Mit diesem ausgeklügelten, nicht-invasiven Werkzeug können wir die Kinetik des Tumorwachstums und die metastasierende Besiedlung bei Mäusen in Echtzeit überwachen, was ein großes Potenzial für die Brustkrebstherapie und das Krankheitsmanagement hat. Die Kombination von Luciferase und Fluoreszenzdetektion ist eine hilfreiche Strategie, um die präklinischen Studien zur Progression von Brustkrebs und zum Krankheitsmanagement voranzutreiben. Dies kann für Krebsmedikamentenstudien angewendet werden.
Dieses Protokoll ist nicht auf Brustkrebs beschränkt und könnte auf andere Karzinome wie Lunge und Bauchspeicheldrüse angewendet werden. Beginnen Sie damit, die MCF-7-, MDA-MB-468- und MDA-MB-231-GFP- und Luciferase-positiven Zellen separat in einer 16-Zentimeter-Platte auf 80% Konfluenz zu züchten. Nachdem Sie die Zellen durch Trypsinisierung geerntet haben, säen Sie eine zunehmende Anzahl von Zellen in jedem Well in eine schwarze 96-Well-Platte.
Füllen Sie dann alle Vertiefungen mit 100 Mikrolitern DMEM und inkubieren Sie für 16 bis 24 Stunden in einem Inkubator von 37 Grad Celsius und 5% CO2. Bereiten Sie Luciferinlösung in PBS in einer Konzentration von 1,5 Milligramm pro Milliliter vor und lagern Sie die Lösung bei minus 20 Grad Celsius. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation einmal vorsichtig mit PBS, bevor Sie 100 Mikroliter Luciferinlösung in jede Vertiefung geben.
Warten Sie zwei Minuten und messen Sie dann die Luciferase-Aktivität in allen Brustkrebszellen mit Biolumineszenz. Bevor Sie die Maus injizieren, übertragen Sie fünf Millionen MCF-7- und MDA-MB-468-Zellen in 200 Mikroliter PBS und zwei Millionen MDA-MB-231-GFP- und Luciferase-positive Zellen in 100 Mikroliter PBS. Bereiten Sie die betäubte Maus für die Injektion vor, indem Sie einen Kegel in Rückenlage über den Kopf legen.
Als nächstes wischen Sie den Bauchbereich der Maus über der Brustdrüse mit Ethanol mit einem Wattestäbchen ab und heben Sie die vierte Brustdrüse mit einer Pinzette an, bevor Sie eine 27-Gauge-Nadel unter das Fettpolster einführen, um langsam 100 Mikroliter der vorbereiteten Zellsuspension zu injizieren. Nehmen Sie nach der Injektion die Maus aus der Haube und bringen Sie sie unter Beobachtung in einen neuen Käfig, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt. Halten Sie vor der Biolumineszenzerkennung die bewusste Maus zurück, indem Sie ihren Hals mit der linken Hand halten und die Hand nach links neigen, was dazu führt, dass das Gesicht der Maus nach oben mit dem Unterkörper in Rückenlage steht.
Injizieren Sie 100 Mikroliter 30 Milligramm pro Milliliter Luciferin intraperitoneal in den unteren linken Bauchquadranten der Maus mit einer Ein-Milliliter-Spritze. Halten Sie die Maus sieben Minuten ohne Anästhesie, gefolgt von drei Minuten in der Anästhesiekammer, bevor Sie die Tumorkinetik messen. Während sich die Maus in der Inkubation befindet, öffnen Sie die Software und initialisieren Sie das Imaging-System, indem Sie auf die Schaltfläche Initialisieren klicken.
Halten Sie das Setup bei der automatischen Belichtung mit einer Belichtungszeit im Auto bei 60 Sekunden, Binning Medium bei einer Blende von f / stop eins, Anregungsfilter blockiert und Emissionsfilter offen. Wenn die Initialisierung beendet ist, wählen Sie Imaging-Assistent und Biolumineszenz aus, und klicken Sie dann auf Weiter, Filter öffnen, um die Maus im Bildmotiv auszuwählen. Wählen Sie in der Feldansicht Stufe C bei 10 Zentimetern und Motivhöhe bei 1,50 Zentimetern.
Klicken Sie dann auf Image Setup Stage, um C.Stellen Sie sicher, dass die Maus in der richtigen Rückenlage auf der Bühne platziert ist, bevor Sie die Tür schließen und auf die Schaltfläche Acquire klicken. Warten Sie, bis ein Bild auf dem Bildschirm angezeigt wird. Wiederholen Sie den Vorgang für die andere Maus.
Um Lungenmetastasen zu erkennen, decken Sie das starke Signal des Primärtumors mit einem dicken Papppapier ab und legen Sie nur die ventrale Seite der Lunge gegenüber der Kamera frei. Erfassen Sie das Bild mit den gleichen Parametern wie zuvor beschrieben. Die Brustkrebs-Zelllinien wurden mit einem Lentivirus-Vektor infiziert, der fluoreszierendes GFP exprimiert, und einer FAC-Sortierung unterzogen.
Die GFP-positiven Zellen wurden zwei Tage nach der Infektion sortiert, plattiert und mit dem Fluoreszenzmikroskop visualisiert. Die In-vitro-Luciferase-Aktivität wurde durch einen zellzahlabhängigen Anstieg der Luciferase-Aktivitätsniveaus bestätigt. Zusätzlich wurde eine lineare Korrelation zwischen der Luciferase-Aktivität und der Zellzahl gefunden.
Nach der Injektion der Brustkrebszelllinien wurden die Mäuse alle zwei Wochen einer Biolumineszenzmessung unterzogen, um die Kinetik des Tumorwachstums zu bestimmen. Die Kinetik des Tumorwachstums war in den MDA-MB-231-Zelllinien schneller als in den weniger aggressiven Zelllinien MCF-7 und MDA-MB-468. Die Lumineszenzaktivität wurde für drei Zelllinien quantifiziert.
Sechs Wochen nach der Injektion wurde festgestellt, dass die geernteten Tumore die GFP-Expression aufrechterhielten. Außerdem wurden positive Biolumineszenzwerte aus der Lunge der gesamten Maus in Echtzeit erhalten. Die Lunge wurde geerntet, um positive metastatische Kolonien zu überprüfen, und die metastatischen Kolonien wurden auf GFP und Biolumineszenz beobachtet.
Es ist wichtiger, bei der Durchführung des Injektionsverfahrens vorsichtig zu sein. Eine unsachgemäße Injektion kann zu einer Abweichung der Tumorwachstumsrate oder zum Fehlen eines Tumors führen. Wir können die Lungenmetastasierung in vivo und ex vivo untersuchen, indem wir die GFP-Expression nachweisen.
Darüber hinaus können wir auch die Histopathologie der Lunge durch immunhistochemische Färbung untersuchen. Diese Technik kann nützlich sein, um die neuen Fragen zu untersuchen, z. B. die Wirkung von Arzneimittelwirksamkeitsstudien.
