<p class="jove_content"&gt; Die Autoren Arbeit wurde durch Forschungsgelder ID-BOF 2006 von der Universität Antwerpen (PPO gewährten und AVDL), durch Forschungsförderung und G.0136.11 G.0130.11 (gewährten AVDL, ZB und PPO) und 1.5.021.09 unterstützt. N.00 (gewährten PPO) des Fonds für wissenschaftliche Forschung-Flandern (FWO-Vlaanderen, Belgien), SBO Forschungsstipendium IWT-60838: BrainStim der Flämischen Institut für Wissenschaft und Technologie (gewährten ZB und AVDL), in Teil von einem Methusalem Forschungsstipendium von der flämischen Regierung (gewährten ZB), zum Teil von EC-FP6-NoE DiMI (LSHB-CT-2005 bis 512146), EG-FP6-NoE Emil (LSHC-CT-2004-503569) , und von der Interamerikanischen Universität Attraktion Polen IUAP-NIMI-P6/38 (gewährten AVDL). Nathalie De Vocht promovierte-Stipendium von der FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts ist ein Post-Doktorand des FWO-Vlaanderen.</p

1. Zellpräparation <ol><li> Die Experimente sollten initiiert mit ex vivo kultivierten Stammzell-Populationen genetisch manipuliert, um die Luciferase und eGFP Reporter-Proteine ​​zu exprimieren. Wir verwenden hier Luciferase / eGFP-Expression murinen Knochenmark abgeleiteten Stromazellen (BMSC-Luc/eGFP), wie zuvor von Bergwerf et al. 2, 5 beschrieben. </li><li> Zwei Tage vor Zellmarkierung, Platte BMSC-Luc/eGFP Zellen bei einer Dichte von 8 x 10 5 Zellen pro T75 Kulturflasche in 15 ml komplett Expansion Medium (CEM) mit 1 ug / ml Puromycin ergänzt. </li><li> Willkommen Zellen für 48 Stunden bei 37 ° C und 5% CO 2. </li><li> Fügen Sie 5 x 10 6 gletscherblau Mikrometergröße Eisenoxid-Partikel (GB MPIO) pro ml Kulturmedium auf die wachsende Zellkultur (gesamt: 75 x 10 6 Teilchen pro 15 ml Kulturmedium in einer T75 Kulturflasche). </li><li> Inkubieren Sie für 16 Stunden, um Partikel Aufnahme über Endozytose ermöglichen. </li><li> Wegspülen verbleibenden Teilchenund ermöglichen Zellen für weitere 24 Stunden wachsen, um Zellkonfluenz und homogene Verteilung der GB MPIO zu erhalten. </li><li> Überprüfen Partikelaufnahme visuell unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie durch Zählen des Verhältnisses der eGFP + und D +-Zellen MPIO auf die Gesamtmenge der eGFP +-Zellen. </li><li> Wash GB MPIO-markierten BMSC-Luc/eGFP Zellen zweimal mit 10 ml PBS und Ernten der Zellen nach Trypsin-EDTA-Behandlung (5 ml pro T75 Kulturflasche für 5 Minuten). </li><li> Waschen Sie geernteten Zellen resuspendieren und bei einer Endkonzentration von 133 x 10 6 Zellen / ml in PBS. </li><li> Halten Zellen auf Eis bis zur Transplantation. </li></ol> 2. Zellimplantation im ZNS von Mäusen <ol><li> Anästhesiert Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von einer Ketamin (80 mg / kg) + Xylazin (16 mg / kg)-Mischung. </li><li> 5 Minuten warten, damit Mäuse, um einzuschlafen. </li><li> Rasieren Sie mit der Maus Kopf bis zur sterilen Manipulationen zu ermöglichen. </li><li> Platzieren Sie die Maus in einem stereotaktischen Rahmen. </li><li> Desinfizieren, dieHaut und nass die Augen der Mäuse zu Austrocknung zu verhindern. </li><li> Machen Sie eine Mittellinie Kopfhauteinschnitt, um den Schädel freizulegen, und bohren Sie ein Loch in den Schädel mit einem Dentalbohrers Grat an den angegebenen Koordinaten: 2 mm und 2 mm posterior lateral zum Bregma. </li><li> Vortex die Zellsuspension kurz und saugen Sie den Zell-Suspension in der Spritze. </li><li> Setzen Sie die Nadel der Spritze in einer Tiefe von 2,5 mm unter der Dura und erlauben Druckausgleich für 1 Minute. </li><li> Einspritzen, 3 ul Zellsuspension (4 × 10 5 Zellen) in einer Tiefe von 2 mm unter der Dura und mit einer Geschwindigkeit von 0,70 ml / min unter Verwendung eines automatisierten Mikro-Einspritzpumpe. </li><li> Warten für weitere 5 Minuten, um einen Rückfluss des eingespritzten Zellsuspension zu verhindern. </li><li> Langsam einfahren Nadel und desinfizieren die Haut Grenzen vor dem Vernähen der Haut. </li><li> Injizieren Sie 300 ul 0,9% NaCl-Lösung subkutan, um Austrocknung zu verhindern, und