Dieses Protokoll ermöglicht die Abgabe von elektrischen Pulsfeldern durch flexible Elektronik, um ihre therapeutischen Wirkungen auf das Glioblastom zu untersuchen. Wir tun dies, indem wir die Tumormikroumgebung in vivo mit Bildgebung visualisieren. Die Bioelektronik integriert sich in dieses Protokoll mit verschiedenen Modellen zunehmender Komplexität, um die Wirkung pulsierender Felder auf Krebs zu untersuchen.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Mikrofabrikationstechniken können auch als Mittel zur Behandlung anderer Krebsarten, einschließlich patienteneigener Xenotransplantate, getestet werden. Dies bewegt sich in Richtung der Idee einer Präzisionsmedizin, die auf jeden einzelnen Patienten zugeschnitten ist. Diese Sonden werden mit Standard-Mikrofabrikationstechniken hergestellt, so dass die Herstellung unkompliziert ist und jeder mit einem Reinraum sie herstellen kann.
Für die Goldelektrodenstrukturierung wird eine drei Mikrometer dicke Schicht Parylene C mit einem Parylene-Abscheidungssystem abgeschieden, indem die sauberen Glasobjektträger in die Abscheidungskammer gelegt werden. Wiegen Sie sechs Gramm Parylene C in einem Aluminiumboot, legen Sie es in den Ofen, evakuieren Sie die Maschine und starten Sie die Abscheidung mit den im Manuskript beschriebenen Parametern. Wenn die Abscheidung beendet ist und die Temperatur des Verdampfers unter 40 Grad Celsius liegt, schalten Sie den Kühler, den Verdampfer und den Ofen aus.
Entlüften Sie die Maschine und sammeln Sie die Proben. Schleudern Sie die mit Plasma behandelten Proben 40 Sekunden lang mit einem negativen Fotolack bei 1.000 Mal G. Belichten Sie den Fotolack durch eine Maske, die das Design der interdigitalisierten Elektrode aufweist.
Tauchen Sie die Proben dann drei Minuten lang in einen metallionenfreien Entwickler, um den nicht belichteten Fotolack zu entfernen. Um eine 20-Nanometer-Adhäsionsschicht aus Chrom und eine 300-Nanometer-Schicht aus Gold mit einem thermischen Verdampfer abzuscheiden, entlüften Sie die Verdampfermaschine und befestigen Sie die Proben mit Metallschrauben an der oberen runden Platte. Füllen Sie die dafür vorgesehenen Tiegel jeweils mit Chrom und Gold.
Versiegeln und evakuieren Sie die Maschine und starten Sie die Drehung des Probenhalters. Wählen Sie den Tiegel mit Chrom und erhöhen Sie den Strom langsam, bis die Abscheidungsrate 0,2 Angström pro Sekunde erreicht. Öffnen Sie den Verschluss, warten Sie, bis 20 Nanometer Chrom abgelagert sind, schließen Sie den Verschluss und drosseln Sie den Strom langsam auf null Milliampere.
Wählen Sie den goldhaltigen Tiegel und erhöhen Sie den Strom langsam bis zu einer Abscheidungsrate von 0,2 Angström pro Sekunde. Öffnen Sie den Verschluss, um das Gold zu verdampfen, warten Sie bis zur Abscheidung von 10 Nanometern Gold und erhöhen Sie dann die Abscheidungsrate auf 1,5 Angström pro Sekunde, bis etwa 300 Nanometer abgelagert sind. Schließen Sie den Verschluss und senken Sie den Strom langsam auf null Milliampere.
Tauchen Sie die Proben in ein Becherglas mit Aceton. Spülen Sie dann die Proben mit Isopropanol ab und trocknen Sie sie mit einer Luftpistole. Beschichten Sie vier Schichten PEDOT:PSS-Lösung 35 Sekunden lang mit dem 150-fachen G.
