Alle Experimente wurden unter der Aufsicht der Purdue Animal Care und Use Committee und dem Laboratory Animal Program an der Purdue University durchgeführt. Diese Arbeit wurde von der Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) Microsystems Technology Office (MTO), unter der Schirmherrschaft von Dr. Jack W. Judy (jack.judy @ darpa.mil) als Teil des Reliable Neural Technology Program gesponsert durch das Space and Naval Warfare Systems Command (SPAWAR) Systems Center (SSC) Pacific Grant No N66001-11-1-4013. Die Autoren bedanken sich bei Mikhail Slipchenko, Don Ready, Greg Richter, Aaron Taylor und Kevin Eliceiri für den Austausch ihrer Mikroskopie Expertise danken.

Lösungen Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) - in g / l; 9 g NaCl, 0,144 g KH 2 PO 4, 0,795 g Na 2 HPO 4, bei pH 7,4 4% Formaldehyd - in ml / l, 202 ml dibasisches Natriumphosphat-Lösung (0,4 M Na 2 HPO 4), 48 ml Natriumdihydrogenphosphat-Lösung (0,4 M NaH 2 PO 4), 500 ml 8% iger Formaldehydlösung, 250 ml Milli- Q DDi Wasser, bei pH 7,4 HEPES gepufferte Hank Saline mit Natriumazid (HBHS) - in g / l; 7,5 g NaCl, 0,3 g KCl, 0,06 g KH 2 PO 4, 0,13 g Na 2 HPO 4, 2 g Glucose, 2,4 g HEPES, 0,05 g MgCl 2 6 Teile H 2 O, 0,05 g MgSO 4 7 Teilen H 2 O, 0,165 g CaCl 2, 0,09 g NaN 3 bei pH-Wert 7,4 Wash Solution (WS) - 1% Vol / Vol, Normal Ziegenserum, 0,3% Triton X-100, in HBHS mit Natriumazid (NaN 3). Kühlen die WS bei 4 ° C vor der Verwendung in nachfolgenden Schritten. U2 Sca l e Lösung - 4 M Harnstoff, 30% Glycerin und 0,1% Triton X-100 17 VERFAHREN Alle Experimente wurden unter der Aufsicht der Purdue Animal Care und Use Committee und dem Laboratory Animal Program an der Purdue University durchgeführt. Ein. Chirurgie <ol><li> Verschiedene aseptischen chirurgischen Methoden sind kompatibel mit dem vorgestellten histologische Methode. Die Verwendung eines stereotaktischen Rahmen und automatisierte Kuvertiermaschinen werden empfohlen, um die Reproduzierbarkeit und Kontrolle der Mikroelektrodenarrays (MEA) Implantation Winkel bezüglich stereotaxischen Ebenen verbessern. </li></ol> Hinweis: In dieser Demonstration unserer OP-Methode ist wie folgt: Halten Sie die Nagetierlebewesen in stereotaktischen earbars while unter Isofluran Narkose (zwischen 1-3%) von medizinischem Sauerstoff durchgeführt. Test für das Fehlen einer Vorspur Quetschung in der Ratte oder das Fehlen eines Schwanzes Pinch-Reflex in der Maus reflektieren, um zu bestätigen, dass das Tier betäubt voll ist. Bewerben Augensalbe und reinigen Sie die Operationsstelle mit drei wechselnden Wäschen Betadine und Ethanol. Hände waschen, Morgendämmerung OP-Handschuhe, Haarnetz, Mundschutz und Kittel. Inject einen Bolus von Lidocaine den OP-Bereich zu betäuben, erstellen einen Einschnitt mit einer Schere oder ein Skalpell, klare Periost mit Knochen Schaber und Watteträger, und erstellen Sie eine Kraniotomie mit einem Dentalbohrer Handstück und Bohrer. Fahren Sie einen Single-Schaft MEA in die Rinde mit einem Mikromanipulator. Haben einen chirurgischen Assistenten helfen bei der aseptischen Chirurgie Bedingungen und dokumentieren den Fortschritt der Chirurgie. <ol start="2"><li> Nach Implantation der MEA in das Gehirn, sammeln Bildern durch ein Operationsmikroskop, um die eventuelle Entfernung des Schädels aus aller b informierenregen. Implantierten Teile der Geräte werden in situ erhalten werden. </li></ol> Anmerkung: Die eventuelle Entnahme von Gewebe mit in situ-Geräten basiert auf eng übereinstimmenden die Ebene der Geräteeinsteckzapfen mit der Ebene des Gewebes Sektionieren. Ausführliche Erläuterungen über dem Geräteeinsteckzapfen Ebene relativ zum Gehirn sind daher sehr wichtig. <ol start="3"><li> Nach Gerät Implantation, gelten die Silikonelastomer Kwik-Sil (WPI), um jeden ausgesetzt MEA Schäfte oder Verkabelung, und aushärten lassen. Eine sterilisierte Kunststoffteil, wie einem Schnitt Pipettenspitze, verwendet zur Eindämmung der Silikonelastomer in einem kleinen gut um den Kraniotomie während der Aushärtung werden. </li><li> Tragen Sie eine Schicht von zweiteiligen Zahn Acryl (&quot;Jet Liquid&quot; und &quot;Jet Powder&quot; von Lang Dental) über den Kwik-Sil und alle exponierten Schädel. </li></ol> Anmerkung: In einem späteren Schritt wird die durch Kopfbedeckungsgegenstand geschmolzen werden, um das Implantat zu trennenden ermöglichenaus dem Schädel. UV-härtende Acryl sollte über den Kwik-Sil und Kraniotomie vermieden werden, da dies sehr schwer Acryl ist später schwer zu entfernen. Optisch opake Materialien rund um das Implantat sollte auch vermieden werden, klare Kwik-Sil bietet eine Ansicht des Implantats während der nachfolgenden Schritte dieses Protokolls. <ol start="5"><li> Führen post-operative Betreuung Verfahren nach dem lokalen Protokoll der Tierschutzvorschriften und kehren ambulanten Probanden einzeln untergebracht Käfig-Boxen. </li></ol> 2. Perfusion und Tissue Sammlung Hinweis: Siehe Gage et al. Für eine detaillierte Perfusion Komplettlösung in der Ratte Tiermodell 19. <ol><li> Verwenden Sie die Anästhesie und Perfusion Protokoll der Institution Tierhaltung und Verwendung gebilligt. Nach tief anästhesiert das Nagetier (bestätigt durch einen Mangel an Zehen-Pinch Reflex in Ratte oder Schwanz-Pinch Reflex in Mäusen) und Aussetzen des Herzens zu machen flachen Scherenschnitt inan den linken Ventrikel und rechten Vorhof. Legen Sie eine stumpfe Nadel in die linke Herzkammer und liefern Raumtemp PBS. Liefern insgesamt ~ 10 ml PBS bei ~ 5 ml / min bei Mäusen und ~ 200 ml PBS bei ~ 100 ml / min bei Ratten. Suchen Sie nach Blut-Clearance von der Leber während. </li><li> Injizieren histologisch relevanten chemischen Markierungen transkardial, falls gewünscht, mit einer Spritze