Wir danken Dr. Harvey Hensley für seine kompetente technische Unterstützung. Labor für Tierhaltung und Small Animal Imaging Facility: Diese Arbeit aus der Nutzung der folgenden Fox Chase Cancer Center (FCCC) Einrichtungen profitiert. Diese Arbeit wurde teilweise durch den Eierstockkrebs SPORE bei FCCC / UPenn (P50 CA083638), der FCCC Kern gewähren (P30 CA006927), und die Ovarian Cancer Research Fund unterstützt.

I. Herstellung von Eierstockkrebs Tumor Cells <ol><li> Wachsen Ovarialkarzinom-Zelllinien, die Luciferase in der Kultur. Quellen des Luziferase kann Firefly, Renilla oder andere Arten sein. Zellen, die fluoreszierende Proteine ​​können ebenfalls verwendet werden. Für diese Demonstration verwenden wir ein Ovarialkarzinom-Zelllinie, OVCAR5, Ausdruck Glühwürmchenluciferase. </li><li> Ernten Sie die Zellen unter Verwendung von Routine-Zellkultur-Technik. </li><li> Halten Sie die Zellsuspension (10.000 Zellen / ul) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf Eis bis zum Zeitpunkt der Injektion. </li></ol> II. Intrabursalen Injection Dieses Verfahren erfordert Unterstützung durch eine zweite Person. Alle chirurgischen Eingriffen unter aseptischen Bedingungen durchgeführt. Dazu gehört das Tragen chirurgische Kleidung und mit sterilen chirurgischen Instrumenten, Spritzen und Nadeln. <ol><li> Bereiten Sie die Betäubung durch Mischen von 3 ml Ketaminhydrochlorid (100 mg / mL), 1,6 mL Xylazinhydrochlorid (100 mg / mL), 1,5 ml Acepromazin (10 mg / ml) und 20 ml 0,9% Natriumchlorid. </li><li> Überprüfen Sie das Tier Identifikationsnummer und beobachtbaren Gesundheit. Anesthetize das Tier mit vorbereitet Ketamin-Xylazin-Anästhesie Acepromazin durch intraperitoneale (ip) Injektion mit einer Dosis Volumen von 8 ~ 9 ml / kg Körpergewicht (KG). </li><li> Bestätigen Sie, dass das Tier unter einem akzeptablen Ebene der Anästhesie wird durch Ausführen einer Zehe Prise mit einer Pinzette oder den Fingern, um das Tier Hinterpfoten. Wenn es pedal Reflex, nach einer tieferen Ebene der Anästhesie warten, bis das Tier reagiert nicht auf dieses Verfahren. </li><li> Legen Sie das Tier dorsal nach oben auf eine sterile Gaze mit dem Kopf abgewandt und seinen Schwanz in Ihre Richtung. Der Punkt der Schnitt nach links oder rechts von der Mittellinie und vor den Eierstöcken entfernt. Shave oder nasse Fell mit 70% Alkohol in der Einschnitt Punkt. </li><li> Heben Sie die benetzte Haut mit einer Pinzette und machen einen kleinen Schnitt mit der Schere an der dorsomedialen Position und direkt über dem Eierstock Fettpolster. Der Eierstock Fettpolster sollte unter der Oberfläche der Bauchdecke sichtbar. Fat Pad ist leicht erkennbar an seiner weißen Farbe in Kontrast zu den dunklen rosa Seidenpapier umgeben. </li><li> Heben Sie die Bauchfell-Futter und machen einen kleinen Schnitt, wie oben beschrieben (5). </li><li> Legen Sie eine sterile Kochsalzlösung getränkt Gaze auf der Mittellinie neben dem Schnitt. Suchen Sie den Eierstock Fettpolster und vorsichtig heraus und setze ihn auf die Gaze. Stabilisieren Sie den Eierstock durch Einklemmen der Fettpolster mit einer Bulldogge Clip. Unter einem Binokular, positionieren