Diese Studie wurde von der Edmond und Lily Safra Center for Neurowissenschaften (SB Gemeinschaft), The Legacy Heritage Biomedical Science Partnership Programm der Israel Science Foundation (Grant No 378/11, zu HS) und der Deutsch-Israelischen Stiftung für wissenschaftliche unterstützt Forschung und Entwicklung (GIF) (Grant No 1093-32.2/2010 zu HS).

1. Lentivirus Vorbereitung <ol><li> Wachsen HEK-Zellen 293FT bis 90% Konfluenz. </li><li> Am Tag der Transfektion Änderung Zellmedium serumfreiem DMEM, ergänzt mit 1 mM Glutamin und 50 mg / ml Penicillin-Streptomycin. </li><li> Co-Transfektion der Zellen mit einem pLKO.1-Puro Vektor und mit Plasmiden, die für das Delta-R8.2 und VSV-G-Reste und der miRNA von Interesse unter Verwendung von 10 ul 1 mg / ml Polyethylenimin als Träger 9. </li><li> Sammle verpackten Lentiviren bei 24 h und 48 h nach der Transfektion Filter durch 0,45 um-Filter. </li><li> Konzentrieren Sie sich die Lentiviren mit Ultrazentrifugation in 70.000 xg für 2 h und 15 ° C, und Aliquot bei -70 ° C. </li><li> Messen Virustiter durch Infizieren von HEK-293T-Zellen, die mit seriell verdünnten Virus Zubereitungen (1 bis 10 -6 ml Vektor pro Vertiefung). Die resultierende Titer (mindestens ~ 1 × 10 9 infektiöse Partikel pro ml wird empfohlen) ist für die Expression des ge ausgewertetne von Interesse, mit Puromycin-Selektion und Quantifizierung von GFP-exprimierenden Viren durch Zählen fluoreszierenden Zellen. </li></ol> Für weitere detaillierte Protokoll lentivirus Herstellung siehe 10. 2. Vorbereiten Tiere für Chirurgie <ol><li> Chirurgen Gewand sollte OP-Kittel, sterile Handschuhe, Mütze und Maske. </li><li> Wiegen Sie das Tier dann betäuben sie mit einem IP-Injektion eines Ketamin Mischung, wobei das Volumen proportional zu dem Tier Gewicht wie für jedes Arzneimittel angegeben. Für eine Ketamin / Xylazin Mischung wird ein Dosisbereich von 80-200 mg / kg Ketamin und 7-20 mg / kg Xylazin in der Regel für Mäuse verwendet. </li><li> Warten Sie, bis das Tier vollständig betäubt, dann aus Mangel an Rückzug Reflex im Hinterbein des Tieres überprüfen, indem sich das Bein und dann die Taste mit dem Finger. </li><li> Injizieren Sie das Tier subkutan mit Rimadyl, wie auf der Verpackung angegeben ist, zur Schmerzlinderung. Typische Dosisbereich für Rymadil ist 5-10 mg. </li><li> Legen Sie das Tier auf einem Heizkissen, um einen stetigen Körpertemperatur zu halten und befeuchten die Augen mit Salbe. </li><li> Shave den Bereich zwischen den beiden Ohren mit einer Fräsmaschine. </li><li> Desinfizieren Sie die Haut mit betadine. </li></ol> 3. Die Exposition der Schädel und Bohren <ol><li> Legen Sie das Tier innerhalb des stereotact indem die Stangen in die Spalten knapp vor dem Tier die Ohren. </li><li> Verwenden Sie ein Skalpell, um eine Vorwärts-Rückwärts-Schnitt von ca. 1,5 cm zwischen den Ohren machen und halten Sie es mit der Operation Klemmen (serfines) zu öffnen. </li><li> Reinigen Sie die Oberfläche des Schädels mit einem Wattestäbchen, bis der Schnittpunkt zwischen der Kranznaht und sagittalen Nähten, dh die Bregma und den Schnittpunkt zwischen den koronalen und lambdoiden Nähte, dh Lambda, sichtbar sind. </li><li> Richten Sie die Spitze der Spritze, durch die stereotact gehalten, der Bregma Punkt, an allen drei Achsen. Notieren Sie sich die Koordinaten. Dieser Punkt würde als Null-po berücksichtigt werdenint in allen drei Achsen. </li><li> Heben Sie die Spritze in der vertikalen Achse, so dass eine ebene Bewegung nicht kratzen würde den Schädel und bewegen Sie die Spritze Kopf an die richtige Stelle. Hippocampus CA1 Injektionen erfordern die folgenden Koordinaten relativ zum Bregma in mm: -2 an der vorderen / hinteren Achse, ± 1,8 bei der lateralen / medialen Achse