Diese Arbeit wurde von der University of Virginia und der Jeffress Memorial Trust (J-971) finanziert. Wir danken L. Columbus, K. Jain, und P. Randolph für hilfreiche Diskussionen und die kritische Durchsicht des Manuskripts.

Ein. Benedikt Assay für reduzierende Zucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge von Benedict-Reagenz - 940 mM wasserfreies Natriumcarbonat, 588 mM Natriumcitrat-Dihydrat, 68 mM Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat. Dieses Reagenz kann bei Raumtemperatur (RT) für mindestens sechs Monate ohne merkliche Änderung der Reaktivität gespeichert werden. </li><li> Das obige Reagenz 6x. So 600 ul Reaktionen, mit 100 ul von Benedikt-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (zB Eppendorf-Marke), pro Probe untersucht werden. </li><li> Hinzufügen zwischen 10 ul und 500 ul Probe auf diesem Rohr, das optimale Volumen kann auf der Basis der Intensität der Farbbildung in einem anfänglichen Probelauf ermittelt werden. Wenn ausreichend Probe ist dann beginnen solche Studien an der maximal mögliche Probenvolumen (dh fünf Sechstel des gesamten Reaktionsvolumen, 500 ul der Probe in diesem Fall), und dann verdünnen anschließenden Tests. </li><li> Fügen ddH 2 O an der TUsein, um das Endvolumen auf 600 ul bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren. </li><li> Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen. </li><li> Zentrifugieren Probenröhre bei&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen. </li><li> Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette. </li><li> Blank UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser. </li><li> Die Extinktion dieser Probe bei 475 nm. </li></ol> 2. Bial Orcinol Assay für Pentosezucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge an frischem Bial-Reagenz - 24,2 mM Orcin Monohydrat (siehe Abbildung 2b für die Struktur dieser Verbindung), 6 M HCl, 0,025% w / v Eisenchloridhexahydrat. Hinweis:Für eine längere Lagerung können die Bial-Reagenz als zwei separate Stammlösungen hergestellt werden: (i) Reagenz A [0,05% w / v FeCl3 • 6H 2 O in konzentrierter HCl] und (ii) Reagenz B [422 mM Orcin Monohydrat in 95 vorbereitet % Ethanol]. Reagenz A kann bei RT für sechs Monate gelagert werden; Reagenz B können bei 4 ° C einen Monat gelagert werden, mit einer Folie zu Belichtung zu begrenzen. 1 (B) v / v-Verhältnis vor Gebrauch: Diese Stammlösungen werden in einem 15 (A) gemischt. </li><li> Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Bial-Reagenz ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden. </li><li> Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen. </li><li> Hinzufügen ddH 2 O, um das Rohr um den f bringeninal Volumen auf 1,0 ml; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren. </li><li> Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und lassen Sie es bei RT für 10 min abkühlen. </li><li> Zentrifugieren Probenröhre bei&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen. </li><li> Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung. </li><li> Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 660 nm. </li></ol> 3. Disches Diphenylamin Assay für 2&#39;-deoxypentose Zucker <ol><li> Bereiten Sie eine geeignete Menge Disches Diphenylamin Reagenz - 60 mM Diphenylamin, 11 M Eisessig, 179 mM Schwefelsäure, 62% v / v Ethanol. Dieses Reagenz kann vorbestellt werdenVergleich im Voraus und bei RT in einem dunklen Behälter oder mit Folie abgedeckt, um Belichtung begrenzen. Aufgrund Lichtempfindlichkeit sollte das Reagenz nicht unbegrenzt gelagert werden, obwohl in der Praxis kann es alle zwei bis drei Monate ohne sichtbare Veränderung in der Reaktivität vorbereitet werden. </li><li> Die obige Reagenz 2x. So werden 1,0 ml Reaktionen, 500 ul Disches Reagens an ein sauberes 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, pro Probe untersucht werden. </li><li> Fügen Sie überall von 10 ul bis 500 ul der Probe in dieser Röhre. Da pro Note 1,3 (oben), wenn eine ausreichende Probe besteht dann beginnen Studie Reaktionen mit der maximal möglichen Probenvolumen (dh die Hälfte der gesamten Reaktionsvolumens, 500 ul Probe in diesem Fall) und von dort zu verdünnen. </li><li> Fügen ddH 2 O an das Rohr, um das Endvolumen auf 1,0 ml zu bringen; mische die Lösung durch Vortexen oder Pipettieren. </li><li> Inkubiere die Proben für 20 Minuten in einem kochenden Wasserbad. </li><li> Entfernen Sie die erhitzten Probe aus dem Bad und allow es bei RT für 10 min abkühlen gelassen. </li><li> Zentrifugieren Probenröhre bei&gt; 9300 xg (~ 10.000 rpm in einem FA45-24-11 Eppendorf Festwinkelrotor) für 5 min, um Partikel zu sedimentieren; dieser Schritt ist wichtig für die quantitative statt qualitative Untersuchungen. </li><li> Aliquot des Überstandes von dieser Röhre in ein sauberes Küvette für Sichtprüfung. </li><li> Für semi-quantitativen Analyse, blank Das UV-VIS Spektralphotometer mit Wasser und messen die Absorption der Küvette Probe bei 600 nm. </li></ol> 4. Weitere Hinweise zur Verwendung <ol><li> Die folgenden Klassen von Molekülen eignen Referenzsubstanzen für positive und negative Kontrollreaktionen für jeden Assay: <ul><li> Benedikt - Positive = freie Ribose, Fructose, Glucose, Negative = RNA, DNA, ATP, etc. (Alle Saccharid fehlt eine kostenlose reduzierenden Zucker-Funktionalität) </li><li> Bial - Positive = RNA (zB Bäcker Hefe-Extrakt), Ribose, ATP, UMP, Negative = bovine serum Albumin (BSA) oder jedes andere Protein </li><li> Disches - Positive = DNA (zB Kalbsthymus); Negativ = RNA, ATP, etc. (Alle nicht-2&#39;-desoxygeniertem Nukleotid) </li></ul></li><li> Diese Assays haben sich als ziemlich elastisch ist, um Verbindungen häufig in der Proteinreinigung eingesetzt, so z. B. gemeinsame Salze wie NaCl, (NH 4) 2 SO 4 und K 2 SO 4 nicht stören, und die Reaktionen im Allgemeinen erscheinen unberührt der Inhalt des Verdünnungsmittels. Detergenzien oder chaotropen Agenzien wie Harnstoff kann sich auf die Reaktivität der Assays, wenn der pH-Wert hochbasischen; einem neutralen bis sauren pH-Bereich liegt in der Regel optimal für die Bial und Disches Assays aufgrund der darunterliegenden Reaktions Chemie (siehe den Text und die Protonen in Abbildung 2b, c). Potenziell suboptimal Reaktionsbedingungen, vermutete Störkomponenten, etc. sollten auf einer Fall-zu-Fall-Basis getestet werden, wobei positive und negative Kontrolle Experimenten with Referenz-Verbindungen. </li></ol>