Sie den Eierstock als für das Einführen der Nadel (30 Gauge, G) in den Eileiter Tubulus verbiegen, was zu der Bursa zu ermöglichen. Wenn die Nadel in die richtige Position eingesetzt wird, sollte es sichtbar unter der Bursa. </li><li> Schieben Sie den Kolben der Spritze bis 5 ul Zellsuspension zwischen Bursa und den Eierstock zu injizieren, während die Spritze an der Injektionsstelle positioniert ist. Dieser Schritt erfordert zwei Personen. Eine Person schiebt den Kolben während die andere Person unterhält Positionierung der Nadel. Entfernen Sie die Nadel schnell auf die Einstichstelle Dichtung, aber sanft genug, um nicht die Bursa und Tubulus reißen. Die Bursa sollte scheinen etwas mit der richtigen Injektion aufgetrieben werden. </li><li> Lassen Sie die Fettpolster von der Bulldogge Clip und schonend ersetzen die Fortpflanzungsorgane und Fettpolster zurück in die Bauchhöhle. Schließen Sie vorsichtig die Wand des Körpers, indem die obere Peritonealüberzug über die untere Verkleidung. Schließen Sie die Haut mit chirurgischen Klammern oder Wundklammern. </li><li> Legen Sie die Wiederherstellung Tier zurück in seinen Käfig und bieten eine sichere Wärmequelle zu Unterkühlung zu vermeiden und die Regeneration beschleunigen. Überwachen Sie die Atemfrequenz und Leichtigkeit, die Rückkehr des Muskeltonus und der Fähigkeit, sich freiwillig zu bewegen. Dies alles sind gute Indikatoren für das Fortschreiten in Richtung Genesung. Staples oder Wundklammern kann 7 oder mehr Tage nach der Operation entfernt werden. </li></ol> III. Orale Gabe Verwaltung <ol><li> Verwenden Sie eine 18 ~ 20 G Nadel oder Sonde Magensonde mit einer abgerundeten Spitze. Die Magensonde Nadel sollte nicht länger als der Abstand von der Spitze den Kopf des Tieres zu seiner letzten Rippe. </li><li> Überprüfen Sie die Tiere Identifikationsnummer und beobachtbaren Gesundheit. Gently scruff das Tier durch Ergreifen der Haut über die Schultern mit Daumen und Fingern. Die Zurückhaltung sollte gerade fest genug für die vorderen Gliedmaßen zu jeder Seite und aus dem Weg erweitert werden. Das Tier sollte nicht in der Lage sein an der Nadel zu fassen. </li><li> Ziehen Sie wieder den Kopf des Tieres mit dem Zeigefinger bilden eine gerade Linie durch den Hals und der Speiseröhre. Unterstützung den Rücken des Tieres mit der Innenseite des Daumens. </li><li> Sanft und ohne Zwang, legen Sie die Magensonde Nadel an beiden Seiten des Mundes und über die Zunge. In einer geschmeidigen Bewegung, sollte die Nadel gegen das Dach der Mund und die Speiseröhre gelangen. Gravity leiten sollte die Nadel ohne Widerstand. Wenn es irgendeine Resistance, entfernen Sie die Nadel und neu starten. Das Tier ist Knebel und Schluckreflex kann beim Einführen ausgelöst werden. Allerdings sollte es keinen Widerstand oder Keuchen aus dem Tier sein. Es ist wichtig, um sicherzustellen, dass das Tier atmet, wenn die Nadel in Kraft ist, indem die Bewegung der Nase und Brust. </li><li> Langsam schieben Kolben der Spritze auf die Dosis-Volumen zu verzichten. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig die Magensonde Nadel im gleichen Winkel und Weg als so, wie es durch die Speiseröhre eingeführt wurde. </li><li> Zurück das Tier in den Käfig und Atmung kontrollieren und das Verhalten für 5 bis 10 Minuten. </li></ol> IV. In Vivo Imaging Wir nutzen die Caliper Life Sciences, um das Verhalten von Zellen in intrabursalen Hohlraum injiziert zu überwachen. Versuche mit diesem System haben in der Regel einen Zeitraum von 4 ~ 16 Wochen ab dem Zeitpunkt der Tumor-Implantation. <ol><li> Bereiten Sie die Lösung von D-Luciferin (Substrat von Glühwürmchen-Luciferase) durch Auflösen von 5 bis 20 mg in 1 ml PBS und Filterung durch 0,22 um Membran für die Sterilisation. </li><li> Laden Sie die Induktion Kammer, indem sowohl die Sauerstoff-und der Isofluran-Gas. Schalten Sie den Gasstrom auf die Induktion Kammer nur. Die Isofluran Durchfluss wird auf einem niedrigen Niveau gehalten, bis Tiere bereit, die abgebildet werden sollen. </li><li> Überprüfen Sie die Tiere Identifikationsnummer und beobachtbaren Gesundheit. Legen Sie das Tier in der Induktion Kammer mit Isofluran-Gas berechnet. </li><li> Entfernen Sie das Tier aus der Kammer, wenn das Tier zu sein scheint betäubt. Deliver 200 ul der vorbereiteten Luciferin-Lösung via ip-Injektion mit 30 G Nadel. Es ist wichtig, den Zeitpunkt der Injektion Rekord in Ordnung zu halten die Zeit konsistent zwischen Luciferin Einspritz-und Imaging-Leistung während der gesamten Studie. </li><li> Setzen Sie den Luciferin-injizierte Tier wieder in die Induktion Kammer. </li><li> Stellen Sie die Imaging-System, um die entsprechenden Einstellungen. Achten Sie darauf, das System vor dem Erwerb des ersten Tieres Bild zu initialisieren. </li><li> Schalten Sie den Gasstrom auf die Induktion Kammer und schalten Sie den Gasstrom auf die Bildgebung Kammer. </li><li> Setzen Sie den narkotisierten Tier dorsal oder ventral nach oben. Achten Sie darauf, die Tiere &quot;Nase in einem Nasenkonus Ort zum richtigen Narkose aufrecht zu erhalten. Stellen Sie sicher, das Tier ist in der &quot;Point of interest grid&quot; wie grüne Beleuchtung angezeigt. </li><li> Schließen Sie die Tür der Kammer und erwerben das Bild zum richtigen Zeitpunkt. Die Zeit kann durch die Kinetik bestimmt werden. </li><li> Entfernen Sie das Tier aus der Imaging-Kammer und legen Sie sie zurück in seinen Käfig. Überwachen Sie die Tiere die Verwertung im &quot;intrabursalen Injection&quot; beschrieben. </li></ol> V. repräsentative Ergebnisse <img src="/files/ftp_upload/2125/2125fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. In-vivo-Bildgebung von Eierstock-Tumor-Zellen in einem orthotopen Mausmodell. OVCAR5 Zellen, die Luciferase wurden intrabursally in rechten Eierstock injiziert und bebildert über die Zeit. Die Bilder wurden 13 (links), 17 (Mitte) und 22 (rechts) übernommen Tage nach der Injektion mit der IVIS Spectrum Imaging-System. Dorsalseite ist im oberen Bedienfeld angezeigt und Bauchseite ist in unteren Bereich. Beachten Sie, dass die peritoneale Ausbreitung von Tumorzellen 22 Tage nach der Injektion. Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Vorschriften her von Institutional Tiere Fox Chase Cancer Center der Pflege und Nutzung Ausschusses durchgeführt.