bzw. -1,5 an der dorsal / ventral Achse. </li><li> Senken Sie die Spitze der Spritze, bis er den Schädel berührt und markieren Sie die Stelle mit einem Marker. Entfernen Sie die Spritze zurück, um zu vermeiden Stechen. </li><li> Bohren Sie ein flaches Loch, nur in den Schädelknochen mit einem feinen Bohrer. Halten Sie den Bohrer stetig, damit es nicht weiter in die weichen Gewebe unter bohren. Sie können dies durch Verstetigung einerseits mit dem anderen und durch Bohren in kurzen Impulsen zu verhindern. </li></ol> 4. Die Injektion des Lentivirus <ol><li> Ziehen Sie 0,5 ml der konzentrierten Lösung lentivirus. </li><li> Legen Sie die Spritze über dem Loch und langsam und senkrecht absenken, bis es reaches die Oberfläche des Schädels. Fahren Sie mit der Spritze in das Gehirn sehr langsam senken. Bei diesem Schritt einige Blutungen auftreten, die nicht unbedingt auf eine fehlgeschlagene Penetration. Kommt es zu Blutungen wischen Sie sie mit einem Wattestäbchen. </li><li> Stellen Sie den digitalen Pumpe bis 0,02 ml / min (0,5 ul würde in 25 min injiziert werden) und Infusion starten. Langsame Infusion ermöglicht eine effektive Ausbreitung des Virus in das Gewebe und verhindert Rückfluss. In einigen Spritze Arten betrachten Einsetzen der Spritze für eine zusätzliche Tiefe von 0,5 mm vor dem Rückzug zu den ursprünglichen Koordinaten und Infusion. </li><li> Nach Infusion beendet ist für zusätzliche 5 Minuten, um das Material in das Gehirn statt Rückzug zurück in den Kanal mit der Spritze ausgebildet verbreiten. </li><li> Entfernen Sie die Spritze sehr langsam und achten Sie zurück fließt. Wenn eine Rückströmung bei diesem Schritt festgestellt wird, wurde ein Teil des eingespritzten Materials wahrscheinlich verloren. </li></ol> 5. Wound Sealing and Recovery <ol><li> Seal the gewickelt mit Histoacryl. Achten Sie darauf, zu vermeiden undicht des Histoacryl in die Augen. </li><li> Injizieren Sie das Tier intraperitoneal (IP) mit 1 ml vorgewärmten Kochsalzlösung, um eine Dehydratation zu vermeiden. </li><li> Legen Sie das Tier in einem Käfig, der Erholung auf einem Heizkissen positioniert ist. Sehen Sie sich das Tier, während es für eine weitere Stunde erholt. </li></ol> Bei der Gewichtsabnahme, Appetitlosigkeit, Schwäche sollte / Unfähigkeit, Futter oder Wasser, moribund oder Infektion, Euthanasie des Tieres zu erhalten durchgeführt werden. Akzeptierte für Euthanasie von Nagetieren sind Barbiturate, Inhalations-Anästhetika, CO 2, CO, oder Kaliumchlorid in Verbindung mit Vollnarkose. Nach 4 bis 6 Wochen, beurteilen des Tieres Navigationsspeicher im Morris Water Maze beurteilt. Das wird in der Regel infizieren lentivirus meisten Zellen innerhalb der Injektion Sphäre. 6. Behavioral Assessment im Morris Water Maze <ol><li> Trainieren Sie die Tiere in der Morris Wasser-Labyrinth. Für genaue Ausbildung und Prüfung Protokoll sehen 11. Nach jedem Versuch, trocknen das Tier mit einem trockenen Tuch, ersetzen Sie ihn in seinem Käfig und erfrischen das Wasser in den Tank. </li><li> Testen Sie die Tiere im Morris Water Maze an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, 4 Versuche jeden Tag. Jeden Tag legen, das Tier in das Labyrinth in jeder der 4 Richtungen des Labyrinths (Nord, Süd, Ost und West) in einer sich verändernden, um z. B. einen Tag: Ost-West-Nord-Süd-, Tag zwei: West-Süd -Nord-Ost. Wischen Sie die Tiere nach jedem Versuch. </li><li> Während der Testläufe verfolgen das Tier mit einem Tracking-System wie Noldus Trackingsystem. </li><li> Nach der 12. Test-Studie, legen Sie das Tier in den Wassertank ohne die Plattform für eine Minute. Dies würde verwendet, um die Suchstrategie das Tier nimmt zu analysieren. </li><li> Analysieren Sie die Daten wie in 12 vorgeschlagen. </li></ol>