<ol>
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Keine Interessenskonflikte erklärt.

<html> Die kolorimetrische Assays hier vorgestellten bieten eine einfache Ansatz rasch beurteilt die chemische Natur der biomolekularen Mischungen, wie sie beispielsweise auftreten, wenn Reinigung von Proteinen, RNAs oder-Komplexen aus Ganzzellen-Lysat in Vorbereitung für weitere Studien. Als Strukturbiologie verfolgt mehr native-like Baugruppen zunehmend größeren Herausforderungen wie Probe Heterogenität wird durch die komplizierte und Mehrkomponenten-Komplexen gestellt werden. Supramolekularen Aggregate sind oft nu...

Ein Großteil der Zellbiologie erfolgt über molekulare Wechselwirkungen zwischen DNA und RNA. 4 Diese natürlich vorkommenden Nukleinsäuren (NA) miteinander zusammenwirken, 5 mit Proteinen, 6 und mit einer Vielzahl von niedermolekularen Verbindungen und Liganden in vivo (zB divalente Kationen 7). Die Wechselwirkungen können kurz-oder langlebig (kinetisch), können von hohen Bereich zu geringe Affinität (thermodynamische Kraft) moderieren und können zeigen auch erhebliche Unterschiede in den chemischen Eigenschaften und Spezifität - einige Verbände sind recht spezifisch (zB DNA · · · Transkriptionsfaktoren, RNA · · · Spleißfaktoren), während andere Kommunikationen notwendigerweise weit mehr generische (zB DNA · · · bakteriellen histonähnliche HU-Proteine ​​8). Nicht-spezifische Interaktionen mit NAs können praktische Konsequenzen für in vitro Experimente mit Mischungen von biomolecules, da es möglich und sogar wahrscheinlich ist, dass einige NAs wird mit den Biomoleküle von Interesse zu verbinden, zumindest unter gewissen Teilmenge der experimentellen Bedingungen verwendet wird (Ionenstärke, pH usw.). Betrachten wir zum Beispiel Herstellung eines Proteins von Interesse (POI) über heterologe Überexpression des rekombinanten Proteins in Escherichia coli Zellkultur; solches Verfahren wird routinemäßig in praktisch jedem strukturellen Biologielabor durchgeführt 9 In Vorbereitung für weitere Experimente, wie. Als biochemischen / biophysikalischen Charakterisierung, Kristallisation, etc., anfänglichen Bemühungen in der Regel auf die Erzielung einer ausreichenden Menge des POI konzentrieren möglichst reiner Form wie möglich, idealerweise als chemisch homogen und biophysikalisch monodisperse Probe. Nach dem Aufbrechen der Wirtszellen, zielen die frühen Phasen eines typischen Aufreinigung Workflow, um den POI aus E. isolieren coli-Proteine, Nukleinsäuren, Zellwandtrümmern,und andere Komponenten des zellulären Lysat. Jedoch Host NAs kann mit dem POI mehrere physikochemische Gründen co-läutern - ein hochbasisches POI kann unspezifisch Pulldown-Wirts-DNA / RNA, die POI kann ein generisches NA-bindende Aktivität aufweisen (zB die oben erwähnten HU); das POI kann eine ziemlich spezifische NA-Bindungsprotein sondern zeigen Kreuzreaktivität mit Host-RNAs oder DNAs sein; Host NAs kann mit einer Chromatographiematrix wechselwirken und dadurch einfach koeluieren mit dem POI, und so weiter. Willkürliche, hoch-affine Bindung von Host NAs zu einem POI können stellen eine ärgerliche Problem, weil die NA Verunreinigungen wird wahrscheinlich mit nachgeschalteten Experimente (zB Fluoreszenzanisotropie Assays POI • RNA-Bindung 10) stören. Alternativ unerwartete POI · · · NA Verbände können auch zufällig angesehen werden, wie solche Wechselwirkungen beleuchten die POI-Nukleinsäure-bindende Kapazität. So oder so, ob NAs wichtigen Komponenten oder Verunreinigungen sind, muss man zunächst quantifizieren undBestimmung der Art (DNA, RNA) von Co-Reinigungskatalysator NAs in Vorbereitung für nachfolgende Versuche. Mehrere analytischen Methoden existieren zur Detektion und Quantifizierung von NA in einer Probe. Die meisten der verfügbaren Methoden sind grundsätzlich entweder spektrophotometrischen (z. B. A 260 Extinktionswerte und A 260 / A 280-Verhältnisse), fluorometrische (z. B. die Bindung von Thiazolorange oder andere fluoreszierende Farbstoffe auf NA) oder farbmetrisch (Suszeptibilität von Nukleosiden, um chemische Reaktionen Ausbeute daß Chromophore absorbierend im UV-VIS-Bereich des elektromagnetischen Spektrums), wie kürzlich von De Mey et al. 1 Jedoch ist der entscheidende Schritt des Identifizieren des Typs des Polynukleotid, wie RNA oder DNA über den Rahmen viele dieser Quantifizierung Ansätze. Hier bieten wir einen Satz von kolorimetrischen Assays für die schnelle Erkennung der Arten von NA-Komponenten in einem proteinhaltigen Probe. Die hier beschriebenen Protokolle ceine effizient ohne zusätzlichen Schritte der Isolierung der potentiellen NA Verunreinigungen ausgeführt werden, und sich auf Benedikts Assay für reduzierende Zucker 11, das Orcinol-Assay für Pentosen 12,13, 14,15 und Diphenylamin Reaktionen von 2&#39;-deoxypentoses (Abbildungen 1 und 2) . Die Benedikts Test (2a) nutzt die Fähigkeit der linearen, offenkettige (Aldehyd)-Form einer Aldose Zucker zu Cu 2 +, unter Oxidation des Zuckers Carbonylgruppe zu einer Carboxylat-Komponente und Produktion von Cu 2 O als eine Reduzierung unlöslichen roten Niederschlag. Diese Reaktion testen mit freien reduzierenden Zuckern wie Aldosen und Ketosen (die mit den entsprechenden Aldosen über Endiol Zwischenprodukte umzuwandeln) positive, aber nicht mit Pentosezucker, dass in zyklischer Form als Teil der kovalenten Rückgrat eines DNA-oder RNA-Polynukleotid gesperrt. Aufgrund des minimalistischen Erfordernis einer freien Halbacetal Funktionalität, andere Compounds, die positiv getestet werden in diesem Test konnte - und wirken somit als potenzielle Störfaktoren - gehören α-Hydroxy-Ketone und kurze Oligosaccharide (zB das Disaccharid Maltose). Sowohl die Bial Orcin (Abbildung 2b) und Disches Diphenylamin (Abbildung 2c) Reaktionen werden bei der erstmaligen Zerstörung des Polynukleotid Backbone, über Depurinierung der Nukleosid-und weitere Säure-oder Basen-katalysierten Hydrolyse der Muttergesellschaft Nukleotide, die Furan-2 ergeben -carbaldehyd (Furfural) Derivate; diese Derivate reagieren dann entweder mit einem Polyhydroxyphenol wie Orcin (Bial) oder Diphenylamin (Disches) Reagenzien, farbige Kondensationsprodukte von weitgehend unbekannten chemischen Struktur zu bilden. Die DNA im Vergleich zu RNA-Spezifität des Disches Assay beruht auf der Tatsache, daß der Pentosezucker muss 2&#39;-desoxygenierten, um es zu Störungen durch Oxidation zu ω-hydroxylevulinyl Aldehyd, das weiter reagiert mit Diphenylaminunter sauren Bedingungen unter Bildung eines hellblauen Kondensat (Abbildung 2c). Mit den hier beschriebenen Protokolle gestrafft haben wir gefunden, dass diese zuckerfreie spezifischen kolorimetrischen Reaktionen können zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, und wird auch auf das Vorhandensein von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose oder Ribose in einer biomolekularen Probe.