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Eierstockkrebs ist die häufigste Todesursache unter allen gynäkologischen Malignomen 1. Die hohe Sterblichkeit dieser Erkrankung ist vor allem aufgrund der späten Diagnose und der Mangel an zuverlässigen Diagnoseverfahren 2. Darüber hinaus konventionellen Chemotherapie häufig Begegnungen Chemoresistenz und Rückfall des Cancer 3. Daher ist neuer Therapeutika benötigt, um effektiv Ziel dieser Krankheit. In der Entwicklung neuer Therapien gezielt menschliche Eierstock-Krebs ist es entscheidend, um eine repräsentative Tiermodell zu entwickeln. Ein orthotopen Tiermodell hat Vorteile gegenüber herkömmlichen Xenograft-Modellen (zB subkutane oder intraperitoneale Injektionen von Tumorzellen) in die 1) es gibt den primären Ort der Tumorbildung, 2) er stellt gemeinsamen Standort von Metastasen, und 3) bietet Tumorzellen Interaktion mit den entsprechenden Mikroumgebung 4, 5, 6, 7, 8. Nagetiere haben eine einzigartige bursal Membran, die den Eierstock umgibt und ist kontinuierlich mit den Eileiter. Diese einzigartige Anatomie der Nager ermöglicht Injektion von Eierstock-Tumorzellen orthotop. Intrabursally injiziert Ovarialtumor Zellen verhalten sich ähnlich wie beim Menschen eine Krankheit, und wuchs damit im intrabursalen Membran und Ausbreitung in Bauchhöhle als Tumor fortschreitet. Die Injektion von Zellen stabil exprimiert Luciferasen oder fluoreszierende Proteine ​​erlaubt auch die Verfolgung Verhalten von Tumorzellen in Echtzeit. Bioluminescent und / oder Fluoreszenz-Imaging-Technologie macht es möglich, immer wieder Bild Tumorzellen über einen längeren Zeitraum und studieren das Tumorwachstum,-verteilung und Regression in nicht-invasive Weise 9, 10, 11. Bei der Festlegung der orthotopen Modell, ist es wichtig, schnell zu entfernen, die Nadel aus der Bursa nach der Injektion. Abrupte Entfernen der Nadel verschließt die Einstichstelle und verhindert das Austreten von injizierten Zellen. Doch zur gleichen Zeit sollte die Bewegung sanft sein nicht auf die Bursa reißen. Bei Entweichung während der Injektion kann es Zellen, die Samen in den Bauch verursachen und möglicherweise verwirren die Studie, dh vorzeitige Verbreitung außerhalb des Eierstocks. In diesem Fall sollte die spezifische Tier erfasst und verfolgt für die Entwicklung mehrerer Tumor-Websites in das Bauchfell vor der Behandlung oder alternativ aus den nachfolgenden Analysen ausgeschlossen. Vor der Durchführung eine orale Sonde, ist es entscheidend, die Länge der Sonde Rohr durch Messung von der Spitze den Kopf des Tieres bis zur letzten Rippe zu überprüfen. Es ist hilfreich, das Rohr an der Nase des Tieres Zeichen und geben sie nicht die Röhre Vergangenheit dieser Marke. Insertion des Tubus Vergangenheit dieser Kennzeichnung können in eine Perforation in den Magen führen. Die Bestimmung der Länge der Röhre ist besonders wichtig bei jüngeren Tieren oder Tieren mit einem Gewicht von unter 20 g. Beim Einsetzen des Magensonde Nadel durch die Speiseröhre, sollte es keinen Widerstand oder Kampf aus dem Tier sein. Es ist wichtig, nicht die Lösung oder Suspension zu schnell zu verwalten, da dies zum Rückfluss führen kann und in der Folge zu liefern ungenaue Dosis-Volumen-sowie das Hinzufügen Stress für das Tier. Für vergleichbare Bildergebnisse von Zeit zu Zeit ist es wünschenswert, damit die Zeit konsistent zwischen Injektion von Luciferase-Substrat-und Imaging. Der Zeitablauf kann, indem Reihe von Bildern nach Substrat-Einspritzung und beobachten die Kinetik der Signale bestimmt werden. Entwicklung eines orthotopen Mausmodell des Ovarialkarzinoms, die orale Verabreichung von Medikamenten, und in-vivo-Bildgebung erforderlich sind Techniken zum besseren Verständnis der Entstehung und Ausbreitung von Eierstockkrebs und Bewertung neuer Therapieschemata, die letztlich zu verbessern kann das Ergebnis der Patienten mit dieser tödlichen Krankheit.