Lieferung mit darauf geachtet werden, Einführen von Bläschen. </li></ol> Anmerkung: Vascular Etiketten (zB DiI) und Nukleinsäure-Gegenfärbung Farbstoffe (zB Hoechst 33342) sind Beispiele für chemische Markierungen lieferbaren während der Perfusion. Bei Verabreichung richtig, sollten diese histologischen Markern beschriften das ganze Tier 20. <ol start="3"><li> Liefern gepufferten, Raumtemperatur, 4% Formaldehyd transkardial um das Tier zu fixieren. Vermeiden Septumperforation über das Herz, die durch Lungen-Nase Entwässerung während der Perfusion nachgewiesen werden kann. Schauen Sie zur Fixierung Zittern in den großen Muskelnum eine vollständige Perfusion anzuzeigen. Liefern insgesamt ~ 10 ml Fixierlösung bei ~ 5 ml / min bei Mäusen und ~ 200 ml Fixierlösung bei ~ 100 ml / min bei Ratten. </li><li> Nach Perfusion, enthaupten das Tier aussetzen Teil der Hirnstamm oder Kleinhirn mit rongeurs oder Schere, Ort und Kopf in 4% Formaldehyd-Lösung über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Waschen Sie den Kopf in drei Änderungen des PBS mit 3.59 Stunden-Intervallen zwischen den Waschgängen. </li><li> Bewahren feste Köpfe in HBHS mit Natriumazid bei 4 ° C für Tage bis Monate. </li></ol> 3. Gehirn Entfernung mit in situ Devices Hinweis: Führen Sie diesen Abschnitt in einem Abzug, während das Tragen geeigneter persönlicher Schutzausrüstung. Vermeiden Gewebeaustrocknung durch Rücksendung der festen Kopf Lösung periodisch HBHS. <ol><li> Sorgfältig sezieren weg Haut und andere Gewebe aus der ganzen Acryl Käppchen mit einer Pinzette und kleine Schere. </li><li> Während das Tragen Wärme-insensitive Handschuhe, mit einem Lötkolben zu zahnärztlichen Acryl zu entfernen und eine Fläche von zugrunde liegenden klaren Kwik-Sil (Abbildung 2a). </li></ol> Anmerkung: Das Ziel dieses Schrittes ist es, eine Mikro-Schere geeigneten Winkel für den Zugang zu Positionen, wo die implantierten Vorrichtungen ins Gehirn, so daß brain-implantierten Komponenten von den Komponenten, die an dem Schädel getrennt werden können. <ol start="3"><li> Unter einem Operationsmikroskop, in die Silikonelastomer mit gekrümmten Mikro-Schere geschnitten und entfernt kleine Stücke von Kwik-Sil mit einer Pinzette auf der Position, wo die Vorrichtungen das Gehirn gelangen. </li><li> Weiterhin Schneiden entlang der Oberfläche der gekrümmten Kraniotomie mit Mikro-Schere getrennten Vorrichtungskomponenten an Polysilizium und Schädel von Komponenten in das Gehirn implantiert. Wieder verwenden Mikroskopvergrößerung und große Sorgfalt beim Schneiden durch die freigelegten Gerätekomponenten, wobei darauf zu achten Schieben oder Ziehen der implants im festen Gewebe. </li><li> Entfernen Sie Knochen um das headcap vorsichtig mit rongeurs. Verwenden Sie einen Spachtel, um das Gehirn mit implantierten Geräten aus dem Schädel zu trennen. Bewahren Sie das Gehirn in HBHS Lösung erst kurz zu schneiden. </li><li> Platzieren des Gehirns in einem Glas Petrischale mit HBHS gefüllt, und Verwenden einer Rasierklinge Fremdgewebe zu entfernen, wie Rückenmarksverletzungen, Cerebellum oder Riechkolben, je nachdem ob sie sind für die Position des Geräts Implantation. Verwenden eines Gehirns Block (Ted Pella) und Rasierklingen Abschnitt des Gehirns und eine flache Ebene eng übereinstimmenden den Winkel der implantierten Geräten, dies wird durch Anordnen des Gehirns in einer geeigneten Größe Gehirn blockieren bewerkstelligt, Orientieren des Gehirns so dass jegliche sichtbare Teil des Implantats parallel ist mit der Rasierklinge Führung und Anordnen einer Rasierklinge in einer Klingenführung mindestens 2 mm von dem Implantat. Drücken Sie die Rasierklinge durch das Gewebe. Montieren Sie diese Fläche zu einem Vibratom Plattform. Alternativ, montiert eine Rasierklinge auf einen Mikromanipulator kann in ähnlicher Weise gesteuert Mode als dem Gehirn blockieren, um eine Ebene eng übereinstimmenden die Richtung des Implantats zu schaffen verwendet werden. </li><li> Statt Eis unter der Vibratom Plattform, und, nachdem man die Gewebeoberfläche kurz auf einem Papiertuch trocknen, haften das Gehirn mit einem Vibratom mit Super Glue. Kleben Sie das flache Gewebe Flugzeug in der vorherigen Schritt erstellt wird auf die Bühne. Gewebe mit asymmetrischen Abmessungen, Ausrichten der Probe derart, daß der breiteste Dimension unten parallel zu der Bewegungsrichtung der Klinge Vibratom vermeiden zu helfen die Klinge potentiell Klopfen des Gewebes über verklebt. Nach den Klebesätze (~ 1-2 min), fügen gekühlt (~ 4 ° C) PBS zu der Vibratom Schale um das Gewebe. </li><li> Sammle dicke Gewebeschnitte zwischen 200-400 um, einschließlich der Kontrolle Gewebe, unter Verwendung der maximalen Schwinggeschwindigkeit (~ 100 Hz) und eine langsame Klinge Progression (&lt;0,2 mm pro Sekunde), mit einem Anstellwinkel von 10 ° von horizontal. Sammle Scheiben vorsichtig mit einem Pinsel oder Schaufel Spachtel und Geschäft in HBHS in einer 24-Well-Platte bei 4 ° C. </li><li> Sobald die Vorrichtung in situ sichtbar für das bloße Auge oder ein Operationsmikroskop, sammeln dünnere Abschnitte um die Vorrichtung in Slice Schritten von 100 um oder weniger annähern. </li></ol> Hinweis: Typische Silicium Mikroimplantate sind mit bloßem Auge in Formaldehyd fixierten Nagetier Großhirnrinde Gewebe zwischen 300 und 500 um von der Oberfläche der Vorrichtung. <ol start="10"><li> Mit dem in situ Gerät jetzt auf die Oberfläche des Gewebes zu schließen, sammeln eine&gt; 250 um Gewebeschnitt mit dem Gerät innerhalb. Abschätzung der notwendigen Dicke kann durch Bezugnahme auf zuvor gesammelten Scheiben unterstützt werden. </li></ol> Hinweis: Größere Geräte Mehrzahn Vorrichtungen und Geräte erfordern abgewinkelten dickeren Gewebeschnitt (&gt; 500 um), die Vorrichtung in einem Stück Gewebe einzufangen; reMitglied, dass sowohl das Eindringen von aufgebrachten Etiketten und der Mikroskopie Tiefe in der späteren Datenerhebung wird aus diesen sehr dicke Scheiben begrenzt werden. Wenn möglich, vermeiden schlug das Gerät mit dem Vibratom Klinge, da dies kann dazu führen, indem Sie das Gerät durch das Gewebe und morphologischen Verformung. 