D-22914 </td><td> Rekonstituieren in dH 2 O (4 mg / ml, Lagerung bei -20 ° C); verdünnten bis 1 mg / ml in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Doxorubicin-Hydrochlorid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 44583 </td><td> Rekonstituieren in dH 2 O und bei 4 ° C, in 1 x PBS verdünnen </td></tr><tr><td> Isothesia (Isofluran) </td><td> Butler Animal Health Versorgung </td><td> 029450 </td><td> 250 ml </td></tr><tr><td> Propidiumiodid </td><td> Invitrogen </td><td> P3566 </td><td> 1 mg / ml; verdünnter 1:15 in 1 x PBS </td></tr><tr><td> Stickstoff </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Sauerstoff </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> 18G x 1 ½ &quot;regelmäßigen Kegel Nadel </td><td> BD </td><td> 305196 </td><td></td></tr><tr><td> μManager </td><td> Vale Lab, UCSF </td><td> <a href="www.micro-manager.org" target="_blank">www.micro-manager.org</a> </td><td> Open-Source-Software </td></tr><tr><td> Alkoholtupfer </td><td> BD </td><td> 326895 </td><td> 70% igem Alkohol-Tupfer </td></tr><tr><td> Anästhesie-System </td><td> Molecular Imaging Products, Co. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Corning </td><td> 2940-245 </td><td> Nr. 1 ½, 24x50 mm; desinfizieren mit 70% Isopropanol Wischtücher </td></tr><tr><td> Curity Gaze Schwämme (steril) </td><td> Kendall </td><td> 6939 </td><td></td></tr><tr><td> Glasobjektträger </td><td> Corning </td><td> 2948-75x25 </td><td> Vorgereinigt, wenn nicht vorgereinigt, mit 70% Isopropanol Tücher desinfizieren </td></tr><tr><td> Gehärtete feinen Schere </td><td> Fine Science Tools </td><td> 14090-11 </td><td> 2 Paar, Edelstahl, scharf-spitz, gerade Spitze, 26 mm Schneide, 11 cm Länge </td></tr><tr><td> Heizdecke </td><td> Gaymar Industries </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Hot bead Sterilisator </td><td> Fine Science Tools </td><td> 18000-45 </td><td> Schalten etwa 30 min vor der Benutzung; sterilisieren Werkzeuge bei&gt; 200 ° C für 30 Sek. </td></tr><tr><td> Imaris </td><td> Bitplane </td><td> <a href="www.bitplane.com" target="_blank">www.bitplane.com</a> </td><td></td></tr><tr><td> Krazy Glue </td><td> Elmer-Produkte </td><td> KG484 </td><td></td></tr><tr><td> Labor Band (½ &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Labor Band (1 &quot;) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Deckela Styropor Versand kühler </td><td></td><td></td><td> Dies wird als das chirurgische Plattform verwendet werden </td></tr><tr><td> Micro Dissektionszange </td><td> Roboz </td><td> RS-5153 </td><td> 1x2 Zähne, leichte Kurve, 0,8 mm Strichstärke, 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Micro Dissektionszange </td><td> Roboz </td><td> RS-5135 </td><td> Serrated, leichte Kurve, 0,8 mm Strichstärke; 4 &quot;Länge </td></tr><tr><td> Mikroskop </td><td></td><td></td><td> Spinning-Disk-konfokalen XYZ Piezo Bühne, epifluourescence capablility 17,25 </td></tr><tr><td> Mikroskoptisch Einsatz </td><td> Applied Scientific Instrumentation </td><td></td><td> Benutzerdefinierte hergestellt, mit zwei runden Imaging-Ports </td></tr><tr><td> MouseOx Oximeter, Software und Sensoren </td><td> STARR Life Sciences </td><td> <a href="www.starrlifesciences.com" target="_blank">www.starrlifescience</a>s.com </td><td></td></tr><tr><td> Nalgene Super-Versi-Dry Lab Soakers </td><td> Thermo Scientific </td><td> 74218-00 </td><td> Cut in Vierteln zum Auskleiden chirurgische Plattform </td></tr><tr><td> Nebulizer </td><td> Salter Labs </td><td> 8901 </td><td> Verwendet werden, um Gase zu befeuchten; beugt Irritationen des Lungengewebes </td></tr><tr><td> Slip-Spitze Einweg Tuberkulinspritze (1 ml) </td><td> BD </td><td> 309659 </td><td></td></tr><tr><td> Surflo geflügelten Infusionsset </td><td> Terumo </td><td> SV-23BLK </td><td> 23G x ¾ &quot;ultra dünnen Nadel, 12&quot; Schlauch </td></tr><tr><td> Betadine Spray </td><td> Purdue Pharma </td><td> BASP3H </td><td></td></tr></tbody></table>