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Ketamine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine Hydrochloride</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Lloyd, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Acepromazine</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Vedco, Inc.</td>
<td>Not Available</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>D-Luciferin Potassium Salt</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Caliper Life Sciences</td>
<td>122796</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

in vivo imaging and therapeutic treatments in an orthotopic mouse model of ovarian cancer

Krebs beim Menschen und Ansprechen auf die Therapie ist besser in orthotopen Tiermodellen vertreten. Dieser Beitrag beschreibt die Entwicklung eines orthotopen Mausmodell von Eierstock-Krebs, Behandlung von Krebs über die orale Verabreichung von Medikamenten und Überwachung von Tumorzellen Verhalten als Reaktion auf medikamentöse Behandlung in Echtzeit mit in-vivo-Imaging-System. In diesem orthotopen Modell sind Ovarialtumor Zellen, die Luciferase topisch durch die Injektion direkt in der Maus Bursa, wo jeder Eierstock ist beigefügt angewendet. Nach Injektion von D-Luciferin, ein Substrat der Glühwürmchen-Luciferase, Luciferase-exprimierenden Zellen zu generieren Biolumineszenz-Signale. Dieses Signal wird durch die in-vivo-Imaging-System erkannt und kann für eine nicht-invasive Mittel zur Überwachung des Tumorwachstums, Verteilung und Regression in einzelnen Tieren. Drug Administration über eine orale Sonde ermöglicht eine maximale Dosierung Volumen von 10 ml / kg Körpergewicht, um direkt in den Magen abgegeben werden und ähnelt Abgabe von Medikamenten in der klinischen Behandlungen. Daher beschriebenen Techniken hier, Entwicklung eines orthotopen Mausmodell des Ovarialkarzinoms, die orale Verabreichung von Medikamenten, und in-vivo-Bildgebung, zum besseren Verständnis des menschlichen Ovarialkarzinoms und Behandlung nützlich und verbessert gezielt diese Krankheit.

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In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopen Tiermodellen von Eierstockkrebs zu replizieren besser menschlicher Erkrankungen und damit zu unserem Verständnis der Tumorprogression und Ansprechen des Tumors auf die Therapie. Ein Maus-Modell erhält eine intrabursalen Injektion von Luciferase-exprimierenden Eierstock-Tumorzellen. Die Behandlung erfolgt über eine orale Sonde verabreicht. Das Tumorwachstum wird durch Überwachung<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging-System.

In-vivo-Imaging und therapeutische Behandlungen in einem orthotopen Mausmodell des Eierstockkrebs

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

in-vivo-imaging-therapeutic-treatments-an-orthotopic-mouse-model

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

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Serie: In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature cancer cells growing in their natural location, replicate human disease with high fidelity. Two techniques can be used to establish this model. Both techniques are similar and require mouse anesthesia and laparotomy for exposure of the cecum. One technique involves injection of a colorectal cancer cell suspension into the cecal wall. Cancer cells are first grown in culture, harvested when subconfluent and prepared as a single cell suspension. A small volume of cells is injected slowly to avoid leakage. The other technique involves transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. A mouse with a previously established subcutaneous colorectal tumor is euthanized and the tumor is removed using sterile technique. The tumor piece is divided into small pieces for transplantation to another mouse. Prior to transplantation, the cecal wall is lightly damaged to facilitate tumor cell infiltration. The time to developing primary tumors and liver metastases will vary depending on the technique, cell line, and mouse species used. This orthotopic mouse model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Two techniques can be used to establish this model: injection of a cancer cell suspension into the cecal wall or transplantation of a piece of subcutaneous tumor onto the cecum. This model is useful for studying the natural progression of colorectal cancer and testing new therapeutic agents against colorectal cancer.

Orthotopen Mausmodell der Darmkrebs-

The traditional subcutaneous tumor model is less than ideal for studying colorectal cancer. Orthotopic mouse models of colorectal cancer, which feature ...

Forschung

Biologie

Imaging In-Stent Restenosis: An Inexpensive, Reliable, and Rapid Preclinical Model

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and future drug-eluting stents.
A variety of antibodies and transgenic and knockout strains are available in rats. Consequently, a model for in-stent restenosis in the rat would be convenient for pathobiological and pathophysiological studies. 
In this video, we present the full procedure and pit-falls of a rat stent model suitable for high throughput stent research. We will show the surgical procedure of stent deployment, and the assessment of in-stent restenosis using the most elegant technique of OCT (Optical Coherence Tomography). This technique provides high accuracy in assessing plaque CSAs (cross section areas) and correlates well with histological sections, which require special and time consuming embedding and sectioning techniques. OCT imaging further allows longitudinal monitoring of the development of in-stent restenosis within the same animal compared to one-time snapshots using histology.

This video demonstrates how to use a preclinical inexpensive and reliable model to study pathobiological and pathophysiological processes of in-stent restenosis development. Longitudinal in vivo monitoring using OCT (Optical Coherence Tomography) and analysis of OCT images are also demonstrated.