4. Tissue Processing und Clearing <ol><li> Waschen Scheiben 3x bei 5 min pro Waschgang in HBHS </li><li> Inkubieren in Natriumborhydrid (5 mg NaBH 4/1 ml HBHS) 30 min insgesamt (15 min auf jeder Seite der Scheibe). Drehen Sie die Scheiben mit einem Edelstahl oder Teflon beschichtete Mikro Löffel und kleinen Pinsel (Ted Pella). Langsam und nachdenklich Bewegungen zu verbessern, den Erfolg jeder Scheibe flip. Berühren Sie keine Bereiche um das implantierte Gerät mit dem Pinsel. Wenn möglich, indem deutlich mehr Lösung als erforderlich (&gt; 2 ml) ermöglicht ein zu manipulieren und drehen Sie die Gewebeschnitte leichter. </li></ol>Hinweis: Dieser Schritt reduziert endogenen Autofluoreszenz; diesen Schritt überspringen, wenn Fluoreszenzmarkierungen während der Perfusion angewendet wurden oder xFP transgenen Marker vorhanden sind. <ol start="3"><li> Waschen Scheiben 3x bei 5 min pro Waschgang in Waschlösung bei Raumtemperatur. </li></ol> Hinweis: Agitation während des Waschens und Inkubationsschritte ist optional. Die Autoren vermuten, dass subtile Erschütterungen des steifen Implantats in Bezug auf das umgebende Hirngewebe kann unter Rühren erfolgen. Jedoch kann eine Orbitalmischer sich mit einer sanften Rate (&lt;60 rpm) vermeiden dies bei gleichzeitiger Erhöhung der Bewegung der Lösungen. <ol start="4"><li> Sperre für 2 Stunden in Waschlösung bei Raumtemperatur (Flip Scheiben nach einer Stunde). </li><li> Inkubieren in primären Antikörper (verdünnt in Waschpuffer) für ungefähr 48 h (24 h auf jeder Seite der Scheibe) bei 4 ° C. </li><li> Führen Sie 6 schnellen 3 min Waschen mit Waschlösung. </li><li> Führen Sie 6, 1 hr Wäschen (3 washes auf jeder Seite des Gewebes Scheibe) in Waschlösung (lagern bei 4 ° C, wenn Waschen über Nacht). </li><li> Inkubieren in Sekundärantikörper (verdünnt mit Wash Solution) für ca. 48 Std. (24 Std. auf jeder Seite) in 4 ° C. </li><li> Führen Sie 6 schnellen 3 min Waschen mit Waschlösung. </li><li> Führen Sie 6, 1 hr Wäschen (3 Wäschen auf jeder Seite) in Waschlösung; lagern bei 4 ° C, wenn Waschen über Nacht. </li><li> Entfernen Waschlösung und fügen Sie die Glycerin-based &quot;U2 - Sca l e&quot; Clearing-Lösung. Lassen Sie ca. 1 Woche für dicke Scheiben (250-500 um) oder 2-3 Wochen klar für sehr dicke Gewebeschnitte (&gt; 500 um) bei 4 ° C. </li><li> Platte mit Folie abdecken und bei 4 ° C. </li><li> Montieren Sie in Folien Aufnahme dicke Gewebeschnitte (Abbildung 2b, 2c) mit Clearing-Lösung als Eindeckmittel und Versiegeln mit klarem Nagellack. Lagerung bei 4 ° C weg vom Licht. </li></ol> 5. Panorama Imaging von Full Tissue und Device Interface <ol><li> Verwendung längerer-Arbeitsabstand Mikroskopobjektive (&gt; 2 mm), beginnen Bildgebung mit einem Laser-Scanning konfokalen Mikroskops oder 2-Photonen-Mikroskop. Wir werden mit einem Zeiss LSM 710 von Carl Zeiss &quot;Zen&quot;-Software (2010), und einem Computer-gesteuerten XY übersetzen Bühne Bild ein 3D-Panorama um ein Implantat zu demonstrieren. </li></ol> Anmerkung: Korrigieren der Brechungsindex des Clearing-Lösung entweder in Software, durch eine korrigierende Kragen auf dem Ziel oder in der Datenverarbeitung nach der Sammlung. In dieser Demonstration geben wir einen Brechungsindex Wert für die &quot;U2&quot; Clearing-Lösung von 1,4 in die Leica Zen Mikroskop-Software; diese Einstellung dezent passt z-Schritt Abständen zu berücksichtigen Brechungsindex mismatch. <ol start="2"><li> Im Gewebe in der Nähe der Vorrichtung, grob abschätzen die entsprechenden Z-Achsen-Fenster und Einstellungen für die Erfassung in der Z-Dimension für jeden Kanal unter Verwendung fluoreszierender niedrigen Laserleistung (~ 00,5 bis 5%) und großen z-Schrittweiten (&gt; 25 um). </li></ol> Hinweis: Fügen Sie zusätzliche Raum oberhalb und unterhalb bei der Einstellung der z-Achse bei der Einrichtung für Panorama-Datenerfassung, da das Gewebe nicht lügen kann ganz flach auf dem Objektträger (~ 20 um jede Richtung). <ol start="3"><li> Zum Ziel gesetzt, bei der xy Mitte des eventuellen panorama; mit dem Zen Panorama-Software, die Anzahl der Sammlung Positionen für jede Achse (x und y) für Ihre Region von Interesse abzudecken erforderlich. </li><li> Überdenken und Fertigstellung des z-Achse Sammlung Fenster. </li><li> Manuell die Empfindlichkeit des Detektors und Laserleistung angemessen Rampe mit erhöhter Tiefe; das Ziel ist in der Regel etwa gleich bleibt, Bildintensität unabhängig von Bildtiefe in das Gewebe Scheibe, sondern auch Vermeidung hoher Geräuschkulisse. </li><li> Sammle jedes Fluoreszenzbild Datenreihen. Wenn notwendig, um Überschneidungen zu vermeiden Signale laufen Laserlinies nacheinander. </li></ol> Hinweis: Falls vorhanden, legen Sie die Software automatisch Daten speichern auf der Festplatte während der Sammlung. <ol start="7"><li> Ändern Sie die Software-Einstellungen, um die &quot;Reflexion&quot; und &quot;Durchlässigkeit&quot; Daten zu sammeln, und verwenden Sie einen längeren, mehr Durchschlagskraft Wellenlänge Laser (zB 633 nm), um diese Kanäle zu erfassen. Bestimmen Sie die entsprechende Laserleistung und Detektorempfindlichkeit für &quot;Reflexion&quot; und &quot;Durchlässigkeit&quot; Sammlung und wiederholen Sie den gleichen Kollektion Serie rund um das implantierte Gerät. </li><li> Exportieren Sie die Daten zur späteren Verarbeitung, Quantifizierung und Analyse. </li></ol>