<ol>
	<li>Siegel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+screen+implicates+microRNA-138-dependent+regulation+of+the+depalmitoylation+enzyme+APT1+in+dendritic+spine+morphogenesis.">A functional screen implicates microRNA-138-dependent regulation of the depalmitoylation enzyme APT1 in dendritic spine morphogenesis.</a> Nature Cell Biology. 11, 705-716 (2009).</li><li>Jin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biochemical+and+genetic+interaction+between+the+fragile+X+mental+retardation+protein+and+the+microRNA+pathway.">Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway.</a> Nature Neuroscience. 7, 113-117 (2004).</li><li>Simon, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microRNA+miR-1+regulates+a+MEF-2-dependent+retrograde+signal+at+neuromuscular+junctions.">The microRNA miR-1 regulates a MEF-2-dependent retrograde signal at neuromuscular junctions.</a> Cell. 133, 903-915 (2008).</li><li>Consiglio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+gene+therapy+of+metachromatic+leukodystrophy+by+lentiviral+vectors:+correction+of+neuropathology+and+protection+against+learning+impairments+in+affected+mice.">In vivo gene therapy of metachromatic leukodystrophy by lentiviral vectors: correction of neuropathology and protection against learning impairments in affected mice.</a> Nature Medicine. 7, 310-316 (2001).</li><li>Jakobsson, J., Lundberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lentiviral+vectors+for+use+in+the+central+nervous+system.">Lentiviral vectors for use in the central nervous system.</a> Molecular Therapy: The Journal of the American Society of Gene Therapy. 13, 484-493 (2006).</li><li>Berson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic-associated+loss+of+hnRNP-A/B+in+Alzheimer's+disease+impairs+cortical+splicing+and+cognitive+function+in+mice.">Cholinergic-associated loss of hnRNP-A/B in Alzheimer's disease impairs cortical splicing and cognitive function in mice.</a> EMBO Molecular Medicine. , (2012).</li><li>Haramati, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+as+repressors+of+stress-induced+anxiety:+the+case+of+amygdalar+miR-34.">MicroRNA as repressors of stress-induced anxiety: the case of amygdalar miR-34.</a> The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31, 14191-14203 (2011).</li><li>Shaltiel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hippocampal+microRNA-132+mediates+stress-inducible+cognitive+deficits+through+its+acetylcholinesterase+target.">Hippocampal microRNA-132 mediates stress-inducible cognitive deficits through its acetylcholinesterase target.</a> Brain Structure &amp; Function. , 10-1007 (2012).</li><li>Boussif, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+vector+for+gene+and+oligonucleotide+transfer+into+cells+in+culture+and+in+vivo:+polyethylenimine.">A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo: polyethylenimine.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 7297-7301 (1995).</li><li>Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+HIV-+or+FIV-based+lentivector+expression+constructs+&amp;+transduction+of+VSV-G+pseudotyped+viral+particles.">Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs &amp; transduction of VSV-G pseudotyped viral particles.</a> J. Vis. Exp. (62), e3171 (2012).</li><li>Nunez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+Water+Maze+Experiment.">Morris Water Maze Experiment.</a> J. Vis. Exp. (19), e897 (2008).</li><li>Bromley-Brits, K., Deng, Y., Song, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morris+water+maze+test+for+learning+and+memory+deficits+in+Alzheimer's+disease+model+mice.">Morris water maze test for learning and memory deficits in Alzheimer's disease model mice.</a> J. Vis. Exp. (53), e2920 (2011).</li><li>Regev, L., Ezrielev, E., Gershon, E., Gil, S., Chen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+approach+for+intracerebroventricular+delivery.">Genetic approach for intracerebroventricular delivery.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 4424-4429 (2010).</li></ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen haben.

Stereotaktische Injektion eines Lentivirus ist ein relativ schnelles Verfahren zur in vivo Beurteilung sowohl Vorwärts-oder Rückwärts-Regulation verschiedener Gene und miRNA. Die wichtigste Alternative ist eine gentechnisch veränderte Maus, die ein viel mühsame und zeitaufwendige Technik dann direkt lentivirus Injektion ist. Darüber hinaus ist die Regelung bis in lentivirus Injektion, tritt zu einem bestimmten Zeitpunkt in der erwachsenen Maus und beinhaltet keine Möglichkeit Undichtigkeit während der E...