Imaging In-Stent-Restenose: eine kostengünstige, zuverlässige und schnelle Präklinische Modell

Preclinical models of restenosis are essential to unravel the pathophysiological processes that lead to in-stent restenosis and to optimize existing and ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In-vivo-4-Dimensional-Tracking von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen im erwachsenen Maus Schädeldachknochenmark

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Validierung eines Maus-Modell zu LINC Komplexe Disrupt in einem zellspezifisch

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

Time-Resolved Fluorescence Imaging and Analysis of Cancer Cell Invasion in the 3D Spheroid Model

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major clinical challenge because no efficient method exist for their elimination once their dissemination is underway. A better understanding of the mechanisms regulating cancer cell invasion may lead to the development of novel potent therapies. Due to their physiological resemblance to tumors, spheroids embedded in collagen I have been extensively utilized by researchers to study the mechanisms governing cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). However, this assay is limited by (1) a lack of control over the embedding of spheroids into the ECM; (2) high cost of collagen I and glass bottom dishes, (3) unreliable immunofluorescent labeling, due to the inefficient penetration of antibodies and fluorescent dyes and (4) time-consuming image processing and quantification of the data. To address these challenges, we optimized the three-dimensional (3D) spheroid protocol to image fluorescently labeled cancer cells embedded in collagen I, either using time-lapse videos or longitudinal imaging, and analyze cancer cell invasion. First, we describe the fabrication of a spheroid imaging device (SID) to embed spheroids reliably and in a minimal collagen I volume, reducing the assay cost. Next, we delineate the steps for robust fluorescence labeling of live and fixed spheroids. Finally, we offer an easy-to-use Fiji macro for image processing and data quantification. Altogether, this simple methodology provides a reliable and affordable platform to monitor cancer cell invasion in collagen I. Furthermore, this protocol can be easily modified to fit the users&#8217; needs.

Presented here is a protocol for the fabrication of a spheroid imaging device. This device enables dynamic or longitudinal fluorescence imaging of cancer cell spheroids. The protocol also offers a simple image processing procedure for the analysis of cancer cell invasion.

Zeitaufgelöste Fluoreszenz-Bildgebung und Analyse der Krebszellinvasion im 3D-Sphäroid-Modell

The invasion of cancer cells from the primary tumor into the adjacent healthy tissues is an early step in metastasis. Invasive cancer cells pose a major ...

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their native environment was described more than 10 years ago and sheds new light on the process of platelet formation. Megakaryocytes extend elongated protrusions, called proplatelets, through the endothelial lining of sinusoid vessels. This paper presents a protocol to simultaneously image in real time fluorescently labeled megakaryocytes in the skull bone marrow and sinusoid vessels. This technique relies on a minor surgery that keeps the skull intact to limit inflammatory reactions. The mouse head is immobilized with a ring glued to the skull to prevent movements from breathing.
Using two-photon microscopy, megakaryocytes can be visualized for up to a few hours, enabling the observation of cell protrusions and proplatelets in the process of elongation inside sinusoid vessels. This allows the quantification of several parameters related to the morphology of the protrusions (width, length, presence of constriction areas) and their elongation behavior (velocity, regularity, or presence of pauses or retraction phases). This technique also allows simultaneous recording of circulating platelets in sinusoid vessels to determine platelet velocity and blood flow direction. This method is particularly useful to study the role of genes of interest in platelet formation using genetically modified mice and is also amenable to pharmacological testing (study the mechanisms, evaluating drugs in the treatment of platelet production disorders). It has become an invaluable tool, especially to complement in vitro studies as it is now known that in vivo and in vitro proplatelet formation rely on different mechanisms. It has been shown, for example, that in vitro microtubules are required for proplatelet elongation per se. However, in vivo, they rather serve as a scaffold, elongation being mainly promoted by blood flow forces.

In Vivo Two-photon Imaging of Megakaryocytes and Proplatelets in the Mouse Skull Bone Marrow

We describe here the method for imaging megakaryocytes and proplatelets in the marrow of the skull bone of living mice using two-photon microscopy.