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Die Autoren haben keine relevanten Angaben zu erklären, finanziell oder anderweitig.

Der &quot;Device-Capture Histologie&quot; (DCHist)-Methode hier gezeigt ermöglicht die enge histologische Beurteilung der morphologisch konservierten Wechselwirkungen zwischen Hirngewebe und Gewebeimplantate. DCHist Gewebesammelbeutel erfordert eine sorgfältige Trennung der Schädel-Mounted-Device-Komponenten von den Komponenten im Gehirn implantiert. DCHist erfordert auch Sammlung von einer dicken histologischen Gewebeschnitt (&gt; 250 um). Diese Gewebeschnitten, einmal markiert, gelöscht, montiert und abgebildet werden, können neue Einblicke in die Implantation Verletzungen oder Folge einer chronischen Reaktion auf innewohnende Geräte bieten. Mit Hilfe modernster Mikroskopie-Tools, kann die Schnittstelle zwischen Gewebe und Gerät abgebildet und analysiert werden in hohen Details, wie in den Abbildungen 3-5 dargestellt. Die vorgestellten Techniken in ihrer derzeitigen Form beruhen auf der Fähigkeit, langsam graben sich die Kopfhaube aus zwei Teilen Zahnzement und Kwik-Sil bis zu dem Punkt des Gerätes Implantation.Verwendung Dentalzement die weg gebrannt werden kann oder auf andere Weise entfernt und eine klare Silikonelastomer durch welche kleine Schere geführt optisch stark in erfolgreich Abtrennen der implantierten Vorrichtung aus dem Schädel-mounted-Komponenten unterstützen kann. Der Versuch, das Gerät unter dem Schädel und das Gehirn über geschnitten, um es in situ zu sammeln ist nicht empfehlenswert, da der Schädel montierte Implantat heraus wird im Gehirn eine signifikante Menge abgezogen werden. Obwohl dünner, kleiner Implantate, wie einzelne Schaft MEAs aus NeuroNexus Technologies, am ehesten zugänglich zu DCHist sind, werden die Prinzipien nicht auf einzelne Geräte Schäfte oder Mikroelektroden-Arrays beschränkt. Sammlung und Imaging-Strategien sind breit anwendbar zu Multi-Schaft Geräte und größere Implantate wie Kanülen, mit den Anforderungen ist, dass sie von jedem Schädel Halterung getrennt werden gesammelt und in einem dicken Gewebeschnitt. Obwohl die Autoren sich auf die Analyse von Gewebe konzentriertumgebenden kortikalen Implantate könnten Geräte tiefer in das Gehirn getrieben ebenfalls gesammelt und abgebildet werden. Die Tiefe der Implantation sollte nicht die Erfassung des Implantats in einer Scheibe vorgesehen das Gerät nicht wild abweichend zur bekannten Winkel Einschubrichtung. Einschränkungen existieren, um die nützliche Anwendung der DCHist Methode. Hirngewebe Abschnitte sind image Herausforderung durch Hunderte von Mikrometern, insbesondere in den Bereichen der weißen Substanz, obwohl optische Clearing-Lösungen erheblich verbessern kann imaging Tiefen in verschiedenen Geweben 21. Zur weiteren Verbesserung Abbildungstiefe kann Zweiphotonenanregung Mikroskopie zusammen mit dem optischen Lichtung beschrieben eingesetzt werden. Eine weitere mögliche Einschränkung des beschriebenen Verfahrens lassen sich die spezifische fluoreszierende Immunohistochemie Methoden und Antikörper durch Forscher entsprechend eingesetzt werden. Passive Diffusion in der Regel treibt die Integration dieser Marker durch feste Gewebeund auf Antigen-Bindungsstellen. Fertigen Antikörper Arbeiten Konzentrationen müssen die Forscher auf einer von Fall zu Fall zu kennzeichnen Eindringen zu maximieren bei gleichzeitiger Vermeidung hoher Hintergrund Kennzeichnung festgelegt werden. Antikörpermarkierung sollte nicht variabel zwischen Scheiben, die identisch verarbeitet werden, aber verschiedene Antikörper können beträchtlich variieren in ihrer Fähigkeit, zu durchdringen und zu markieren ihr Antigen, wobei einige Antikörper leicht Etikettieren Antigene viele hundert Mikrometer tief und andere Markierungen Antigene nur zehn Mikrometer tief. Wir beschreiben die Verbesserung dieser Diffusion durch Anlegen Antikörper markiert bei höheren Konzentrationen als typische, für mehrere Tage der Applikation, und in einer Lösung, die verdünnte Reinigungsmittel und Blockierserum. Periodisch Spiegeln die Scheiben fördert auch noch die Etikettierung. Antigenwiedergewinnung Schritte und alternative Fixierung Prozesse (zB Glutaraldehyd, Mikrowellen etc.) geeignet sein für spezifische Antigene. Sekundärantikörper-fluorochrom Konjugate können auch in ihrer Leistung Kennzeichnung dicke Schnitte variieren, obwohl dies von den Autoren nicht mit Alexa Fluor Etiketten von Invitrogen beobachtet worden. Alternativ kann transgenes Tier exprimieren Probanden fluoreszierenden Proteine ​​in den Zelltypen von Interesse verwendet werden, um Probleme mit Antikörpermarkierung Penetration zu vermeiden, da viele fluoreszierende Proteine ​​wie eGFP, behalten ihre Fluoreszenz nach Formaldehyd-Behandlung, und kann unmittelbar visualisiert Gewebeschnitten. DCHist ist eine leistungsfähige Reihe von Techniken zur Erfassung und Analyse der Auswirkungen von implantierten Microdevices an Hirngewebe. Kopplung dieser histologischen Protokoll mit in vivo Beurteilung der Elektrophysiologie Qualität und Elektrodenimpedanz Daten 22 könnte erheblich verbessern unser Verständnis der biologischen Quellen der Physiologie Variabilität und Abbau. Der Bereich der implantierten neuronalen Prothesen kann insbesondere aus der ausführlichen DCHist ima profitierenGing der intakten Gerät / Gewebe-Grenzfläche zur Weiterentwicklung der biologisch neutral MEA-Geräte informieren.