live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer

Der Tumor Mikroumgebung spielt eine zentrale Rolle in Tumor Initiation, Progression, Metastase, und dem Ansprechen auf Anti-Krebs-Therapien. Dreidimensionale Co-Kultur-Systeme werden häufig verwendet, um Tumor-Stroma-Interaktionen, einschließlich ihrer Rolle in der Medikamentenentwicklung Reaktionen explizieren. Allerdings können viele der Wechselwirkungen, die in vivo im intakten Mikroumgebung auftreten, nicht vollständig in diesen werden in vitro-Einstellungen repliziert. So, hat direkte Visualisierung der dieser Prozesse in real-time geworden ein wichtiges Werkzeug in das Verständnis Tumor-Reaktionen zu Therapien und die Identifizierung der Interaktionen zwischen Krebs Zellen und dem Stroma, die diese Reaktionen beeinflussen können. Sie hier, stellen wir ein Verfahren für die Verwendung von Kreiselscheibenapplikators konfokale Mikroskopie von lebenden, anästhesiert Mäuse, um direkt beobachten der Verteilung des Arzneimittels, Krebs Zell-Reaktionen und Veränderungen in Tumors-Stroma-Interaktionen nach der Verabreichung von systemischen Therapie bei Brustkrebs Modelle. Wir beschreiben Verfahren für die labeling verschiedenen Tumor Komponenten, Behandlung von Tieren für die Beobachtung therapeutische Reaktionen, und die chirurgische Prozedur zum Belichten von Tumor-Geweben für die Bildgebung up bis 40 Stunden. Die Ergebnisse aus dieser-Protokoll erhalten werden, sind time-lapse-filme,, in denen solche Prozessen als Drug Infiltration, Krebszelle Tod und stromalen Zellmigration evaluiert sie mit Bild-Analyse-Software kann werden.

Watch this Scientific Journal Video about Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer at JoVE.com

Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung<em&gt; In vivo</em&gt; Und einzelne Zelle Auflösung.

Live-Imaging of Drug Responses in der Tumor-Mikroumgebung in Mausmodellen von Brustkrebs

The tumor microenvironment plays a pivotal role in tumor initiation, progression, metastasis, and the response to anti-cancer therapies. Three-dimensional ...

live-imaging-drug-responses-tumor-microenvironment-mouse-models

Research

JoVE Journal

Medicine

24.6K Aufrufe.  Watson School of Biological Sciences. Wir beschreiben ein Verfahren zur Abbildung als Reaktion auf Anti-Krebs-Behandlung In vivo Und einzelne Zelle Auflösung.

Serie: Live Imaging of Drug Responses in the Tumor Microenvironment in Mouse Models of Breast Cancer

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined by current drug efficacy tests and the efficacy on patients. Thus, novel and reliable methods for evaluating drug efficacy are warranted in pre-clinical phase. In vitro culture of tumor tissues, including cell lines, has substantial phenotypic, genetic, and epigenetic alterations of cancer cells caused by artificial environment of cell culture, which may not reflect the biology of original tumors in situ. Xenograft models with the immunodeficient mice also have limitations, i.e., the lack of immune system and interspecies genetic and epigenetic discrepancies in microenvironment. Here, we demonstrate a novel method using the surgical specimens of malignant glioma as undissociated tumor blocks to evaluate treatment effects. To validate this method, data with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide (TMZ), are described.


We used the freshly-removed surgical specimen of malignant glioma for our experiments. We performed intratumoral injection of TMZ or other drug candidates, followed by incubation and analysis on surgical specimens. Here, we sought to establish a tumor tissue explant method as a platform to determine the efficacy of novel anti-cancer therapies so that we may be able to overcome, at least, some of the current limitations and fill the existing gap between the current experimental data and the efficacy on an actual patient's tumor. This method may have the potential to accelerate identifying novel chemotherapeutic agents for solid cancer treatment.

Here, we established a method for drug efficacy testing with surgical specimens of brain tumors, termed &#x201C;tumor explant method&#x201D;. With this method, we can evaluate drug efficacy without breaking the microenvironment of solid tumors. To validate reliability of this method, we describe representative data with our glioma specimen treated with the current first-line chemotherapeutic agent, temozolomide.