Die Rolle von miRNAs in bestimmten Funktion des Nervensystems wurde kürzlich von lentiviralen Injektion in mehreren Studien in Frage gestellt worden. MiRNAs gefunden werden entscheidend für die Aufrechterhaltung und Umformen Synapse Struktur 1, 2 und Synaptogenese Synapse Umbau und Wartung 3. Diese Studien deuten stark darauf hin, dass miRNAs tätig sind, über vielschichtigen regulatorische Effekte sowohl in der Gestaltung und bei der Aufrechterhaltung der Hauptausgang des Nervensystems, die kognitive Funktion. Stereotaktische Injektion von Lentivirus Teilchen in bestimmten Regionen im Gehirn von Nagetieren ermöglicht die Suche nach Änderungen in Synapse Morphologie und neuronaler Aktivität und wurde für die Herstellung der funktionelle Bedeutung überexprimierten Transkripte 4,5 verwendet. Direkte Infektion von Neuronen an wohldefinierten Hirnareale mit miRNA-exprimierenden Lentiviren kann in Studien des Alterns, Gehirn-Erkrankungen und Neurodegeneration beteiligt sein; Studium der miRNAs im Bereich der Verhaltens-Regulierung 6-8 sind in einer weit weniger fortgeschrittenen Stadium, und stereotaktische Injektion von miRNA-Expression lentivirus Teilchen durch Verhaltenstests gefolgt kann nützlich sein, für solche Zwecke. Eine wesentlich aufwendigere Verfahren zur Induktion über-oder unter-Ausdruck beinhaltet gentechnisch Knock-in-oder Knockout-Mäusen. Genetische Systeme können weiter für die bedingte und zeitliche Steuerung der Expression (zB Cre-Lox, Tet-Systeme) ermöglichen, aber diese bieten kaum die räumliche Spezifität der Injektion und es gibt fast immer eine gewisse Undichtigkeit. Auch müssen die technischen Verfahren nicht operiert und kann über Labors mit relativ guter Reproduzierbarkeit verwendet werden, jedoch sind sie langsamer und benötigen viel mehr personelle und finanzielle Ressourcen. Darüber hinaus ist die zeitliche Steuerung der Über-oder Unter-Expression in injizierten Mäusen ist weitaus genauer verglichen mit gentechnisch veränderten Mäusen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="748">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rodent weigh scale</td>
			<td>Burtons (UK)</td>
			<td>115-455</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24">heating pad</td>
			<td>FIRstTechnology</td>
			<td>DCT-25</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">trimming machine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51465</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">stereotact</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51730</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Scalpel and blades</td>
			<td>Kent scientific</td>
			<td>INS500348</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Harland syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>7632-01</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">driller</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>51449</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">digital pump</td>
			<td>Harvard apparatus</td>
			<td>704507</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Water tank and platform</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td>60135</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="682">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">ketamine </td>
			<td>Vetoquinol(Lure France)</td>
			<td>3055503</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">domitor</td>
			<td>Orion pharma</td>
			<td>107140-10</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">Rimadyl</td>
			<td>Pfizer animal health</td>
			<td>24751</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="118">
			<td height="138" rowspan="2">moisture ointment - Synthomycine 5%</td>
			<td rowspan="2">Rekah Pharmaceutical</td>
			<td rowspan="2">195</td>
			<td rowspan="2"> </td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">histoacryl</td>
			<td>Braun</td>
			<td>112101</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21">saline</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D8662</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

stereotactic injection of microrna-expressing lentiviruses to the mouse hippocampus ca1 region and assessment of the behavioral outcome