Das Gebiet der Forschung soll neuroprothetische Individuen leiden unter verschiedenen Behinderungen und Störungen durch Umgehen erkrankten oder geschädigten Strukturen im Körper durch ZNS Schnittstellenvorrichtungen 1,2 unterstützen. Brain-implantierten Microdevices, wie Mikroelektroden-Arrays (MEAs), können verwendet werden, um aufzuzeichnen oder zu stimulieren Hirnstrukturen, und ermöglichen so den Aufbau von langfristigen Schnittstellen zwischen Elektronik und ZNS-Gewebe 3-5 werden. Durchdringenden MEAs, Vorrichtungen, die in das Gehirngewebe angetrieben werden, halten besonders vielversprechend als bidirektionale Schnittstellen aufgrund der engen Nähe innerhalb der sie präsentieren Elektroden auf eine relativ kleine Gruppe von Neuronen in der Nähe 6. Jedoch komplex Gewebereaktionen ergeben sich aus der langfristigen Implantation durchdringenden MEAs, was häufig in variablen und allmählich Vermindern elektrophysiologischen Signal-zu-Rausch-Verhältnissen über Tage bis Monate, und ein Anstieg der elektrischen ImpedanzGleichgewicht zwischen Elektrode Seiten und Boden 7,8. Die putativen Ursprünge dieser Änderungen umfassen die Aktivierung der Mikroglia, reaktive Astrozytose entlang der Mikrovorrichtungen, und einen Verlust oder Migration von Neuronen aus dem umgebenden Gewebe zu implantierenden Vorrichtungen 9-11. Eine große Herausforderung für das Verständnis dieser Gewebsveränderungen um chronische, Penetration MEAs ist die Schwierigkeit bei der Erfassung von histologischen Daten des intakten Gewebes Schnittstelle umliegenden chronisch implantierten Geräten 12. Die histologische Analyse des Gewebes mit dem Gerät / Gewebe-Grenzfläche noch vorhanden wäre auf die aktuellen Geräte-removal histologischen Protokolle verbessern. Vorrichtung mit einer ungestörten restlichen im Gewebe konnte die biologische Wirkung von relativ feinen Wechselwirkungen, wie zB die Verwendung von biokompatiblen Beschichtungen 13,14 oder dem elektrischen Löschen der Elektrodenoberfläche 15,16, abgebildet und analysiert werden in Bezug auf das Implantat. Here zeigen wir eine Methode, um zu sammeln, zu verarbeiten und Bild der intakten Kleinstgerätes Schnittstelle für detaillierte Mikroskopie-basierte Analyse des umgebenden Hirngewebes. In diesem Verfahren werden die Vorrichtung und umgebende Hirngewebe in einem dicken (&gt; 250 um) Gewebeschnitt mit einem Vibratom gesammelt. Etikett zur histologischen Eindringen in diesen dicken Scheiben zu verbessern, sind fluoreszierende histochemische und immunhistochemische Etiketten in hohen Konzentrationen in Lösungen enthaltend Blockierserum und Spülmittel für mehrere Tage aufgetragen. Optisches Clearinglösung eingesetzt wird, um Mikroskopie Tiefen zu verbessern, und das Gewebe wird im 2-seitigen Kammern für nachfolgende Laserscanning Konfokalmikroskopie 17 montiert. Um den vollen histologischen Schnittstelle zu erfassen, wird eine computergesteuerte translationale Stufe während der Bildgebung verwendet werden, um Z-Stapel Panoramen entlang der Länge der Implantate zu sammeln. Neben Bildgebung angewendet Gewebe Etiketten, Sammeln Laser Reflexion zurück von Implantatenund die Übertragung von Licht durch das Gewebe sowohl bei der Lokalisierung des Geräts Schnittstelle in Bezug auf das umliegende Gewebe. Tissue unter Verwendung dieses &quot;Device-Capture Histologie&quot; (DCHist Protocol) bietet Imaging Zugang zu den morphologisch konservierten Gewebe / Vorrichtungs-Interaktionen und damit eine Verbesserung gegenüber vorherigen Gerät-removal histologischen Protokolle 18.

<table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien </td></tr><tr><td> Hoechst 33342 </td><td> Invitrogen </td><td> 14533 </td><td> DNA-Marker </td></tr><tr><td> Rabbit anti-Iba1 </td><td> Wako (Japan) </td><td> 019-19741 </td><td> Monozyten-Antikörper </td></tr><tr><td> Dental Acryl </td><td> Lang Dental (verschiedene Distributoren) </td><td> Jet Gebiss-Reparatur Powder &amp; Liquid </td><td> Kopfhaube Bau </td></tr><tr><td> Kwik-Sil </td><td> World Precision Instruments </td><td> KWIK-SIL </td><td> Abdecken ausgesetzt kranialen Implantate </td></tr><tr><td> Normalem Ziegenserum </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 005-000-121 </td><td> Gewebe-Verarbeitung </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X100-500ml </td><td> Gewebe-Verarbeitung </td></tr><tr><td> Harnstoff </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> U4883 </td><td> Clearing-Lösung </td></tr><tr><td> Glycerol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G20225 </td><td> Clearing-Lösung </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Ausrüstung </td></tr><tr><td> Curved Mikro-Schere </td><td> World Precision Instruments </td><td> 14208 </td><td> Schneiden Implantat vor dem Entfernen des Gehirns </td></tr><tr><td> Rasierklingen </td><td> Ted Pella </td><td> (Verschiedene Größen) </td><td> Für den Einsatz mit Gehirn blockieren </td></tr><tr><td> Acryl Gehirn Matrice </td><td> Ted Pella </td><td> 15054 </td><td> Gehirn Block zu ersten Ebene im Gewebe zu schaffen </td></tr><tr><td> Plastic Dias </td><td> Ted Pella </td><td> 260225 </td><td> Montage Gewebe </td></tr><tr><td> Deckglas </td><td> Ted Pella </td><td> (Verschiedene Größen) </td><td> Montage Gewebe </td></tr><tr><td> Elektrodenanordnungen </td><td> NeuroNexus Technologies </td><td> (Verschiedene Ausführungen) </td><td> Beispiel MEAs </td></tr><tr><td> Vibratom </td><td> Leica </td><td> VT1000 S </td><td> Spezifische System vorgestellte Methode verwendet </td></tr><tr><td> Vibratom Klingen </td><td> (Versch. Anbieter) </td><td></td><td> Sammeln Scheiben </td></tr><tr><td> 24-Well-Platten </td><td> (Versch. Anbieter) </td><td></td><td> Speicherung und Verarbeitung von Gewebeschnitten </td></tr><tr><td> Konfokalen Mikroskop mit motorisierten XY-Scanningtisch </td><td> Carl Zeiss Mikroskopie </td><td> Zeiss LSM 710 und &#39;Zen 2010 &quot;-Software </td><td> Spezifische System vorgestellte Methode verwendet </td></tr><tr><td> Lötkolben </td><td> (Versch. Anbieter) </td><td></td><td> Excavating headcap </td></tr></tbody></table>

intact histological characterization of brain-implanted microdevices and surrounding tissue

Die Erforschung der Gestaltung und Nutzung des Gehirns implantiert Microdevices, wie Mikroelektroden-Arrays, soll klinisch relevanten Geräte, die chronisch-Schnittstelle mit dem umgebenden Hirngewebe zu produzieren. Gewebe um diese Implantate ist vermutlich auf die Anwesenheit der Geräte im Laufe der Zeit, welche die Bildung eines isolierenden &quot;glialen Narbe&quot; um die Geräte umfasst reagieren. Jedoch wird histologische Analyse dieser Gewebsveränderungen typischerweise nach Explantation das Gerät durchgeführt wird, in einem Prozess, der die Morphologie des Gewebes von Interesse stören können. Hier zeigen wir ein Protokoll, in dem kortikalen implantierten Geräten gesammelt intakt umgebenden Hirngewebe von Nagern sind. Wir beschreiben, einmal mit Fixiermittel perfundiert werden Gehirne entnommen und geschnitten in einer solchen Weise, dass Explantieren Geräten zu vermeiden. Wir skizzieren Fluoreszenz-Antikörper-Kennzeichnung und optische Clearing-Verfahren nützlich zur Herstellung eines informativen, aber dickes GewebeAbschnitt. Schließlich zeigen wir die Montage und Bildgebung dieser Gewebeschnitten, um die biologische Grenzfläche herum brain-implantierten Vorrichtungen zu untersuchen.