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenz oder Ausrüstung </td><td> Lieferant / Firma </td><td> Katalognummer </td><td> Kommentare, Notizen </td></tr><tr><td> Wasserfreies Natriumcarbonat </td><td> Fisher Scientific </td><td> S263 </td><td></td></tr><tr><td> Natriumcitratdihydrat </td><td> Sigma </td><td> S-4641 </td><td></td></tr><tr><td> Kupfer (II)-Sulfat-Pentahydrat </td><td> VWR </td><td> VW3312-2 </td><td></td></tr><tr><td> Orcinol Monohydrat </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O1875 </td><td></td></tr><tr><td> Konzentrierte HCl </td><td> VWR </td><td> BDH3030 </td><td></td></tr><tr><td> Eisenchloridhexahydrat </td><td> Sigma </td><td> F-2877 </td><td></td></tr><tr><td> Diphenylamin </td><td> Aldrich </td><td> 112763 </td><td></td></tr><tr><td> Eisessig </td><td> Fisher Scientific </td><td> A28 </td><td></td></tr><tr><td> Schwefelsäure </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 258105 </td><td></td></tr><tr><td> Ethanol </td><td> Koptec </td><td> V1101 </td><td></td></tr><tr><td> Ribose </td><td> Sigma </td><td> R-7500 </td><td> prep bei 1% w / v in H 2 O </td></tr><tr><td> Ribonukleinsäure aus Bäckerhefe (S. cerevisiae) </td><td> Sigma </td><td> R6750 </td><td> prep bei 10 mg / ml in H 2 O; bei -20 ° C </td></tr><tr><td> Desoxyribonukleinsäure (Natriumsalz), aus Kalbsthymus </td><td> Sigma </td><td> D1501 </td><td> prep bei 10 mg / ml in H 2 O; lagern bei 4 ° C </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenzien, Geräte und Sicherheit Die Materialien werden in der fo aufgeführtllowing Tabelle in der Reihenfolge, in der sie in dem Protokoll Abschnitt. Soweit nicht anders vermerkt (siehe oben), können alle Reagenzien bei Raumtemperatur und Beleuchtung gespeichert werden. Für alle Posten, die nicht unten aufgeführt (z. B. Mikrozentrifugenröhrchen), kann die übliche Marke / Modell / Sorte fand in einem Standard biochemischen Labor eingesetzt (z. B. Marke Eppendorf 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen) werden. Standard-Kunststoff Mikrozentrifugenröhrchen sollte Schritte, welche Zentrifugation (zB zu sedimentieren Partikelmaterial in der Nähe des Ende jedes Protokoll) verwendet werden. Keine spezielle Material ist bevorzugt, solange die Rohre abzudichten; die typischen Polypropylenröhrchen in Biochemie Laboratorien gefunden funktionieren gut. In Bezug auf die Sicherheit Bedenken und Entsorgung, sollte Standard-Labor-Vorsichtsmaßnahmen (Schutzbrille, Abzugshauben) bei der Aufstellung ausgeübt werden, die Arbeit mit und die Entsorgung von Lösungen mit konzentrierter Essigsäure, Salzsäure oder Schwefelsäure. Für organische Reagenzien wie Orcin oder diphenylamin sind Nitril vorzuziehen gemeinsamen Latex (Naturkautschuk) Vielfalt. </td></tr></tbody></table>

rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish rna and dna in biomolecular samples

Biochemischer Experimente in der Regel erfordert genaue Kenntnisse, in einem frühen Stadium, der Nukleinsäure, Protein und anderen biomolekularen Komponenten in potentiell heterogenen Proben. Nukleinsäuren können über mehrere etablierte Methoden, einschließlich analytischen Methoden, die spektrophotometrische sind (z. B. A 260), fluorometrische (z. B. die Bindung von Fluoreszenzfarbstoffe) oder farbmetrisch (Nukleosid-spezifischen chromogenen chemische Reaktionen). 1 Obwohl es nicht leicht unterscheiden kann erkannt werden RNA aus DNA, das A 260 / A 280-Verhältnis wird üblicherweise verwendet, da sie einen einfachen und schnellen 2 Beurteilung der relative Gehalt an Nukleinsäure, die überwiegend in der Nähe 260 nm absorbiert und Protein, das hauptsächlich in der Nähe 280 nm absorbiert bietet. Ratios &lt;0,8 werden als Indikator für die &quot;reinen&quot; Protein Proben entnommen, während reine Nukleinsäure (NA) durch Verhältnisse gekennzeichnet ist&gt; 1,5 3. However, gibt es Situationen, in denen das Protein / NA Gehalt nicht deutlich oder können als zuverlässig abgeleitet von einfachen UV-VIS spektrophotometrische Messungen. Zum Beispiel werden (i) Proben können ein oder mehrere Proteine, die relativ frei von den aromatischen Aminosäuren, die für Absorption bei ≈ 280 nm (Trp, Tyr, Phe) sind, wie es der Fall mit einigen kleinen RNA-bindenden Proteinen und (ii) Proben weisen Zwischenprodukt A 260 / A 280-Verhältnisse (~ 0,8 &lt;~ 1,5), wo das Protein / NA Inhalt ist weit weniger klar und kann sogar auf eine gewisse hoher Affinität Zusammenhang zwischen dem Protein und NA-Komponenten. Für derartige Szenarien beschreiben wir hier eine Reihe von kolorimetrischen Assays rasch unterscheiden RNA, DNA und reduzierende Zucker in einer potentiell Mischprobe von Biomolekülen. Die Methoden beruhen auf der Differenz Empfindlichkeit der Pentosen und andere Kohlenhydrate Benedikt, Bial (Orcin) und Disches (Diphenylamin) Reagenzien, die gestrafft Protokolle com seinabgeschlossen innerhalb weniger Minuten, ohne irgendwelche zusätzlichen Schritte aufweist, um die Komponenten zu isolieren. Die Assays können parallel durchgeführt werden, um zwischen RNA und DNA zu unterscheiden, sowie die Anwesenheit von freien reduzierenden Zucker wie Glucose, Fructose, Ribose und (Abbildung 1).