MicroRNAs (miRNAs) sind kleine regulatorische einzigen RNA-Moleküle etwa 22 Nukleotide lange, die kann jeder Ziel-mRNA-Transkripte und zahlreiche dim eine ganze Genexpression Weg durch Induktion Zerstörung und / oder Hemmung der Translation dieser Ziele. Mehrere miRNAs eine wichtige Rolle spielen bei der Aufrechterhaltung neuronaler Struktur und Funktion und in höheren Funktionen des Gehirns, und Methoden zur Manipulation ihrer Ebenen für die Erkundung dieser Funktionen gesucht. Hier präsentieren wir einen direkten in vivo-Verfahren zur Untersuchung der kognitiven Folgen der erzwungenen miRNAs Überschuss in Mäusen durch stereotaktische Injektion von miRNA-encoding Viruspartikel. Konkret beinhaltet das aktuelle Protokoll Injektion in den Hippocampus CA1-Region, die Säugetier-Speicher-Konsolidierung, Lernen und Stress-Reaktionen beiträgt und bietet eine bequeme Injektionsstelle. Die Koordinaten werden gemäß der Maus bregma und Viren Perfusion digital gesteuert und gehalten sehr langsam gemessen.Nach der Injektion wird die Operation Wunde verschlossen und die Tiere erholen. Lentiviren kodiert Schalldämpfer der entsprechenden mRNA Ziele dienen, um die spezifische miRNA / Target-Wechselwirkung verantwortlich für den beobachteten Effekt implizieren, mit naiven Mäuse, Mäuse mit Kochsalzlösung und Mäuse mit &quot;leeren&quot; Lentivirusvektoren als Kontrollen injiziert. Einen Monat nach der Injektion werden die Tiere in der Morris Water Maze (MWM) zur Beurteilung ihrer Navigation Lernen und Gedächtnis Fähigkeiten untersucht. Die MWM ist ein runder Behälter mit gefärbtem Wasser mit einer kleinen Plattform 1 cm unter der Wasseroberfläche untergetaucht gefüllt. Stetige visuelle Hinweise um den Tank für die räumliche Navigation (Ton und der Erde das Magnetfeld kann auch helfen, die Tiere in der Navigation) erlauben. Videokamera-Überwachung ermöglicht die Messung der Strecke von Bad und die Zeit zu finden und betragen die Plattform. Die Maus wird zuerst gelehrt, dass die versteckte Montage-Plattform bietet einen Ausweg aus der erzwungenen Schwimmen, es wird dann für die Verwendung dieser Flucht-und f getestetndlich ist die Plattform entfernt und Sonde Tests prüfen, ob die Maus erinnert sich an seine früheren Standort. Wiederholte Tests über mehrere Tage hintereinander markieren verbesserte Leistung der getesteten Mäuse in kürzeren Latenzzeiten zu finden und montieren Sie die Plattform, und da immer mehr direkte Wege, um die Plattform oder seine Position zu erreichen. Bei Nichterscheinen solche Verbesserung stellt beeinträchtigt Lernen und Gedächtnis und / oder Angst, die dann geprüft werden kann speziell (zB im erhöhten Plus-Labyrinth). Dieser Ansatz ermöglicht die Validierung von spezifischen miRNAs und Ziel-Transkripte in der untersuchten kognitiven und / oder Stress-Prozesse.

Die Injektion von 0,5 ul Lentivirus in der CA1-Region des Hippocampus der Maus, mit der Strömungsgeschwindigkeit beim Protokoll angegeben ergibt einen infizierten Bereich von etwa 1 mm im rostralen-kaudalen Achse und etwa 0,5 mm in der medial-lateralen und vorderen -posterioren Achsen (Abbildung 3). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/50170/50170fig1.jpg" /> Abbildung 1. Bregma Punkt und Einspritzvorrichtung. (A)<...

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Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung dienen<em&gt; In vivo</em&gt; Auswirkungen der überexprimierten miRNAs in spezifischen Hirnregionen.

Stereotaktische Injektion von microRNA-exprimierenden Lentiviren der Maus Hippocampus CA1 Region und Beurteilung der Behavioral Outcome

MicroRNAs (miRNAs) are small regulatory single-stranded RNA molecules around 22 nucleotides long that may each target numerous mRNA transcripts and dim an ...

stereotactic-injection-microrna-expressing-lentiviruses-to-mouse

Research

JoVE Journal

Behavior

22.6K Aufrufe.  The Hebrew University of Jerusalem. MicroRNAs haben eine bedeutende Rolle in der Struktur des Gehirns und Funktion. Hier beschreiben wir eine Methode, um durchzusetzen Hippocampus miRNA-Überexpression mit stereotaktische Injektion eines gentechnisch miRNA-Expression lentivirus. Dieser Ansatz kann als eine relativ schnelle Weg zu der Beurteilung dienen In vivo Auswirkungen der überexprimierten miRNAs in spezifischen Hirnregionen.

Serie: Stereotactic Injection of MicroRNA-expressing Lentiviruses to the Mouse Hippocampus CA1 Region and Assessment of the Behavioral Outcome

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of chronic CNS disorders, there is an increasing demand for murine models with high validity at the behavioral level. However, multiple pathogenic mechanisms and complex functional deficits often impose challenges to reliably measure and interpret behavior of chronically sick mice. Therefore, the assessment of peripheral pathology and a behavioral profile at several time points using a battery of tests are required. Video-tracking, behavioral spectroscopy, and remote acquisition of physiological measures are emerging technologies that allow for comprehensive, accurate, and unbiased behavioral analysis in a home-base-like setting. This report describes a refined phenotyping protocol, which includes a custom-made monitoring apparatus (Integrated Behavioral Station, INBEST) that focuses on prolonged measurements of basic functional outputs, such as spontaneous activity, food/water intake and motivated behavior in a relatively stress-free environment. Technical and conceptual improvements in INBEST design may further promote reproducibility and standardization of behavioral studies.