platzieren Sie die Maus unter einer Wärmelampe aus der Narkose zu erholen. Verwalten pOst-operative Analgetikum in Übereinstimmung mit institutionellen Normen. </li></ol> 3. In-vivo-Biolumineszenz <ol><li> Betäuben die Mäuse mit einem Gemisch aus 3% Isofluran und Sauerstoff. </li><li> Legen Sie die Mäuse in der Photon-Imager und Anästhesie verringern Niveau auf 1,5% Isofluran und Sauerstoff. </li><li> Inject 150 mg D-Luciferin pro kg Körpergewicht intravenös. </li><li> Erwerben Sie auf die Grafik für 5 Minuten mit dem Photo Vision Software. </li><li> Führen Bildverarbeitung mit dem M3vision Software. Quantifizierung des beobachteten Signals mit fester Regions of Interest. </li></ol> 4. In-vivo-Magnetic Resonance Imaging <ol><li> Betäuben die Mäuse mit 3% Isofluran in einem Gemisch aus O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Platzieren Sie die Mäuse in der Restrainer einer horizontalen 9,4 T MR-System zu verringern und Anästhesie auf 1% Isofluran in einem Gemisch aus O 2: N 2 O (3:7). </li><li> Befeuchten Sie die Augen der Mäuse, um Dehydratisierung zu verhinderntion, legen Sie eine rektale Sonde, um die Körpertemperatur überwachen und überwachen die Atmung, indem ein Sensor der Unterseite der Maus Bauch. </li><li> Pflegen Sie Atemfrequenz bei 110 ± 10 Atemzüge pro Minute und halten die Körpertemperatur konstant in einem engen Bereich von 37 ± 0,5 ° C. </li><li> Legen Sie die Oberfläche HF-Spule auf der Oberseite der Maus Kopf und positionieren Sie den Mauszeiger in der Mitte des Magneten. </li><li> Erwerben Sie einen Satz von 10 koronalen T2-gewichteten Spin-Echo (SE) Bilder an bestimmte anatomische Information und T2 *-gewichteten Gradientenecho (GE) Bilder zu erhalten, um Stammzell-Migration mit einer in-plane-Auflösung von 70 um 2 zu studieren. Set-Sequenz Parameter wie folgt: Repetitionszeit (TR): 500 ms, Echozeit (TE): 8 ms (GE-Sequenz) und Wiederholung (TR): 4200 ms, Echozeit (TE): 12,16 ms (SE-Sequenz); Field of View (FOV): 18x18 mm 2, Matrix: 256x256, 1 mm Schichtdicke und 1 mm Scheibe Trennung (Paravision 5.1-Software). </li><li> Führen DatenverarbeitungseinrichtungVerwendung von Amira 4.0-Software. </li></ol> 5. Post Mortem Histologie <ol><li> Betäuben die Mäuse tief durch Inhalation eines Isofluoran (4%), Sauerstoff (0,5 l / min) und Stickstoff (1 l / min)-Mischung für 2 Minuten. Opfere die Mäuse durch Genickbruch. </li><li> Entfernen Sie die Maus Gehirn aus dem Schädel und fixieren das Hirngewebe in 4% Paraformaldehyd in PBS für 2 Stunden. </li><li> Entwässern des Hirngewebes, indem das Gehirn anschließend in verschiedenen Gradienten von Saccharose: 2 Stunden lang in 5% Sucrose in PBS, 2 Stunden lang in 10% Saccharose in PBS über Nacht in 20% Saccharose in PBS. </li><li> Frieren Sie das Hirngewebe mit flüssigem Stickstoff und lagern Sie das Gewebe bei -80 ° C bis zum Schneiden. </li><li> Abschnitt das Hirngewebe in 10 mu m dicke Schnitte mit Hilfe eines Kryostaten. </li><li> Bildschirm ungefärbt Kryoschnitten für blaue Fluoreszenz aus den GB MPIO Partikel und grüne Fluoreszenz der eGFP exprimierenden Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li><li> Bildschirm ungefärbt Kryoschnitten fürgrün / rot Hintergrundfluoreszenz von Entzündungszellen. </li><li> Führen weitere immunhistochemische und Immunfluoreszenz-Färbungen auf endogenes Zellpopulationen (zB Mikroglia, Astrozyten, T-Zellen, ...), die mit zellulären Transplantate zu identifizieren. </li></ol> 6. Repräsentative Ergebnisse Wir hier visuell eine optimierte Abfolge von Ereignissen für eine erfolgreiche multimodale Bildgebung von Luciferase / EGFP-exprimierenden (Stamm-) Zellpopulationen im ZNS von Mäusen vorgestellt. Auf den ersten, mit dem beschriebenen GB MPIO Kennzeichnung Vorgehen führt zu hocheffizienten Kennzeichnung von BMSC-Luc/eGFP Zellen, die leicht überprüft werden können Fluoreszenz-Mikroskopie (Abbildung 2A). Als nächstes wird auf Pfropfung GB MPIO markierten BMSC-Luc/eGFP im ZNS von Mäusen, kann das Überleben des Transplantats durch