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 für die Anwendung dieser kolorimetrische Assays bekannt Referenzsubstanzen gezeigt. Vertreter qualitative Daten für die Benedikt (a), Orcin (b) Bial und Disches Diphenylamin (c) Assays gezeigt, und Standard-Kurven für diese drei Tests sind in Abbildung 4 dargestellt. Einsatzplatten 3 (ac) zeigen die linke Felder positive / negative Kontrollexperimente unter Verwendung geeigneter reaktiver / unreaktiv Analyten; diese visuellen Ergebnisse sind in ...

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Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Biochemical experimentation generally requires accurate knowledge, at an early stage, of the nucleic acid, protein, and other biomolecular components in ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

41.8K Aufrufe.  University of Virginia. Eine Reihe von kolorimetrischen Assays wird zum schnellen Unterscheidungsmerkmal Protein, RNA, DNA und Reduk-tion Zuckern in potentiell heterogenen biomolekularen Proben beschrieben.

Serie: Rapid Colorimetric Assays to Qualitatively Distinguish RNA and DNA in Biomolecular Samples

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Forschung

Genetik

Investigation of RNA Synthesis Using 5-Bromouridine Labelling and Immunoprecipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in production or degradation of RNA. This protocol describes a method for measurement of RNA production, using 5-Bromouridine labelling of RNA followed by immunoprecipitation, which enables investigation of RNA synthesized within a short timeframe (e.g., 1 h). The advantage of 5-Bromouridine-labelling and immunoprecipitation over the use of toxic transcriptional inhibitors, such as &#945;-amanitin and actinomycin D, is that there are no or very low effects on cell viability during short-term use. However, because 5-Bromouridine-immunoprecipitation only captures RNA produced within the short labelling time, slowly produced as well as rapidly degraded RNA can be difficult to measure by this method. The 5-Bromouridine-labelled RNA captured by 5-Bromouridine-immunoprecipitation can be analyzed by reverse transcription, quantitative polymerase chain reaction, and next generation sequencing. All types of RNA can be investigated, and the method is not limited to measuring mRNA as is presented in this example.

This method can be used to measure RNA synthesis. 5-Bromouridine is added to cells and incorporated into synthesized RNA. RNA synthesis is measured by RNA extraction immediately after labelling, followed by 5-Bromouridine-targeted immunoprecipitation of labelled RNA and analysis by reverse transcription and quantitative polymerase chain reaction.

Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

When steady state RNA levels are compared between two conditions, it is not possible to distinguish whether changes are caused by alterations in ...

Next-generation Viral RNA/DNA in situ Hybridization Applications in Human Immunodeficiency Virus/Simian Immunodeficiency Virus Research

In situ hybridization is a powerful technique to identify specific RNA or DNA sequences within individual cells in tissue sections, providing important insights into physiological processes and disease pathogenesis. In situ hybridization (ISH) has been used for many years to assess the location of cells infected by viruses, but recently a next-generation ISH approach was developed with a unique probe design strategy that allows simultaneous signal amplification and background suppression to achieve single-molecule visualization while preserving tissue morphology. This next-generation ISH is based on an approach like branched PCR, but performed in situ and is more facile, sensitive, and reproducible than classical ISH methods or in situ PCR approaches in routinely detecting RNA or DNA in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissues. For the last several years our laboratory has been applying this ISH platform for the detection of human immunodeficiency (HIV) and simian immunodeficiency (SIV) viral RNA (vRNA) and/or viral DNA (vDNA) positive cells within a multitude of FFPE tissues. With this detailed technical manuscript, we would like to share our knowledge and advice with all individuals interested in using next-generation ISH in their research.