Gehirn-implantierten MEAs in Gewebeschnitten durch erste Abtrennen jeglicher Schädel-mounted-Komponenten aus den Gehirn-eingebetteten Komponenten gesammelt werden. 2a zeigt die Ergebnisse des Entfernens einer Seite eines Dentalzement Kopfbedeckungsgegenstand und einen Abschnitt des Kwik-Sil umgibt MEA Kabel an einer Ratte Schädel. Lötkolben wurde verwendet, um die zahnärztliche Zement und Kwik-Sil im Abzug zu entfernen. Die Verkabelung und jegliche nicht-implantierten MEA Strukturen wurden als nächstes mit Mikro-Schere durch langsames Aushub durch den Kwik-Sil bis auf die Oberfläche des festen Gehirn geschnitten. Nach Schneiden, Beschriften und Löschen Gewebe, sind einfache maßgeschneiderte Folien nützlich für die Montage der dicken Gewebeschnitt (Abbildung 2b). Ein bereitgestelltes Hirnschnittkultur enthaltend eine implantierte Mikrovorrichtung ist in 2c gezeigt. Imaging über beiden Seiten des Schlittens können Sie die Schnittstelle um ein Gerät zu beurteilen, wie in Abbildung 3 gezeigt, </strong&gt;, wobei entlang der Mikroglia Silicium Rückhalt einer MEA sichtbar sind von einer Seite (3a) und Mikroglia entlang Elektrodenstellen und Spuren sichtbar sind auf der anderen Seite (3b). Einmal montiert, kann Gewebe abgebildet mit einem XY-Übersetzung Bühne. Übersichten von Fluoreszenzmarkern über die gesamte Gewebeschnitte können mit der gewünschten Auflösung (Abbildung 4) erzeugt werden. Eine ausführliche Prüfung der morphologisch konservierten Gewebe-Grenzfläche rund implantiert Microdevices unter hoher Vergrößerung für die Analyse der lokalen Reaktion des Gewebes (Abbildung 5) gesammelt werden. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1.jpg" alt="Abbildung 1" fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig1highres.jpg"/> Abbildung 1. Übersicht zur Vorgehensweise. (Ac) Brain Mikroimplantat Operationen sind finasiert mit einer Schicht aus Kwik-Sil Polymer unmittelbar die Vorrichtung umgibt, gefolgt von einer Acrylzement Bedeckung. (D, e) Nach Euthanasie, wird der Acrylschicht entfernt, verbrannt und Schädel-mounted-Komponenten der Vorrichtung sind aus implantierten Komponenten durch Schneiden durch das Silikonelastomer getrennt. (F, g) Das Gehirn wird dann aus dem Schädel entfernt und geschnitten wird und an dem Vibratom Bühne. (Hk) Gewebeschnitte werden gesammelt, darunter ein Gewebeschnitt mit dem Gerät. (L) Tissue kann dann bearbeitet und montiert werden in benutzerdefinierten Kammern für detaillierte Mikroskopie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50126/50126fig1large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig2.jpg" alt="Abbildung 2"/> Abbildung 2. (A) Löschen Kwik-Sil Silikon-Elastomer surrounding eine Elektrode-Anordnungs-Kabel (Pfeil) durch Abbrennen eines Fensters in der Dentalzement Kappe auf einem perfundierten Nagetier Kopf mit einem Lötkolben ausgesetzt. (B) Zu Bildgebung in die beiden Seiten einer dicken Gewebeschnitt unterzubringen, einfach &quot;slide-Kammern&quot; kann durch Schneiden einer plastischen Folie und Ankleben Abdeckglases zu beiden Seiten um das Gewebe und Montage Lösung vorgenommen werden. (C) Eine Rattenhirn Gewebeschnitts mit intakten Implantat (Pfeil) wird nach der Montage gezeigt. Jede Seite des Gewebes ist schnell zugänglich Mikroskopie mit diesem Setup. Für Maßstab ist Panel (a) 25 mm über am Boden, während Paneele (b, c) 80 mm über am Boden sind. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig3highres.jpg"/> Abbildung 3. Maximale intichte z-Vorsprünge von 40 um dicke Bildstapeln, um die Rückseite (a) und (b) Stirnseite eines implantierten Mikroelektrodenfeldanordnung gesammelt. Mikroglia (markiert mit anti-Iba1 und Alexa Fluor 633, weiß) und Laserlicht Reflexionsgrad (rot), von der Oberfläche der Vorrichtung gesammelt wurden nacheinander von beiden Seiten einer 400 um dicken Gewebeschnitt abgebildet. Da die Gehirnimplantaten häufig opak sind, Montage mit optischen Zugang zu beiden Seiten sichert den Durchblick von markierten Gewebestrukturen &quot;hinter&quot; dem Implantat bezüglich des Mikroskopobjektivs. Maßstab 50 um. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig4.jpg" alt="Abbildung 4"/> Abbildung 4. Markiertes DCHist Slice abgebildet unter Verwendung eines Computer-gesteuerten Stufe auf einem Laser-Scanning-Konfokalmikroskop. (A) Die Zellkerne (gefärbt mit Hoechst 33342) und (b) Monozyten / Mikroglia(Beschriftet mit Anti-Iba1) wurden gleichzeitig auf getrennten Kanälen abgebildet. (C) Transmission Licht und Reflexion wurden ebenfalls gesammelt, zeigt den Standort der 4-Wochen Implantat mit Bezug auf Hoechst und Iba1 Daten. (D) Überlagerung aller Kanäle aber die Übertragung wird ebenfalls angezeigt. Das weiße Rechteck Bereich wird in den Bildern erscheinen rechts erweitert. Maßstab 1 mm. <img src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5.jpg" alt="Abbildung 5" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50126/50126fig5highres.jpg"/> Abbildung 5. Verwenden einer Computer-gesteuerten Mikroskoptisch und entsprechender Software kann panoramischen Bilddaten um das Implantat gesammelt werden. Reflexionsvermögen (a) und Durchlässigkeit (b) erlauben Lokalisierung des Geräts, während fluoreszierende Antikörper oder chemische Markierungen (c, Anti-Iba1 Etikettierung von Mikroglia und macrophages) ermöglichen detaillierte Bildgebung von Gewebe Komponenten entlang der intakten Gewebe-Schnittstelle. Maßstab 200 um.