Verfahren zur Novel Anti-Cancer Drug Development mit Tumor Explantate von chirurgischen Proben


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

Forschung

Medizin

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-Photonen-Imaging der Tumorzellinvasion in einem orthotopen Mausmodell des oralen Plattenepithelkarzinoms

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There is little knowledge about in situ, in vivo, tumor hypoxia during intracranial development of malignant brain tumors because of lack of efficient means to monitor it in these deep-seated orthotopic tumors. Bioluminescence imaging (BLI), based on the detection of light emitted by living cells expressing a luciferase gene, has been rapidly adopted for cancer research, in particular, to evaluate tumor growth or tumor size changes in response to treatment in preclinical animal studies. Moreover, by expressing a reporter gene under the control of a promoter sequence, the specific gene expression can be monitored non-invasively by BLI. Under hypoxic stress, signaling responses are mediated mainly via the hypoxia inducible factor-1&alpha; (HIF-1&alpha;) to drive transcription of various genes. Therefore, we have used a HIF-1&alpha; reporter construct, 5HRE-ODD-luc, stably transfected into human breast cancer MDA-MB231 cells (MDA-MB231/5HRE-ODD-luc). In vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay is performed by incubating the transfected cells in a hypoxic chamber (0.1% O2) for 24 hr before BLI, while the cells in normoxia (21% O2) serve as a control. Significantly higher photon flux observed for the cells under hypoxia suggests an increased HIF-1&alpha; binding to its promoter (HRE elements), as compared to those in normoxia. Cells are injected directly into the mouse brain to establish a breast cancer brain metastasis model. In vivo bioluminescence imaging of tumor hypoxia dynamics is initiated 2 wks after implantation and repeated once a week. BLI reveals increasing light signals from the brain as the tumor progresses, indicating increased intracranial tumor hypoxia. Histological and immunohistochemical studies are used to confirm the in vivo imaging results. Here, we will introduce approaches of in vitro HIF-1&alpha; bioluminescence assay, surgical establishment of a breast cancer brain metastasis in a nude mouse and application of in vivo bioluminescence imaging to monitor intracranial tumor hypoxia.

In vivo Bioluminescence Imaging of Tumor Hypoxia Dynamics of Breast Cancer Brain Metastasis in a Mouse Model

Bioluminescence imaging of hypoxia inducible factor-1&alpha; activity is applied to monitor intracranial tumor hypoxia development in a breast cancer brain metastasis mouse model.

In-vivo-Biolumineszenz-Bildgebung von Tumorhypoxie Dynamics of Breast Cancer Hirnmetastasen in einem Mausmodell

It is well recognized that tumor hypoxia plays an important role in promoting malignant progression and affecting therapeutic response negatively. There ...

MAME Models for 4D Live-cell Imaging of Tumor: Microenvironment Interactions that Impact Malignant Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in real-time of cell:cell interactions. Our overall goal was to develop models that recapitulate the architecture of preinvasive breast lesions to study their progression to an invasive phenotype. Specifically, we developed models to analyze interactions among pre-malignant breast epithelial cell variants and other cell types of the tumor microenvironment that have been implicated in enhancing or reducing the progression of preinvasive breast epithelial cells to invasive ductal carcinomas. Other cell types studied to date are myoepithelial cells, fibroblasts, macrophages and blood and lymphatic microvascular endothelial cells. In addition to the MAME models, which are designed to recapitulate the cellular interactions within the breast during cancer progression, we have developed comparable models for the progression of prostate cancers. 
Here we illustrate the procedures for establishing the 3D cocultures along with the use of live-cell imaging and a functional proteolysis assay to follow the transition of cocultures of breast ductal carcinoma in situ (DCIS) cells and fibroblasts to an invasive phenotype over time, in this case over twenty-three days in culture. The MAME cocultures consist of multiple layers. Fibroblasts are embedded in the bottom layer of type I collagen. On that is placed a layer of reconstituted basement membrane (rBM) on which DCIS cells are seeded. A final top layer of 2% rBM is included and replenished with every change of media. To image proteolysis associated with the progression to an invasive phenotype, we use dye-quenched (DQ) fluorescent matrix proteins (DQ-collagen I mixed with the layer of collagen I and DQ-collagen IV mixed with the middle layer of rBM) and observe live cultures using confocal microscopy. Optical sections are captured, processed and reconstructed in 3D with Volocity visualization software. Over the course of 23 days in MAME cocultures, the DCIS cells proliferate and coalesce into large invasive structures. Fibroblasts migrate and become incorporated into these invasive structures. Fluorescent proteolytic fragments of the collagens are found in association with the surface of DCIS structures, intracellularly, and also dispersed throughout the surrounding matrix. Drugs that target proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways or modifications in the cellular composition of the cocultures can reduce the invasiveness, suggesting that MAME models can be used as preclinical screens for novel therapeutic approaches.