Here we present a next-generation in situ hybridization assay to identify specific viral RNA or DNA sequences in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissues. This approach allows visualization of low copies of RNA and DNA in less than 24 h with very high sensitivity and specificity.

In situ hybridization is a powerful technique to identify specific RNA or DNA sequences within individual cells in tissue sections, providing important ...

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic macrocycles that exhibit differential cytostatic and cytotoxic properties in specific cell lines, depending on the identities of the chelated metal and functional groups. The unique behavior of functionalized corroles towards specific cell lines introduces the possibility of targeted chemotherapy.
Many anticancer drugs are evaluated by their ability to inhibit RNA transcription. Here we present a step-by-step protocol for RNA transcription in the presence of known and potential inhibitors. The evaluation of the RNA products of the transcription reaction by gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy provides information on inhibitive properties of potential anticancer drug candidates and, with modifications to the assay, more about their mechanism of action.
Little is known about the molecular mechanism of action of corrole cytotoxicity. In this experiment, we consider two corrole compounds: gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (Ga(tpfc)) and freebase analogue 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole (tpfc). An RNA transcription assay was used to examine the inhibitive properties of the corroles. Five transcription reactions were prepared: DNA treated with Actinomycin D, triptolide, Ga(tpfc), tpfc at a [complex]:[template DNA base] ratio of 0.01, respectively, and an untreated control.
The transcription reactions were analyzed after 4 hr using agarose gel electrophoresis and UV-Vis spectroscopy. There is clear inhibition by Ga(tpfc), Actinomycin D, and triptolide.
This RNA transcription assay can be modified to provide more mechanistic detail by varying the concentrations of the anticancer complex, DNA, or polymerase enzyme, or by incubating the DNA or polymerase with the complexes prior to RNA transcription; these modifications would differentiate between an inhibition mechanism involving the DNA or the enzyme. Adding the complex after RNA transcription can be used to test whether the complexes degrade or hydrolyze the RNA. This assay can also be used to study additional anticancer candidates.

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium(III) 5,10,15-(tris)pentafluorophenylcorrole and its freebase analogue exhibit low micromolar cell cytotoxicity. This manuscript describes an RNA transcription reaction, imaging RNA with an ethidium bromide-stained gel, and quantifying RNA with UV-Vis spectroscopy, in order to assess transcription inhibition by corroles and demonstrates a straightforward method of evaluating anticancer candidate properties.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

Biotechnik

DNAzyme-dependent Analysis of rRNA 2&#8217;-O-Methylation

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in higher eukaryotes may promiscuously recognize other RNA species and 2&#8217;-O-methylate multiple targets. Here, we provide step-by-step guide for the fast and non-expensive analysis of the site-specific 2&#8217;-O-methylation using a well-established method employing short DNA oligonucleotides called DNAzymes. These DNA fragments contain catalytic sequences which cleave RNA at specific consensus positions, as well as variable homology arms directing DNAzyme to its RNA targets. DNAzyme activity is inhibited by 2-&#8217;O-methylation of the nucleotide adjacent to the cleavage site in the RNA. Thus, DNAzymes, limited only by the consensus of the cleaved sequence, are perfect tools for the quick analysis of snoRNA-mediated RNA 2&#8217;-O-methylation. We analyzed snoRNA snR13- and snR47-guided 2&#8217;-O-methylation of 25S ribosomal RNA in Saccharomyces cerevisiae to demonstrate the simplicity of the technique and to provide a detailed protocol for the DNAzyme-dependent assay.

Here we present a protocol for DNAzyme-dependent cleavage of RNA. This enables fast and site-dependent analysis of RNA 2&#8217;-O-methylation. This approach can be used for the preliminary or major assessment of snoRNA activity.

DNAzyme-abhängige Analyse der rRNA 2'-O-Methylierung

Guide box C/D small nucleolar RNAs (snoRNAs) catalyze 2&#8217;-O-methylation of ribosomal and small nuclear RNA. However, a large number of snoRNA in ...