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Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Hier präsentieren wir eine histologische Verfahren zur Erfassung, Kennzeichnung, optisch Löschen und Bildgebung des intakten Hirngewebe Schnittstelle um chronisch implantierten Microdevices im Hirngewebe von Nagern. Ergebnisse von den Techniken, die diese Methode sind nützlich für das Verständnis der Auswirkungen von verschiedenen durchdringenden Gehirn-Implantate auf ihre umliegende Gewebe.

Intact Histologische Charakterisierung von Brain-implantierten Microdevices und des umgebenden Gewebes

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

intact-histological-characterization-brain-implanted-microdevices

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.7K Aufrufe.  Purdue University. Hier präsentieren wir eine histologische Verfahren zur Erfassung, Kennzeichnung, optisch Löschen und Bildgebung des intakten Hirngewebe Schnittstelle um chronisch implantierten Microdevices im Hirngewebe von Nagern. Ergebnisse von den Techniken, die diese Methode sind nützlich für das Verständnis der Auswirkungen von verschiedenen durchdringenden Gehirn-Implantate auf ihre umliegende Gewebe.

Serie: Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Skalierbare Fluidic Injector Arrays für Viral Targeting von Intact 3-D Schaltkreise im Gehirn

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Forschung

Neurowissenschaften

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-Cell-Imaging von Sinnesorgan Vorläuferzellen im Intact Drosophila Puppen

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Electrophysiological Characterization of GFP-Expressing Cell Populations in the Intact Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack conspicuous morphological features or show a low population density. This applies particularly to retinal amacrine cells, an exceptionally multiform class of interneurons that comprise roughly 30 subtypes in mammals1. Though being a crucial part of the visual processing by shaping the retinal output2, most of these subtypes have not been studied up to now in a functional context because encountering these cells with a recording electrode is a rare event.
Recently, a multitude of transgenic mouse lines is available that express fluorescent markers like green fluorescent protein (GFP) under the control of promoters for membrane receptors or enzymes that are specific to only a subset of neurons in a given tissue3,4. These pre-labeled cells are therefore accessible to directed microelectrode targeting under microscopic control, permitting the systematic study of their physiological properties in situ. However, excitation of fluorescent markers is accompanied by the risk of phototoxicity for the living tissue. In the retina, this approach is additionally hampered by the problem that excitation light causes appropriate stimulation of the photoreceptors, thus inflicting photopigment bleaching and transferring the retinal circuits into a light-adapted condition. These drawbacks are overcome by using infrared excitation delivered by a mode-locked laser in short pulses of the femtosecond range. Two-photon excitation provides energy sufficient for fluorophore excitation and at the same time restricts the excitation to a small tissue volume minimizing the hazards of photodamage5. Also, it leaves the retina responsive to visual stimuli since infrared light (&gt;850 nm) is only poorly absorbed by photopigments6.
In this article we demonstrate the use of a transgenic mouse retina to attain electrophysiological in situ recordings from GFP-expressing cells that are visually targeted by two-photon excitation. The retina is prepared and maintained in darkness and can be subjected to optical stimuli which are projected through the condenser of the microscope (Figure 1). Patch-clamp recording of light responses can be combined with dye filling to reveal the morphology and to check for gap junction-mediated dye coupling to neighboring cells, so that the target cell can by studied on different experimental levels.

This article depicts the recording of individual cells from fluorescently tagged neuronal populations in the intact mouse retina. By using two-photon infrared excitation transgenetically labeled cells were targeted for patch-clamp recording to study their light responses, receptive field properties, and morphology.

Elektrophysiologische Charakterisierung von GFP-exprimierenden Zellpopulationen in der intakte Retina

Studying the physiological properties and synaptic connections of specific neurons in the intact tissue is a challenge for those cells that lack ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Elektrophysiologische Aufnahme im Gehirn von erwachsenen Zebrafisch Intact

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first neural circuit in the AOS pathway, called the accessory olfactory bulb (AOB), plays an important role in establishing sex-typical behaviors such as territorial aggression and mating. This small (&#60;1 mm3) circuit possesses the capacity to distinguish unique behavioral states, such as sex, strain, and stress from chemosensory cues in the secretions and excretions of conspecifics. While the compact organization of this system presents unique opportunities for recording from large portions of the circuit simultaneously, investigation of sensory processing in the AOB remains challenging, largely due to its experimentally disadvantageous location in the brain. Here, we demonstrate a multi-stage dissection that removes the intact AOB inside a single hemisphere of the anterior mouse skull, leaving connections to both the peripheral vomeronasal sensory neurons (VSNs) and local neuronal circuitry intact. The procedure exposes the AOB surface to direct visual inspection, facilitating electrophysiological and optical recordings from AOB circuit elements in the absence of anesthetics. Upon inserting a thin cannula into the vomeronasal organ (VNO), which houses the VSNs, one can directly expose the periphery to social odors and pheromones while recording downstream activity in the AOB. This procedure enables controlled inquiries into AOS information processing, which can shed light on mechanisms linking pheromone exposure to changes in behavior.

Ex Vivo Preparations of the Intact Vomeronasal Organ and Accessory Olfactory Bulb

The mouse accessory olfactory bulb (AOB) has been difficult to study in the context of sensory coding. Here, we demonstrate a dissection that produces an ex vivo preparation in which AOB neurons remain functionally connected to their peripheral inputs, facilitating research into information processing of mouse pheromones and kairomones.

Ex vivo Zubereitungen der Intact Vomeronasalorgan und akzessorischen olfaktorischen Bulbus

The mouse accessory olfactory system (AOS) is a specialized sensory pathway for detecting nonvolatile social odors, pheromones, and kairomones. The first ...

3D Modeling of the Lateral Ventricles and Histological Characterization of Periventricular Tissue in Humans and Mouse

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional units of the ventricles are ciliated epithelial cells termed ependymal cells, which line the ventricles and through ciliary action are capable of generating laminar flow of CSF at the ventricle surface. This monolayer of ependymal cells also provides barrier and filtration functions that promote exchange between brain interstitial fluids (ISF) and circulating CSF. Biochemical changes in the brain are thereby reflected in the composition of the CSF and destruction of the ependyma can disrupt the delicate balance of CSF and ISF exchange. In humans there is a strong correlation between lateral ventricle expansion and aging. Age-associated ventriculomegaly can occur even in the absence of dementia or obstruction of CSF flow. The exact cause and progression of ventriculomegaly is often unknown; however, enlarged ventricles can show regional and, often, extensive loss of ependymal cell coverage with ventricle surface astrogliosis and associated periventricular edema replacing the functional ependymal cell monolayer. Using MRI scans together with postmortem human brain tissue, we describe how to prepare, image and compile 3D renderings of lateral ventricle volumes, calculate lateral ventricle volumes, and characterize periventricular tissue through immunohistochemical analysis of en face lateral ventricle wall tissue preparations. Corresponding analyses of mouse brain tissue are also presented supporting the use of mouse models as a means to evaluate changes to the lateral ventricles and periventricular tissue found in human aging and disease. Together, these protocols allow investigations into the cause and effect of ventriculomegaly and highlight techniques to study ventricular system health and its important barrier and filtration functions within the brain.