Entfernen Sie die Opferschicht Parylene C, indem Sie die Proben in Wasser tauchen. Tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang in deionisiertes Wasser, um die verbleibende Seife und niedermolekulare Verbindungen in der PEDOT:PSS-Folie zu entfernen, und lösen Sie die Proben vom Glassubstrat. Geben Sie vorsichtig 75 Mikroliter geschmolzene 1%ige Agaroselösung in jede Vertiefung der 96-Well-Platte und lassen Sie sie 15 Minuten bei Raumtemperatur erstarren.
Trennen Sie die transduzierten Glioblastomzellen, die während der stabilen Zellliniengenerierung erhalten wurden. Fügen Sie 10.000 Glioblastomzellen pro Vertiefung hinzu und bilden Sie das Gesamtvolumen auf 150 Mikroliter pro Vertiefung mit DMEM, das ein Gramm pro Liter Glukose, L-Glutamin, Natriumpyruvat und Natriumbicarbonat, 10% fötales Rinderserum, 100 Einheiten pro Mikroliter Penicillin und 100 Mikrogramm pro Mikroliter Streptomycin enthält. Ersetzen Sie die Hälfte des Mediums bis zu weiteren Experimenten alle zwei Tage durch frisches Medium, während Sie die Pipettenspitze im oberen Teil der Vertiefung belassen, um eine Beschädigung der Agarose oder des Sphäroids selbst zu vermeiden.
Legen Sie die befruchteten Eier der japanischen Wachtel, Coturnix japonica, in einen Brutkasten auf Tabletts mit einem automatischen Rotator, der die Eier alle zwei Stunden wendet. Dieser Tag gilt als embryonaler Tag Null. Öffnen Sie die Eier am dritten Tag vorsichtig mit einer Pinzette mit dünnen Spitzen, die mit 70% Ethanol vorgewaschen sind.
Gießen Sie den Embryo in ein Plastikwaagen, bedecken Sie ihn mit einem anderen Wiegeboot und legen Sie ihn drei Tage lang bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Standardinkubator. Machen Sie am sechsten Tag des Embryos mit einer 23-Gauge-Nadel einen kleinen Einschnitt in die Chorioallantoismembran. Legen Sie ein Sieben-Tage-Sphäroid mit einer Pipette auf den Einschnitt und geben Sie den Embryo bis zu weiteren Experimenten drei Tage lang in den Inkubator zurück.
Geben Sie einen Tropfen DPBS, um die Kraniotomie zu bedecken. Legen Sie die flexible Elektrode auf den Tropfen des DPBS und legen Sie die Rückseite der Sonde vorsichtig mit den Kontaktpads auf den Rücken der Maus. Absorbieren Sie den DPBS-Tropfen mit einem kleinen Stück Papier, bis die Sonde flach auf der Dura liegen kann, und folgen Sie der Krümmung des Gehirns, um sicherzustellen, dass die kleine Kochsalzschicht unter den Elektroden verbleibt, um als Barriere gegen das Überlaufen von Klebstoff zu wirken.
Geben Sie einen kleinen Tropfen Silikonkleber auf die Sonde und decken Sie sie mit einem fünf Millimeter großen runden Deckglas ab. Drücken Sie das Deckglas nach unten, bis das Silikon gleichmäßig verteilt ist und der Abstand zwischen dem Deckglas und der Sonde minimal ist. Warten Sie dann 30 Sekunden, bis sich das Silikon verfestigt hat.
Um das Deckglas zu befestigen, tragen Sie schnell Sekundenkleber auf die Seiten auf und drücken Sie ihn nach unten, bis der Kleber fest wird. Tragen Sie Sekundenkleber mit einem Zahnstocher auf den Hals der Sonde auf und achten Sie darauf, dass der Sekundenkleber unter den Hals gezogen wird, um eine stabile Unterstützung zu gewährleisten. Decken Sie den Schädel mit Zahnzement ab, um eine chronische Kappe zu bilden, und achten Sie besonders darauf, nur die Ränder des Deckglases zu bedecken.