We have developed 3D coculture models for live-cell imaging in real-time of interactions among breast tumor cells and other cells in their microenvironment that impact progression to an invasive phenotype. These models can serve as preclinical screens for drugs to target paracrine-induced proteolytic, chemokine/cytokine and kinase pathways implicated in invasiveness.

MAME Modelle für die 4D-Bildgebung lebender Zellen von Tumor: Mikroumgebung Wechselwirkungen, die Einfluss auf maligne Progression

We have developed 3D coculture models, which we term MAME (mammary architecture and microenvironment engineering), and used them for live-cell imaging in ...

Multi-modal Imaging of Angiogenesis in a Nude Rat Model of Breast Cancer Bone Metastasis Using Magnetic Resonance Imaging, Volumetric Computed Tomography and Ultrasound

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell proliferation in the bone marrow cavity as well as for interaction of tumor and bone cells resulting in local bone destruction. Our aim was to develop a model of experimental bone metastasis that allows in vivo assessment of angiogenesis in skeletal lesions using non-invasive imaging techniques.
For this purpose, we injected 105 MDA-MB-231 human breast cancer cells into the superficial epigastric artery, which precludes the growth of metastases in body areas other than the respective hind leg1. Following 25-30 days after tumor cell inoculation, site-specific bone metastases develop, restricted to the distal femur, proximal tibia and proximal fibula1. Morphological and functional aspects of angiogenesis can be investigated longitudinally in bone metastases using magnetic resonance imaging (MRI), volumetric computed tomography (VCT) and ultrasound (US).
MRI displays morphologic information on the soft tissue part of bone metastases that is initially confined to the bone marrow cavity and subsequently exceeds cortical bone while progressing. Using dynamic contrast-enhanced MRI (DCE-MRI) functional data including regional blood volume, perfusion and vessel permeability can be obtained and quantified2-4. Bone destruction is captured in high resolution using morphological VCT imaging. Complementary to MRI findings, osteolytic lesions can be located adjacent to sites of intramedullary tumor growth. After contrast agent application, VCT angiography reveals the macrovessel architecture in bone metastases in high resolution, and DCE-VCT enables insight in the microcirculation of these lesions5,6. US is applicable to assess morphological and functional features from skeletal lesions due to local osteolysis of cortical bone. Using B-mode and Doppler techniques, structure and perfusion of the soft tissue metastases can be evaluated, respectively. DCE-US allows for real-time imaging of vascularization in bone metastases after injection of microbubbles7.
In conclusion, in a model of site-specific breast cancer bone metastases multi-modal imaging techniques including MRI, VCT and US offer complementary information on morphology and functional parameters of angiogenesis in these skeletal lesions.

In the pathogenesis of bone metastasis, angiogenesis is a crucial process and therefore represents a target for imaging and therapy. Here, we present a rat model of site-specific breast cancer bone metastasis and describe strategies to non-invasively image angiogenesis in vivo using magnetic resonance imaging, volumetric computed tomography and ultrasound.

Multimodale Bildgebung von Angiogenese in einem Nude Rattenmodell der Brustkrebs Knochenmetastasen mittels Magnetresonanztomographie, volumetrische Computertomographie und Ultraschall

Angiogenesis is an essential feature of cancer growth and metastasis formation. In bone metastasis, angiogenic factors are pivotal for tumor cell ...

Time-lapse Imaging of Primary Preneoplastic Mammary Epithelial Cells Derived from Genetically Engineered Mouse Models of Breast Cancer

Time-lapse imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from different genetically engineered mouse models of breast cancer. For example, time between cell divisions (cell lifetimes), apoptotic cell numbers, evolution of morphological changes, and mechanism of colony formation can be quantified and compared in cells carrying specific genetic lesions. Primary mammary epithelial cell cultures are generated from mammary glands without palpable tumor. Glands are carefully resected with clear separation from adjacent muscle, lymph nodes are removed, and single-cell suspensions of enriched mammary epithelial cells are generated by mincing mammary tissue followed by enzymatic dissociation and filtration. Single-cell suspensions are plated and placed directly under a microscope within an incubator chamber for live-cell imaging. Sixteen 650 &mu;m x 700 &mu;m fields in a 4x4 configuration from each well of a 6-well plate are imaged every 15 min for 5 days. Time-lapse images are examined directly to measure cellular behaviors that can include mechanism and frequency of cell colony formation within the first 24 hr of plating the cells (aggregation versus cell proliferation), incidence of apoptosis, and phasing of morphological changes. Single-cell tracking is used to generate cell fate maps for measurement of individual cell lifetimes and investigation of cell division patterns. Quantitative data are statistically analyzed to assess for significant differences in behavior correlated with specific genetic lesions.