Using MRI scans (human), 3D imaging software, and immunohistological analysis, we document changes to the brain&#8217;s lateral ventricles. Longitudinal 3D mapping of lateral ventricle volume changes and characterization of periventricular cellular changes that occur in the human brain due to aging or disease are then modeled in mice.

3D-Modellierung der Seitenventrikel und histologische Charakterisierung Periventrikuläre Tissue in Mensch und Maus

The ventricular system carries and circulates cerebral spinal fluid (CSF) and facilitates clearance of solutes and toxins from the brain. The functional ...

Exposure of the Pig CNS for Histological Analysis: A Manual for Decapitation, Skull Opening, and Brain Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to non-human primates. The large brain size of the pig allows the use of conventional clinical brain imagers and the direct use and testing of neurosurgical procedures and equipment from the human clinic. Further macroscopic and histological analysis, however, requires postmortem exposure of the pig central nervous system (CNS) and subsequent brain removal. This is not an easy task, as the pig CNS is encapsulated by a thick, bony skull and spinal column. The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and the pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

The goal of this paper and instructional video is to describe how to expose and remove the postmortem pig brain and pituitary gland in an intact state, suitable for subsequent macroscopic and histological analysis.

Belichtung des Schweins CNS für die histologische Analyse: Ein Handbuch für Enthauptung, Schädel öffnen und Gehirn Removal

Pigs have become increasingly popular in large-animal translational neuroscience research as an economically and ethically feasible substitute to ...

Electroencephalographic, Heart Rate, and Galvanic Skin Response Assessment for an Advertising Perception Study: Application to Antismoking Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these approaches often appear poorly accurate in scientific terms. Neuroscience is increasingly applied to the investigation of the neurophysiological bases of the perception of and reaction to commercial stimuli to support traditional marketing methods. In this context, a particular sector or marketing is represented by public service announcements (PSAs). The objective of this protocol is to apply electroencephalography (EEG) and autonomic signal analysis to study responses to selected antismoking PSAs. Two EEG indices were employed: the frontal alpha band EEG asymmetry (the Approach Withdrawal (AW) index) and the frontal theta (effort index). Furthermore, the autonomic Emotional Index (EI) was calculated, as derived from the Galvanic Skin Response (GSR) and Heart Rate (HR) signals. The present protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate, through the aforementioned indices, the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of antismoking PSAs. In particular, a campaign characterized by a symbolic communication style (classified as "awarded" on the basis of the prizes received by specialized committees) obtained the highest approach values, as estimated by the AW index. A spot and an image belonging to the same PSA campaign based on the "fear arousing appeal" and with a narrative/experiential communication style (classified as "effective" on the basis of the economical/health-related improvements promoted) reported the lowest and highest effort values, respectively. This is probably due to the complexity of the storytelling (spot) and to the immediateness of the image (a lady who underwent a tracheotomy). Finally, the same "effective" campaign showed the highest EI values, possibly because of the empathy induced by the testimonial and the explicitness of the message.

The following protocol describes a series of operational and computational steps required to properly estimate the emotional and cerebral reaction of a group of subjects towards a selected number of Public Service Announcements (PSAs) against smoking, aired in the USA and Europe during the period between 1998 and 2015.

EEG, Herzfrequenz und elektrodermale Bewertung für eine Werbung Wahrnehmung zu studieren: Anwendung auf Antirauch Public Service Announcements

The evaluation of advertising, products, and packaging is traditionally performed through methods based on self-reports and focus groups, but these ...

A Rat Model of Mild Intrauterine Hypoperfusion with Microcoil Stenosis

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies of this phenomenon have been performed in either models with severe intrauterine ischemia or models with gradient degree of intrauterine hypoperfusion. No study has been performed in a model on uniform mild intrauterine hypoperfusion (MIUH). Two models have been used for studies of MIUH: a model based on suture ligation of either side of the arterial arcade formed with the uterine and ovarian arteries, and a transient model based on clipping the bilateral ovarian arteries and aorta having patency. Those two rodent models of MIUH have some limitations, e.g., not all fetuses are subjected to MIUH, depending on their position in the uterine horn. In our MIUH model, all fetuses are subjected to a comparable level of intrauterine hypoperfusion. MIUH was achieved by mild stenosis of all four arteries feeding the uterus, i.e., the bilateral uterine and ovarian arteries.
Arterial stenosis was induced by metal microcoils wrapped around the feeding arteries. Producing arterial stenosis with microcoils allowed us to control, optimize, and reproduce decreased blood flow with very little inter-animal variability and a low mortality rate, thus enabling accurate evaluation. When microcoils with an inner diameter of 0.24 mm were used, the blood flow in both the placenta and fetus was mildly decreased (approximately 30% from the pre-stenosis level in the placenta). The offspring of our MIUH model clearly demonstrates long-lasting alterations in neurological, neuroanatomical and behavioral test results.

Mild intrauterine hypoperfusion was produced by artery stenosis with metal microcoils wrapped around the uterine and ovarian arteries in rats at embryonic day 17. This procedure produced prenatal hypoperfusion and intrauterine growth restriction.

Einem Rattenmodell der milden Intrauterine Hypoperfusion mit Microcoil Stenose

Intrauterine hypoperfusion/ischemia is one of the major causes of intrauterine/fetal growth restriction, preterm birth, and low birth weight. Most studies ...

Purification of Fibroblasts and Schwann Cells from Sensory and Motor Nerves in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and motor phenotypes involved in different patterns of neurotrophic factor gene expression and other biological processes, affecting nerve regeneration. The present study has established a protocol to obtain highly purified rat sensory and motor SCs and fibroblasts more rapidly. The ventral root (motor nerve) and the dorsal root (sensory nerve) of neonatal rats (7-days-old) were dissociated and the cells were cultured for 4-5 days, followed by isolation of sensory and motor fibroblasts and SCs by combining differential digestion and differential adherence methods sequentially. The results of immunocytochemistry and flow cytometry analyses showed that the purity of the sensory and motor SCs and fibroblasts were &#62;90%. This protocol can be used to obtain a large number of sensory and motor fibroblasts/SCs more rapidly, contributing to the exploration of sensory and motor nerve regeneration.

Here, we present a method to purify fibroblasts and Schwann cells from sensory and motor nerves in vitro.

Reinigung von Fibroblasten und Schwannzellen von sensorischen und motorischen Nerven in Vitro

The principal cells in the peripheral nervous system are the Schwann cells (SCs) and the fibroblasts. Both these cells distinctly express the sensory and ...