Heben Sie die Rückseite der Sonde an und tragen Sie Zement unter den Sondenhals auf. Rest der Sonde auf dem Zement, bevor er aushärtet. Drücken Sie den Hals der Sonde vorsichtig nach unten, um ihre Oberfläche während des Experiments auf gleicher Höhe mit dem Deckglas und nicht im Weg des Mikroskopobjektivs zu platzieren.
Decken Sie die Oberseite des Sondenhalses mit nicht mehr als 1,5 Millimetern Zahnzementschicht ab, um einen festen Halt auf der Sonde zu erreichen. Bauen Sie einen Zementbrunnen mit einem 1,5-Millimeter-Grat von ein bis zwei Millimetern um das Deckglas, um ein Becken für die Immersionsflüssigkeit für die Zwei-Photonen-Bildgebung zu schaffen. Verabreichen Sie nach dem Aushärten des Zements eine postoperative Analgesie und halten Sie das Tier bis zur Genesung warm, indem Sie es in ein Papiertuch wickeln und in die Nähe einer Infrarotlampe legen.
Die PEDOT:PSS-beschichteten Elektroden zeigen die typischen kapazitiven und resistiv dominierten Bereiche, die durch eine Grenzfrequenz getrennt sind, während die unbeschichteten Elektroden nur kapazitives Verhalten zeigen. Das mit einem Hellfeldmikroskop beobachtete Wachstum der Sphäroide zeigte, dass je nach Zelllinie und Anzahl der ausgesäten Zellen mindestens zwei oder drei Tage benötigt werden, um sphärische und dichte Sphäroide zu erhalten. Im In-ovo-Modell kann das Transplantat von Sphäroioiden in der Chorioallantoismembran durch Fluoreszenzmikroskopie beurteilt werden, da lebende Zellen intrazelluläres Kalzium aufweisen und die Vaskularisierung des Tumors durch Injektion eines Fluoreszenzfarbstoffs in die Blutgefäße beurteilt werden kann.
Verglichen mit der Impedanz in Kochsalzlösung wird in vivo eine Erhöhung der Impedanz bei Frequenzen über 100 Hertz aufgrund des Vorhandenseins einer biologischen Umgebung erwartet. Das vaskularisierte Neuralparenchym und die Tumorinfiltration können durch das transparente Substrat über Wochen hinweg durch Zwei-Photonen-Mikroskopie beobachtet und charakterisiert werden. Die Verwendung von transgenen Tieren, die fluoreszierende Proteine in interessierenden Zellen exprimieren, kann den minimalen Entzündungsprozess zeigen, der allein durch die Elektrodenimplantation induziert wird.
Es kann das Vorhandensein von Mikroglia und Monozyten 26 Tage nach der Implantation von gepulsten elektrischen Feldern stimulierender Elektrode zeigen. Sowohl periphere Monozyten als auch hirnresonante Mikrogliazellen wurden um und innerhalb des Tumors gefunden. Der entscheidende Punkt für den Erfolg des Implantatverfahrens besteht darin, die Abdichtung und die Ebenheit des Schädelfensters sicherzustellen und die Qualität des Kontakts mit der Sonde zu optimieren.
Zusätzlich zur intravitalen Bildgebung könnte es in Betracht gezogen werden, unser Protokoll mit anderen Maßnahmen und Techniken wie den Probenahmen und Messungen von Blutuntersuchungen auf Zytokine, dem Immunstatus durch Durchflusszytometrie oder sogar der Verhaltensanalyse zu kombinieren. Diese Arbeit ebnet den Weg für den Einsatz flexibler implantierbarer Geräte bei Krebs und eröffnet neue Perspektiven für den Einsatz der bioelektronischen Medizin bei dieser chronischen Krankheit.