zellulären in vivo BLI basierend auf Luciferase-Aktivität (2B) überwacht werden. Zusätzlich kann die exakte Lokalisierung der transplantierten Zellen durch in vivo beobachtet werden </em&gt; MRI auf der Eisengehalt der GB MPIO (Abbildung 2C) basiert. Schließlich erlaubt die histologische Analyse Validierung der Ergebnisse durch BLI und MRT erhalten. Stabile Überleben wurde durch eine stabile eGFP-Expression mit der Zeit (2D) bestätigt. Dafür Kolokalisation von eGFP-exprimierenden Zellen mit blau fluoreszierenden MPIO erlaubt die exakte Bestimmung der Lokalisation und das Überleben der transplantierten Zellen. Darüber hinaus reduziert diese doppelte Fluoreszenzmarkierung der Stammzellen die Möglichkeit zu falsch positiven Ergebnissen auf Hintergrundfluoreszenz durch Entzündungszellen 5 erstellten Basis zu beobachten. <img alt="Abbildung 1." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig1.jpg" /> 1. Übersicht der Bearbeitungsreihenfolge <ol class="lroman"><li> Zellmarkierung: BMSC-Luc/eGFP werden mit 5 x 10 6 GB MPIO Partikel pro ml Kulturmedium beschriftet. Nach 16 Stunden Inkubation und einem folgenden Ruhezeit von 24 Stunden werden die Zellen für geerntetintrazerebraler Implantation. </li><li> Zell-Implantation: GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP im Gehirn der Maus werden an den folgenden Koordinaten aufgepfropft: Bregma -2 mm, 2 mm rechts von der Mittellinie und 2 mm unter Dura. </li><li> In vivo BLI: Nach intravenöser Gabe von 150 mg D-luciferin/kg Körpergewicht wurde das erzeugte Licht während 5 Minuten mit dem Photon Imager erworben. </li><li> In-vivo-MRT: Ein Satz von 10 koronalen T2-gewichteten Spin-Echo (SE) Bilder und T2 *-gewichteten Gradientenecho (GE) Bilder mit einem in-plane-Auflösung von 70 um 2 erworben wurden. Sequence Parameter waren wie folgt: Repetitionszeit (TR): 500 ms, Echozeit (TE): 8 ms (GE-Sequenz) und Wiederholung (TR): 4200 ms, Echozeit (TE): 12,16 ms (SE-Sequenz); Field of View (FOV): 18x18 mm 2, Matrix: 256x256, 1 mm Schichtdicke und 1 mm Scheibe Trennung. </li><li> Post-mortem-Histologie: 10 um dicke Gefrier wurden für eGFP exprimierenden und blau fluoreszierend markierten BMSC u abgeschirmtsingen ein Fluoreszenzmikroskop. </li></ol><img alt="Abbildung 2." src="/files/ftp_upload/3906/3906fig2.jpg" /> Abbildung 2. Multimodale Bildgebung von Stammzell-Transplantate <ol class="ualpha"><li> Direkte Immunfluoreszenz-Mikroskopie von Glacial blau (GB) MPIO BMSC-Luc/eGFP beschriftet. </li><li> In vivo BLI von Mäusen mit 4x10 5 eingespritzt GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP Zellen in Woche 1 und Woche 2 nach der Implantation. Die statistische Analyse der erfassten Signale BLI in Woche 1 und Woche 2 nach der Implantation. Die Daten werden als durchschnittliche Anzahl der Photonen pro Sekunde pro Steradiant pro Quadratzentimeter (ph / s / sr / cm 2) von einem 5-Minuten-Zeitraum ausgedrückt + / - Standardfehler von einem festen region of interest in Mäusen zeigen eine klare BLI-Signal berechnet an der Injektionsstelle. </li><li> Koronare zweidimensionalen MRT GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP (linkes Bild: (i) T2-gewichteten Spin-Echo-Bild und (ii) T2 *-gewichteten Gradienten-Echo-Bild) und unmarkierter BMSC-Luc / eGFP (rechtes Bild: (iii) T2-gewichteten Spin-Echo-Bild und (vi) T2 *-gewichteten Gradienten-Echo-Bild) Transplantate im Gehirn der Maus. </li><li> Die histologische Analyse der GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP Implantate in Woche 2 nach der Implantation. (I) direkte Immunfluoreszenz-Analyse zur Lokalisation von eGFP-exprimierende und GB MPIO beschriftet BMSC-Luc/eGFP Transplantate. (Ii) Starke Vergrößerung anzeigen: (i). (Iii) Immunfluoreszenzfärbung für GFAP-Antigen, die die Entwicklung von Astrozyten Narbengewebe in der Umgebung der GB MPIO markierten BMSC-Luc/eGFP. (Vi) Immunfluoreszenzfärbung für Iba-1-Antigen, was anzeigt, die Invasion und Umgebung GB MPIO markierten BMSC-Luc/eGFP durch Mikroglia. </li></ol>