Behavioral Phenotyping of Murine Disease Models with the Integrated Behavioral Station INBEST

Prolonged and comprehensive monitoring of mice in a home-cage environment provides a deeper understanding of aberrant behavior in murine models of brain diseases. This paper describes the Integrated Behavioral Station (INBEST) as the key component of contemporary behavioral analysis.

Behavioral Phänotypisierung von murinen Krankheitsmodelle mit dem Integrated Behavioral Station (INBEST)

Due to rapid advances in genetic engineering, small rodents have become the preferred subjects in many disciplines of biomedical research. In studies of ...

Forschung

Verhalten

Behavioral Assessment of the Aging Mouse Vestibular System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of studies show changes in balance phenotype with age in rodents, very few isolate the vestibular contribution to balance under either normal conditions or during senescence. We use two standard behavioral tests to characterize the balance performance of mice at defined age points over the lifespan: the rotarod test and the inclined balance beam test. Importantly though, a custom built rotator is also used to stimulate the vestibular system of mice (without inducing overt signs of motion sickness). These two tests have been used to show that changes in vestibular mediated-balance performance are present over the murine lifespan. Preliminary results show that both the rotarod test and the modified balance beam test can be used to identify changes in balance performance during aging as an alternative to more difficult and invasive techniques such as vestibulo-ocular (VOR) measurements.

Motor control and balance performance are known to deteriorate with age. This paper presents a number of standard noninvasive behavioral tests with the addition of a simple rotary stimulus to challenge the vestibular system and show changes in balance performance in a murine model of aging.

Behavioral Beurteilung der Alterungs Maus vestibuläre System

Age related decline in balance performance is associated with deteriorating muscle strength, motor coordination and vestibular function. While a number of ...

Comprehensive Analysis of Transcription Dynamics from Brain Samples Following Behavioral Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific genes in encoding experience is one of the main objectives of molecular neuroscience. Furthermore, the functional association of defined genes with specific behaviors has implications for understanding the basis of neuropsychiatric disorders. Induction of robust transcription programs has been observed in the brains of mice following various behavioral manipulations. While some genetic elements are utilized recurrently following different behavioral manipulations and in different brain nuclei, transcriptional programs are overall unique to the inducing stimuli and the structure in which they are studied1,2.
In this publication, a protocol is described for robust and comprehensive transcriptional profiling from brain nuclei of mice in response to behavioral manipulation. The protocol is demonstrated in the context of analysis of gene expression dynamics in the nucleus accumbens following acute cocaine experience. Subsequent to a defined in vivo experience, the target neural tissue is dissected; followed by RNA purification, reverse transcription and utilization of microfluidic arrays for comprehensive qPCR analysis of multiple target genes. This protocol is geared towards comprehensive analysis (addressing 50-500 genes) of limiting quantities of starting material, such as small brain samples or even single cells.
The protocol is most advantageous for parallel analysis of multiple samples (e.g. single cells, dynamic analysis following pharmaceutical, viral or behavioral perturbations). However, the protocol could also serve for the characterization and quality assurance of samples prior to whole-genome studies by microarrays or RNAseq, as well as validation of data obtained from whole-genome studies.

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Umfassende Analyse der Transkription von Gehirnproben Dynamics folgenden Verhaltens Experience

The encoding of experiences in the brain and the consolidation of long-term memories depend on gene transcription. Identifying the function of specific ...

Experimental Assessment of Mouse Sociability Using an Automated Image Processing Approach

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the test mouse is placed in a standardized apparatus and relevant behaviors are assessed in three different sessions (called session I, II, and III).
The apparatus has three compartments (see Figure 1), the left and right compartments contain an inverted cup which can house a mouse (called &#34;stimulus mouse&#34;).
In session I, the test mouse is placed in the cage and its mobility is characterized by the number of transitions made between compartments. In session II, a stimulus mouse is placed under one of the inverted cups and the sociability of the test mouse is quantified by the amounts of time it spends near the cup containing the enclosed stimulus mouse vs. the empty inverted cup. In session III, the inverted cups are removed and both mice interact freely. The sociability of the test mouse in session III is quantified by the number of social approaches it makes toward the stimulus mouse and by the number of times it avoids a social approach by the stimulus mouse.
The automated evaluation of the movie detects the nose of the test mouse, which allows the determination of all described sociability measures in session I and II (in session III, approaches are identified automatically but classified manually). To find the nose, the image of an empty cage is digitally subtracted from each frame of the movie and the resulting image is binarized to identify the mouse pixels. The mouse tail is automatically removed and the two most distant points of the remaining mouse are determined; these are close to nose and base of tail. By analyzing the motion of the mouse and using continuity arguments, the nose is identified.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52508/52508fig1.jpg" /> 
Figure 1. Assessment of Sociability During 3 sessions. Session I (top): Acclimation of test mouse to the cage. Session II (middle): Test mouse moving freely in the cage while the stimulus mouse is enclosed in an inverted cup. Session III (bottom): Both test mouse and stimulus mouse are allowed to move freely and interact with each other.