In Vivo Zwei-Photonen-Bildgebung von Megakaryozyten und Blutplättchen im Knochenmark des Mausschädels

Platelets are produced by megakaryocytes, specialized cells located in the bone marrow. The possibility to image megakaryocytes in real time and their ...

Imaging Neutrophil Migration in the Mouse Skin to Investigate Subcellular Membrane Remodeling Under Physiological Conditions

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first immune cells to reach the site of inflammation and to participate in the innate immune response during infection or tissue damage. So far, neutrophil migration has been successfully visualized using various in vitro experimental systems based on uniform stimulation, or confined migration under agarose, or micro-fluidic channels. However, these models do not recapitulate the complex microenvironment that neutrophils encounter in vivo. The development of multiphoton microscopy (MPM)-based techniques, such as intravital subcellular microscopy (ISMic), offer a unique tool to visualize and investigate neutrophil dynamics at subcellular resolutions under physiological conditions. In particular, the ear of a live anesthetized mouse provides an experimental advantage to follow neutrophil interstitial migration in real-time due to its ease of accessibility and lack of surgical exposure. ISMic provides the optical resolution, speed, and depth of acquisition necessary to track both cellular and, more importantly, subcellular processes in 3D over time (4D). Moreover, multi-modal imaging of the interstitial microenvironment (i.e., blood vessels, resident cells, extracellular matrix) can be readily accomplished using a combination of transgenic mice expressing select fluorescent markers, exogenous labeling via fluorescent probes, tissue intrinsic fluorescence, and second/third harmonic generated signals. This protocol describes 1) the preparation of neutrophils for adoptive transfer into the mouse ear, 2) different settings for optimal sub-cellular imaging, 3) strategies to minimize motion artifacts while maintaining a physiological response, 4) examples of membrane remodeling observed in neutrophils using ISMic, and 5) a workflow for the quantitative analysis of membrane remodeling in migrating neutrophils in vivo.

Neutrophil migration relies on the rapid and continuous remodeling of the plasma membrane in response to chemoattractant and its interactions with the extracellular microenvironment. Described herein is a procedure based on Intravital Subcellular Microscopy to investigate the dynamic of membrane remodeling in neutrophils injected in the ear of anesthetized mice.

Bildgebung der Migration von Neutrophilen in der Maushaut zur Untersuchung des subzellulären Membranumbaus unter physiologischen Bedingungen

The study of immune cell recruitment and function in tissues has been a very active field over the last two decades. Neutrophils are among the first ...

Bildgebung von mitochondrialem Peroxid in lebenden Hefezellen mit mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, cancer, and normal aging. Here, an approach is described to assess mitochondrial function in living yeast cells at cellular and subcellular resolutions using a genetically encoded, minimally invasive, ratiometric biosensor. The biosensor, mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), detects hydrogen peroxide (H2O2) in mitochondria. It consists of a mitochondrial signal sequence fused to a circularly permuted fluorescent protein and the H2O2-responsive domain of a bacterial OxyR protein. The biosensor is generated and integrated into the yeast genome using a CRISPR-Cas9 marker-free system, for&#160;more consistent expression compared to plasmid-borne constructs.
mtHyPer7 is quantitatively targeted to mitochondria, has no detectable effect on yeast growth rate or mitochondrial morphology, and provides a quantitative readout for mitochondrial H2O2 under normal growth conditions and upon exposure to oxidative stress. This protocol explains how to optimize imaging conditions using a spinning-disk confocal microscope system and perform quantitative analysis using freely available software. These tools make it possible to collect rich spatiotemporal information on mitochondria both within cells and among cells in a population. Moreover, the workflow described here can be used to validate other biosensors.

Autor im Rampenlicht: Advancing Mitochondrial Research - mtHyper7 Biosensor für die subzelluläre Analyse 

Hydrogen peroxide (H2O2) is both a source of oxidative damage and a signaling molecule. This protocol describes how to measure mitochondrial H2O2 using mitochondria-targeted HyPer7 (mtHyPer7), a genetically encoded ratiometric biosensor, in living yeast. It details how to optimize imaging conditions and perform quantitative cellular and subcellular analysis using freely available software.

Bildgebung von mtHyPer7, einem ratiometrischen Biosensor für mitochondriales Peroxid, in lebenden Hefezellen

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...