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Die Autoren erklären, in keinem Interessenkonflikt.

In diesem Bericht beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Kombination aus drei sich ergänzenden bildgebenden Verfahren (BLI, MRT und Histologie) für eine detaillierte Charakterisierung der zellulären Implantaten im ZNS von immunkompetenten Mäusen. Eine Kombination von Reportergen Markierung von Zellen, auf genetische Modifikation mit der Reportergene Luciferase und eGFP, und eine direkte Markierung von Zellen mit GB MPIO basiert, führt zu einer genauen Beurteilung der Stammzellläppchen in vivo....

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenzes </td><td> Firma </td><td> Katalog-Nummer </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Lonza </td><td> BE12-722F </td><td> Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM </td></tr><tr><td> Fötales Rinderserum </td><td> Gibco </td><td> 10270-106 </td><td> Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM </td></tr><tr><td> Pferdeserum </td><td> Gibco </td><td> 1605-122 </td><td> Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM </td></tr><tr><td> Penicillin-Streptomycin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td><td> Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM </td></tr><tr><td> Fungizone </td><td> Gibco </td><td> 15290-018 </td><td> Komponente der Zelle Wachstumsmedium CEM </td></tr><tr><td> PBS </td><td> Gibco </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Puromycin </td><td> Invivogen </td><td> ant-PR-1 </td><td></td></tr><tr><td> Trypsin </td&gt; <td> Gibco </td><td> 25300 </td><td></td></tr><tr><td> GB MPIO </td><td> Bangs Laboratories </td><td> ME04F/7833 </td><td></td></tr><tr><td> D-Luciferin </td><td> Promega </td><td> E1601 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin (Ketalar) </td><td> Pfizer </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Xylazin (Rompun) </td><td> Bayer Health Care </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Isofluran </td><td> Isoflo </td><td> 05260-05 </td><td></td></tr><tr><td> 0,9% NaCl-Lösung </td><td> Baxter </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd </td><td> Merck </td><td> 1.04005.1000 </td><td></td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> Applichem </td><td> A1125 </td><td></td></tr><tr><td> Micro-Einspritzpumpe </td><td> KD wissenschaftlichen </td><td> KDS100 </td><td></td></tr><tr><td> Photon-Imager </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr&gt; <td> 9,4 T MR-Scanner </td><td> Bruker Biospin </td><td> Biospec 94/20 USR </td><td></td></tr><tr><td> BX51 Mikroskop </td><td> Olymp </td><td> BX51 </td><td></td></tr><tr><td> Mycrom Kryostat HM </td><td> Prosan </td><td> HM525 </td><td></td></tr><tr><td> Spritze </td><td> Hamilton </td><td> 7635-01 </td><td></td></tr><tr><td> 30-Gauge-Nadel </td><td> Hamilton </td><td> 7762-03 </td><td></td></tr><tr><td> Photo Vision-Software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> M3vision Software </td><td> Biospace Lab </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Paravision 5.1-Software </td><td> Bruker Biospin </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Amira 4.0-Software </td><td> Visage Imaging </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal imaging of stem cell implantation in the central nervous system of mice