This protocol describes a method to quantify mouse sociability. Mice are videotaped as they move and interact in a special cage. Movie processing allows for the automated quantification of sociability with excellent accuracy and reliability.

Experimentelle Bewertung der Maus Sociability einer automatisierten Bildverarbeitung Ansatz

Mouse is the preferred model organism for testing drugs designed to increase sociability. We present a method to quantify mouse sociability in which the ...

Applying Stereotactic Injection Technique to Study Genetic Effects on Animal Behaviors

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or knockdown gene expression in a relatively focused region without significant damage to the brain tissue. After recovery, the injected mouse can be tested on various behavioral tasks such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST). The OFT is designed to assess locomotion and the anxious phenotype in mice by measuring the amount of time that a mouse spends in the center of a novel open field. A more anxious mouse will spend significantly less time in the center of the novel field compared to controls. The FST assesses the anti-depressive phenotype by quantifying the amount of time that mice spend immobile when placed into a bucket of water. A mouse with an anti-depressive phenotype will spend significantly less time immobile compared to control animals. The goal of this protocol is to use the stereotactic injection of a lentivirus in conjunction with behavioral tests to assess how genetic factors modulate animal behaviors.

Stereotactic injection of lentiviruses expressing cDNAs or shRNAs can modulate gene expression in specific brain areas of mice. Here, we present a protocol to combine stereotactic injections with behavioral tasks, such as the Open Field Test (OFT) and the Forced Swim Test (FST).

Anwenden Stereotaktische Injektionstechnik zu genetischen Auswirkungen auf die Tier Behaviors Studie

Stereotactic injection is a useful technique to deliver high titer lentiviruses to targeted brain areas in mice. Lentiviruses can either overexpress or ...

Vagus Nerve Stimulation as a Tool to Induce Plasticity in Pathways Relevant for Extinction Learning

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been maintaining the behavior. There is close correspondence between fear and human anxiety, and therefore studies of extinction learning might provide insight into the biological nature of anxiety-related disorders such as post-traumatic stress disorder, and they might help to develop strategies to treat them. Preclinical research aims to aid extinction learning and to induce targeted plasticity in extinction circuits to consolidate the newly formed memory. Vagus nerve stimulation (VNS) is a powerful approach that provides tight temporal and circuit-specific release of neurotransmitters, resulting in modulation of neuronal networks engaged in an ongoing task. VNS enhances memory consolidation in both rats and humans, and pairing VNS with exposure to conditioned cues enhances the consolidation of extinction learning in rats. Here, we provide a detailed protocol for the preparation of custom-made parts and the surgical procedures required for VNS in rats. Using this protocol we show how VNS can facilitate the extinction of conditioned fear responses in an auditory fear conditioning task. In addition, we provide evidence that VNS modulates synaptic plasticity in the pathway between the infralimbic (IL) medial prefrontal cortex and the basolateral complex of the amygdala (BLA), which is involved in the expression and modulation of extinction memory.

Vagus nerve stimulation (VNS) has emerged as a tool to induce targeted synaptic plasticity in the forebrain to modify a range of behaviors. This protocol describes how to implement VNS to facilitate the consolidation of fear extinction memory.

Vagusnervstimulation als Instrument zur Plastizität in Pathways Relevant für Extinction Learning herbei

Extinction describes the process of attenuating behavioral responses to neutral stimuli when they no longer provide the reinforcement that has been ...

Behavioral Assessment of Hearing in 2 to 4 Year-old Children: A Two-interval, Observer-based Procedure Using Conditioned Play-based Responses

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human auditory development for these age groups. This paper describes an observer-based procedure for measuring hearing sensitivity with a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm. Young children are trained to perform a play-based, motor response (e.g., putting a block in a bucket) whenever they hear a target signal. An experimenter observes the child&#39;s behavior and makes a judgment about whether the signal was presented during the first or second observation interval; the experimenter is blinded to the true signal interval, so this judgment is based solely on the child&#39;s behavior. These procedures were used to test 2 to 4 year-olds (n = 33) with no known hearing problems. The signal was a 1,000 Hz warble tone presented in quiet, and the signal level was adjusted to estimate a threshold corresponding to 71%-correct detection. A valid threshold was obtained for 82% of children. These results indicate that the two-interval procedure is both feasible and reliable for use with toddlers and preschoolers. The two-interval, observer-based procedure described in this paper is a powerful tool for evaluating hearing in young children because it guards against response bias on the part of the experimenter.