Time-lapse imaging is used to assess behavior of primary preneoplastic mammary epithelial cells derived from genetically engineered mouse models of breast cancer risk to determine if there are correlations between specific behavioral parameters and distinct genetic lesions.

Zeitraffer-Imaging of Primary Präkanzeröse Brustepithelzellen aus gentechnisch veränderten Mausmodellen der Breast Cancer Abgeleitet

Time-lapse  imaging can be used to compare behavior of cultured primary preneoplastic  mammary epithelial cells derived from different genetically ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in exponential tumor growth and metastasis to distal tissues and the collapse of anti-tumor immunity. Many useful animal models exist to study breast cancer, but none completely recapitulate the disease progression that occurs in humans. In order to gain a better understanding of the cellular interactions that result in the formation of latent metastasis and decreased survival, we have generated an inducible transgenic mouse model of YFP-expressing ductal carcinoma that develops after sexual maturity in immune-competent mice and is driven by consistent, endocrine-independent oncogene expression. Activation of YFP, ablation of p53, and expression of an oncogenic form of K-ras was achieved by the delivery of an adenovirus expressing Cre-recombinase into the mammary duct of sexually mature, virgin female mice. Tumors begin to appear 6 weeks after the initiation of oncogenic events. After tumors become apparent, they progress slowly for approximately two weeks before they begin to grow exponentially. After 7-8 weeks post-adenovirus injection, vasculature is observed connecting the tumor mass to distal lymph nodes, with eventual lymphovascular invasion of YFP+ tumor cells to the distal axillary lymph nodes. Infiltrating leukocyte populations are similar to those found in human breast carcinomas, including the presence of &#945;&#946; and &#947;&#948; T cells, macrophages and MDSCs. This unique model will facilitate the study of cellular and immunological mechanisms involved in latent metastasis and dormancy in addition to being useful for designing novel immunotherapeutic interventions to treat invasive breast cancer.

Activation of latent mutations with adenovirus-Cre into the mammary ductal system results in a clinically relevant metastatic breast cancer. Incorporation of a YFP promoter allows tracking of distal metastatic tumor cells. This model is useful to study latent metastasis, anti-tumor immunity, and for designing novel immunotherapies to treat breast cancer.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the extracellular matrix (ECM). Characterizing the biology of this phenotypically distinct group of cells could substantially improve our understanding of early events during the metastatic cascade.

Tumor invasion is a dynamic process facilitated by bidirectional interactions between malignant epithelium and the cancer associated stroma. In order to examine cell-specific responses at the tumor stroma-interface we have combined organotypic co-culture and laser micro-dissection techniques.
Organotypic models, in which key stromal constituents such as fibroblasts are 3-dimentioanally co-cultured with cancer epithelial cells, are highly manipulatable experimental tools which enable invasion and cancer-stroma interactions to be studied in near-physiological conditions.

Laser microdissection (LMD) is a technique which entails the surgical dissection and extraction of the various strata within tumor tissue, with micron level precision.
By combining these techniques with genomic, transcriptomic and epigenetic profiling we aim to develop a deeper understanding of the molecular characteristics of invading tumor cells and surrounding stromal tissue, and in doing so potentially reveal novel biomarkers and opportunities for drug development in CRC.&#160;&#160;&#160;

Molecular Profiling of the Invasive Tumor Microenvironment in a 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells and Ex vivo Fibroblasts

Molecular profiling of laser microdissected cells and stroma from synthetic, tissue-engineered colorectal cancer models represents a novel and manipulatable approach to characterize and dissect the distinctive biology at the interface between tumor cells at the invasive front and cancer associated stromal cells. &#160;

Molecular Profiling von der invasiven Tumor-Microenvironment in einem 3-Dimensional Model of Colorectal Cancer Cells und<em&gt; Ex-vivo-</em&gt; Fibroblasten

Invading colorectal cancer (CRC) cells have acquired the capacity to break free from their sister cells, infiltrate the stroma, and remodel the ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Hochfrequenz-Ultraschall-Bildgebung der Maus Halslymphknoten

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo und ex vivo Ansätze für Eierstockkrebs Metastatische Colonization von Milky Punktstrukturen in Peritoneal Fettgewebe Studieren

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...