Während der letzten zehn Jahre hat Stammzelltransplantation zunehmendes Interesse als primäre oder sekundäre therapeutische Modalität für eine Vielzahl von Krankheiten, sowohl in vorklinischen und klinischen Studien gewonnen wurden. Bis heute wurde jedoch Ergebnisse in Bezug auf funktionelle Ergebnis und / oder Geweberegeneration folgenden Stammzelltransplantation sind sehr unterschiedlich. Im Allgemeinen wird eine klinische Nutzen ohne tiefes Verständnis der zugrunde liegende Mechanismus (n) 1 beobachtet. Deshalb haben mehrere Bemühungen um die Entwicklung der verschiedenen molekularen Bildgebungsverfahren führte zur Stammzell-Transplantation mit dem Ziel, richtig einschätzen zu Überleben, Schicksal und Physiologie der aufgepfropft Stammzellen und / oder deren Mikro-Umgebung zu überwachen. Änderungen in der einen oder mehrere Parameter bestimmt durch molekulare Bildgebung beobachtet könnte zu der beobachteten klinischen Effekt stehen. In diesem Zusammenhang unsere Studien über den kombinierten Einsatz von Biolumineszenz-Imaging (BLI), Kernspintomographie (MRT) und histologische analysi konzentrierens zu bewerten Stammzell-Transplantation. BLI wird allgemein nicht-invasiv durchgeführt Zellverfolgung und überwachen das Überleben der Zelle in der Zeit nach der Transplantation 2-7, basierend auf einer biochemischen Reaktion, bei der Zellen, die das Luciferase-Reportergen verwendet werden können, um Licht nach der Wechselwirkung mit seinem Substrat emittieren (z. B. D- Luciferin) 8, 9. MRI auf der anderen Seite ist eine nicht-invasive Technik, die klinisch anwendbare 10 ist und kann verwendet werden, um genau zu lokalisieren zelluläre Transplantate mit sehr hoher Auflösung von 11 bis 15 werden, obwohl seine Empfindlichkeit hängt stark von der Kontrast nach der Markierung von Zellen mit einem MRT-Kontrastmittel erzeugt . Schließlich ist post-mortem histologische Analyse die Methode der Wahl, um Forschungsergebnisse mit nicht-invasiven Techniken mit höchster Auflösung und Empfindlichkeit erhalten zu validieren. Außerdem Endpunkt histologische Analyse ermöglicht es uns, detaillierte phänotypische Analysen von transplantierten Zellen und / oder des umgebenden Gewebes, ba durchführenSED auf die Verwendung von fluoreszierenden Reporter-Proteine ​​und / oder direkte Markierung von Zellen mit spezifischen Antikörpern. Zusammenfassend haben wir hier visuell demonstrieren die Komplementarität von BLI, MRT und Histologie an verschiedenen Stammzell-und / oder Umwelt-assoziierten Merkmalen nach Stammzell-Transplantation in das ZNS von Mäusen zu entwirren. Als ein Beispiel, Knochenmark-abgeleiteten Stromazellen, gentechnisch verändert, um die verstärkte grün fluoreszierende Protein (EGFP) und Glühwürmchen-Luciferase (Fluc), und markiert mit blau-fluoreszierenden Mikrometergröße Eisenoxidteilchen (MPIOs) exprimieren, wird in der gepfropft werden ZNS von immunkompetenten Mäusen und das Ergebnis wird von BLI, MRT und Histologie (Abbildung 1) überwacht werden.

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Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Multimodale Bildgebung von Stem Cell Implantation in das zentrale Nervensystem der Mäuse

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

multimodal-imaging-stem-cell-implantation-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.0K Aufrufe.  University of Antwerp. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Abfolge der Ereignisse für multimodale Bildgebung von zellulären Transplantaten im Gehirn von Nagetieren mit: (i) In-vivo-Biolumineszenz-und Kernspintomographie, und (ii) post mortem histologische Analyse. Die Kombination dieser bildgebenden Verfahren auf einem einzigen Tier erlaubt zelluläre Transplantat Auswertung mit hoher Auflösung, Empfindlichkeit und Spezifität.