This paper describes a procedure for measuring hearing sensitivity in 2 to 4 year-old children. Children are trained to perform play-based responses when they hear a target signal. Thresholds are then estimated in a two-interval, two-alternative forced-choice paradigm, based on observations of the child&#39;s behaviors.

Behavioral Beurteilung der in 2 bis 4-jährigen Kindern zu hören: Ein Zwei-Intervall, Beobachter-basierte Vorgehensweise Über konditionierten Wiedergabe-basierte Antworten

Collecting reliable behavioral data from toddlers and preschoolers is challenging. As a result, there are significant gaps in our understanding of human ...

A Behavioral Test Battery for the Repeated Assessment of Motor Skills, Mood, and Cognition in Mice

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and dysfunctions in mood and cognition are common and often shared symptoms in neurodegenerative diseases. Shown here is a behavioral test battery for motor, mood, and cognition, which can be repeatedly tested in a longitudinal study. This battery assesses the overall behavioral phenotype in mice by examining each domain of behavior with at least two independent well-accepted tests (i.e., open-field test and rotarod test for motor function, social interaction test, elevated plus maze test, and forced swim test for emotional function, and Morris water maze test and novel object recognition test for cognitive function). Therefore, this sensitive and comprehensive test battery is a powerful tool for the study of behavioral alternation in neurodegeneration.

A comprehensive behavioral test battery of motor skills, mood&#8212;including social interaction, depression, and anxiety&#8212;and cognition is designed for the repeated assessment of neurodegeneration-related behavioral changes in mice.

Eine Verhaltenstherapie Testbatterie für die wiederholte Beurteilung der Motorik, Stimmung und Kognition bei Mäusen

Pharmacological and toxicological studies in neurodegeneration require comprehensive behavioral analysis in mice because motor dysfunctions and ...

Utilizing a Reconfigurable Maze System to Enhance the Reproducibility of Spatial Navigation Tests in Rodents

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze shape, thus requiring several separate mazes in different configurations. The maze geometry cannot be reconfigured in a single environment to accommodate scalability and reproducibility. The reconfigurable maze is a unique approach to address the limitations, allowing quick and flexible configurations of maze pathways in a repeatable manner. It consists of interlocking pathways and includes feeders, treadmills, movable walls, and shut-off sensors. The current protocol describes how the reconfigurable maze can replicate existing mazes, including the T-shaped, plus-shaped, W-shaped, and figure-eight mazes. Initially, the T-shaped maze was constructed inside a single experimental room, followed by modifications. The rapid and scalable protocol outlined herein demonstrates the flexibility of the reconfigurable maze, achieved through the addition of components and behavioral training phases in a stepwise manner. The reconfigurable maze systematically and precisely assesses the performance of multiple aspects of spatial navigation behavior.

The present protocol describes a reconfigurable maze, a unique system for testing spatial navigation and behavioral phenotypes in rodents. The adaptability of this maze system enables the execution of various experiments in a single physical environment. The ease of structural rearrangement generates reliable and reproducible experimental results.

Verwendung eines rekonfigurierbaren Labyrinthsystems zur Verbesserung der Reproduzierbarkeit von räumlichen Navigationstests bei Nagetieren

Several maze shapes are used to test spatial navigation performance and behavioral phenotypes. Traditionally, each experiment requires a unique maze ...

Validierung eines Mausmodells des Angelman-Syndroms mit Hilfe von Verhaltenstests

Behavioral Characterization of an Angelman Syndrome Mouse Model

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of AS. We use the rotarod learning paradigm, detailed gait analysis, and nest building test to detect and characterize animal motor impairments. We test animal emotionality in the open field and elevated plus maze tests, as well as the affect in the tail suspension test. When AS mice are tested in the open field test, the results should be interpreted with care, since motor dysfunctions influence mouse behavior in the maze and alter activity scores.
The reproducibility and effectiveness of the presented behavioral tests has already been validated in several independent Uba3a mouse lines with different knockout variants, establishing this set of tests as an excellent validation tool in AS research. Models with the relevant construct and face validity will warrant further investigations to elucidate the pathophysiology of the disease and grant the development of causal treatments.

Autor im Rampenlicht: Eine Reihe von hochgradig reproduzierbaren Verhaltenstests zur Validierung eines Mausmodells mit Angelman-Syndrom 

This manuscript presents a set of highly reproducible behavioral tests to validate an Angelman syndrome mouse model.

Verhaltenscharakterisierung eines Angelman-Syndrom-Mausmodells

This manuscript describes a battery of behavioral tests available to characterize Angelman syndrome (AS)-like phenotypes in an established murine model of ...