Entwicklungsbiologie

<meta charset="utf8"></head><body>Präzisions-DNAzyme-Nanomaschinen für die diskriminative RNA- und DNA-Analyse

DNAzyme 10-23 - Based Nanomachines for Nucleic Acid Recognition

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their functions include tight analyte binding, highly selective analyte recognition, fluorescent signal amplification by multiple catalytic cleavages of a fluorogenic reporter substrate, and fluorogenic substrate attraction for an increase in sensor response. Functional units are attached to a common DNA scaffold for their cooperative action. The RNA-cleaving 10-23 DNMs feature&#160;improved sensitivity in comparison with non-catalytic hybridization probes. The stability of the DNM and the increased chances of substrate recognition are provided&#160;by a double-stranded DNA fragment,&#160;a tile. DNM can differentiate two analytes with a single nucleotide difference in a folded RNA and a double-stranded DNA and detect analytes at concentrations ~1000 times lower than other protein-free hybridization probes. This article presents the concept behind the diagnostic potential of DNA-nanomachine activity and overviews DNM design, assembly, and application&#160;in nucleic acid detection assays.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor im Rampenlicht: Fortschritte bei DNA-Nanosensoren – Bewältigung der Herausforderungen bei Empfindlichkeit und Selektivität beim molekularen Nachweis

The DNAzyme-based nanomachines can be used for highly selective and sensitive detection of nucleic acids. This article describes a detailed protocol for the design of DNAzyme-based nanomachines with a 10-23 core using free software and their application in the detection of an Epstein-Barr virus fragment as an example.

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme-based nanomachines (DNM) for the detection of DNA and RNA sequences (analytes) are multifunctional structures made of oligonucleotides. Their ...

Biochemie

Assays für DNA-Enzyme mit synthetischen Oligonukleotiden

Using Modified Synthetic Oligonucleotides to Assay Nucleic Acid-Metabolizing Enzymes

The availability of a range of modified synthetic oligonucleotides from commercial vendors has allowed the development of sophisticated assays to characterize diverse properties of nucleic acid metabolizing enzymes that can be run in any standard molecular biology lab. The use of fluorescent labels has made these methods accessible to researchers with standard PAGE electrophoresis equipment and a fluorescent-enabled imager, without using radioactive materials or requiring a lab designed for the storage and preparation of radioactive materials, i.e., a Hot Lab. The optional addition of standard modifications such as phosphorylation can simplify assay setup, while the specific incorporation of modified nucleotides that mimic DNA damages or intermediates can be used to probe specific aspects of enzyme behavior. Here, the design and execution of assays to interrogate several aspects of DNA processing by enzymes using commercially available synthetic oligonucleotides are demonstrated. These include the ability of ligases to join or nucleases to degrade different DNA and RNA hybrid structures, differential cofactor usage by the DNA ligase, and evaluation of the DNA-binding capacity of enzymes. Factors to consider when designing synthetic nucleotide substrates are discussed, and a basic set of oligonucleotides that can be used for a range of nucleic acid ligase, polymerase, and nuclease enzyme assays are provided.

Autor im Rampenlicht: Charakterisierung neuartiger Enzyme aus Extremophilen und häufigen Krankheitserregern zum Verständnis der DNA-Reparatur und -Replikation

Here, a protocol for assaying nucleic acid metabolizing enzymes is presented, using examples of ligase, nuclease, and polymerase enzymes. The assay utilizes fluorescently labeled and unlabeled oligonucleotides that can be combined to form duplexes mimicking RNA and/or DNA damages or pathway intermediates, allowing for the characterization of enzyme behavior.

Schnelle kolorimetrische Assays zur Qualitativ unterscheiden RNA und DNA in Biomolekulare Proben

Zusammenfassung

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Bewertung der Kontamination der DNA in RNA-Proben anhand der ribosomalen DNA

Untersuchung der RNS-Synthese mit 5-Bromouridine Kennzeichnung und Immunopräzipitation

Next-generation Viral RNA/DNA in situ Hybridization Applications in Human Immunodeficiency Virus/Simian Immunodeficiency Virus Research

Ein

DNAzyme-abhängige Analyse der rRNA 2'-O-Methylierung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

DNAzyme 10-23 - basierte Nanomaschinen zur Nukleinsäureerkennung

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen

Verwendung modifizierter synthetischer Oligonukleotide zum Assay von Nukleinsäure-metabolisierenden Enzymen