Serie: Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

Optic Nerve Transection: A Model of Adult Neuron Apoptosis in the Central Nervous System

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be accessed within the orbit of the eye and completely transected (axotomized), cutting the axons of the entire RGC population. Optic nerve 
transection is a reproducible model of apoptotic neuronal cell death in the adult CNS 1-4. This model is particularly attractive because the vitreous
 chamber of the eye acts as a capsule for drug delivery to the retina, permitting experimental manipulations via intraocular injections. The diffusion of chemicals 
through the vitreous fluid ensures that they act upon the entire RGC population. Moreover, RGCs can be selectively transfected by applying short interfering RNAs 
(siRNAs), plasmids, or viral vectors to the cut end of the optic nerve 5-7 or injecting vectors into their target, the superior colliculus 8. 
This allows researchers to study apoptotic mechanisms in the desired neuronal population without confounding effects on other bystander neurons or surrounding glia. 
An additional benefit is the ease and accuracy with which cell survival can be quantified after injury. The retina is a flat, layered tissue and RGCs are localized in 
the innermost layer, the ganglion cell layer. The survival of RGCs can be tracked over time by applying a fluorescent tracer (3% Fluorogold) to the cut end of the 
optic nerve at the time of axotomy, or by injecting the tracer into the superior colliculus (RGC target) one week prior to axotomy. The tracer is retrogradely transported, labeling 
the entire RGC population. Because the ganglion cell layer is a monolayer (one cell thick), RGC densities can be quantified in flat-mounted tissue, without the need 
for stereology. Optic nerve transection leads to the apoptotic death of 90% of injured RGCs within 14 days postaxotomy 9-11. RGC apoptosis has a 
characteristic time-course whereby cell death is delayed 3-4 days postaxotomy, after which the cells rapidly degenerate. This provides a time window for 
experimental manipulations directed against pathways involved in apoptosis.

Optic Nerve transection is a widely used model of adult CNS injury. Ninety percent of retinal ganglion cells (RGCs) whose axons are completely transected (axotomy) die within 14 days after axotomy. This model is easily amenable to experimental manipulations and highly reproducible.

Optic Nerve Durchtrennung: Ein Modell des Adult Neuron Apoptose in das zentrale Nervensystem

Retinal ganglion cells (RGCs) are CNS neurons that output visual information from the retina to the brain, via the optic nerve. 
The optic nerve can be ...

Forschung

Neurowissenschaften

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Die Produktion von lentiviralen Vektoren für die Transduktion von Zellen aus dem Zentralen Nervensystems

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Beschriften einzelner Zellen im zentralen Nervensystem<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Direkt Intraventrikuläre Abgabe von Arzneimitteln an die Nager Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In-vivo-Abfrage des Zentralen Nervensystems durch Translatome Polyribosom Fraktionierung

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenetische Stimulation des Nager Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ganglionated plexuses housed in the gut wall. Enteric neurons and enteric glia are the only cell types within the enteric ganglia. The activity of enteric neurons and glia is responsible for coordinating intestinal functions. This protocol describes methods for observing the activity of neurons and glia within the intact ENS by imaging intracellular calcium (Ca2+) transients with fluorescent indicator dyes. Our technical discussion focuses on methods for Ca2+ imaging in whole-mount preparations of the myenteric plexus from the rodent bowel. Bulk loading of ENS whole-mounts with a high-affinity Ca2+ indicator such as Fluo-4 permits measurements of Ca2+ responses in individual neurons or glial cells. These responses can be evoked repeatedly and reliably, which permits quantitative studies using pharmacological tools. Ca2+ responses in cells of the ENS are recorded using a fluorescence microscope equipped with a cooled charge-coupled device (CCD) camera. Fluorescence measurements obtained using Ca2+ imaging in whole-mount preparations offer a straightforward means of characterizing the mechanisms and potential functional consequences of Ca2+ responses in enteric neurons and glial cells.

In Situ Ca2+ Imaging of the Enteric Nervous System

The enteric nervous system (ENS) is a network of neurons and glia located in the gut wall that controls intestinal reflexes. This protocol describes methods for recording the activity of enteric neurons and glia in live preparations of ENS using Ca2+ imaging.

In Situ Ca 2+ Imaging des enterischen Nervensystems

Reflex behaviors of the intestine are controlled by the enteric nervous system (ENS). The ENS is an integrative network of neurons and glia in two ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Optische Clearing der Maus Zentralnervensystem Passive CLARITY Verwendung

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Elektrophysiologische Aufnahme der zentralen Nervensystems Tätigkeit der dritte Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...