DNAzyme-abhängige Verdauung ist eine nützliche Methode zum Studium der Funktionen von snoRNAs. Es ist eine schnelle und einfache Methode, um die standortspezifische RNA-Methylierung zu analysieren. Es erfordert ein kurzes DNA-Oligonukleotid und grundlegende Reagenzien, die in jedem molekularbiologischen Labor vorhanden sind.
Beginnen Sie mit dem Entwerfen des DNAzyme für die Reihenfolge des Interesses. Suchen Sie die RNA-Sequenz oder die vermeintliche Methylierungsstelle mithilfe einer geeigneten Datenbank. Verwenden Sie für S.cerevisiae snoRNA-Ziele die Hefe-SnoRNA-Datenbank.
Um eine methylierungsquelle von Interesse zu finden, z. B. eine snR13-abhängige Stelle, wählen Sie snR13 aus und notieren Sie sich die Position des modifizierten Nukleotids. Suchen Sie die Sequenz vor und nach dem modifizierten Nukleotid mithilfe einer geeigneten Datenbank, z. B. Saccharomyces Genome Database. Suchen Sie nach dem Zielgennamen.
Wenn Sie einen 10 bis 23 DNAzyme-Assay verwenden, wählen Sie 10 bis 15 Nukleotide vor und flussabwärts der Methylierungsstelle aus. Wenn Sie das 8-17 DNAzyme verwenden, wählen Sie 20 Nukleotide aus. Erstellen Sie komplementäre Sequenzen der Fünf-Prim- und Drei-Prim-Arme und verwenden Sie sie, um die DNAzyme-Katalytiksequenz an den Drei-Prim- und Fünf-Prim-Enden zu flankieren.
Bestellen Sie das DNAzym als normales DNA-Oligonukleotid. Wachsen Sie Hefe-Stämme von Interesse in einem geeigneten Medium und Bedingungen. Wenn Zellen die mittlere exponentielle Phase erreichen, pellet sie durch Zentrifugieren bei 1 000 mal g für drei Minuten bei vier Grad Celsius und verwerfen das Medium.
Fahren Sie mit der RNA-Isolation gemäß Manuskriptanweisungen fort. Dann setzen Sie das RNA-Pellet in 30 Mikroliter RNase und DNase-freiem Wasser wieder auf. Legen Sie die Röhre auf Eis und messen Sie die RNA-Konzentration auf einem Mikrospektrophotometer.
Um die DNAzyme-Verdauung mit dem 10 bis 23 DNAzyme durchzuführen, bereiten Sie einen Inkubationsmix mit fünf Mikrogramm RNA, 200 Picomolen von 10 bis 23 DNAzyme und einem X 10 bis 23 Inkubationspuffer in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern vor. Dann inkubieren Sie die Rohre auf einem trockenen Wärmeblock auf 95 Grad Celsius für drei Minuten eingestellt. Unmittelbar danach die Rohre auf Eis legen und dort für fünf Minuten lassen.
Drehen Sie die Rohre kurz herunter und legen Sie sie wieder auf Eis. Fügen Sie 20 Einheiten RNase-Hemmer hinzu und legen Sie die Rohre auf einen trockenen Wärmeblock, der auf 25 Grad Celsius eingestellt ist, für 10 Minuten. In der Zwischenzeit ein Reaktionsgemisch vorbereiten, indem man fünf Mikroliter vier-X 10 bis 23 Reaktionspuffer mit vier Mikrolitern 300-Molar-Magnesiumchlorid und einem Mikroliter Wasser kombiniert.
Diesen Reaktionsmix auf einem trockenen Wärmeblock, der auf 37 Grad Celsius eingestellt ist, vorheizen. Legen Sie das Rohr mit dem Inkubationsmix auf den 37 Grad Celsius trockenen Wärmeblock und fügen Sie 10 Mikroliter des vorgewärmten Reaktionsmixes hinzu. Inkubieren Sie die Mischung bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und dann legen Sie die Röhre auf Eis.
Um die DNAzyme-Verdauung mit dem 8-17 DNAzyme durchzuführen, bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Mikrotube mit fünf Mikrogramm RNA in einem Gesamtvolumen von sechs Mikrolitern vor. Dann bereiten Sie ein separates Rohr mit 400 Picomolen des 8-17 DNAzyme. Halten Sie während der Arbeit beide Rohre auf Eis.
Beide Rohre auf einen trockenen Wärmeblock auf 95 Grad Celsius übertragen und zwei Minuten lang bebrüten. Bewegen Sie die RNA-Probe wieder auf Eis und drehen Sie die Röhre mit dem DNAzyme für fünf Sekunden nach unten. Inkubieren Sie das DNAzyme bei 25 Grad Celsius für 10 Minuten.
Während das DNAzyme inkubiert, bereiten Sie 10 Mircoliter von zwei-X 8-17 Reaktionspuffer und prewarm es auf 25 Grad Celsius. Fügen Sie den vorgewärmten Puffer mit dem DNAzyme in die Röhre und übertragen Sie dann 14 Mikroliter dieses Reaktionsmixes zusammen mit 20 Einheiten RNase-Inhibitor in die Röhre. Inkubieren Sie die Reaktion bei 25 Grad Celsius für zwei Stunden und dann legen Sie die Röhre auf Eis.
Um die RNA nach der DNAzyme-Verdauung zu reinigen, fügen Sie 350 Mikroliter Wasser und 400 Mikroliter Chloroform in das Reaktionsröhrchen. Wirbel für 30 Sekunden und Zentrifuge bei 20.000 mal g für fünf Minuten. Nach der Zentrifugation die obere Phase in eine neue Röhre mit einem Milliliter Ethanol, 40 Mikroliter n.Gamammoniumacetat und einem Mikroliter Glykogen übertragen.
Drehen Sie die Röhre ein paar Mal, um zu mischen und brüten entweder bei negativen 80 Grad Celsius für zwei Stunden oder bei negativen 20 Grad Celsius über Nacht. Fahren Sie mit der RNA-Reinigung nach Manuskriptanweisungen fort und setzen Sie das RNA-Pellet dann in 10 Mikroliter RNase und DNase-freiem Wasser wieder aus. Legen Sie die RNA-Röhre sofort nach der Reinigung auf Eis.
Um die RNA-Elektrophorese durchzuführen, beginnen Sie mit dem Auflösen von 1,5 Gramm Agarose in 127,5 Milliliter doppeldestilliertem Wasser, indem Sie das Gemisch in der Mikrowelle erwärmen. Dann 15 Milliliter 10X MOPS und 7,5 Milliliter 37%Formaldehyd in die Agarose-Lösung geben. Fügen Sie der Agarose-Lösung eine angemessene Menge an Gelfleck hinzu.
Gießen Sie die Agarose in das Tablett und lassen Sie sie für 45 Minuten abkühlen. Bereiten Sie die RNA-Proben vor, indem Sie 10 Mikroliter der verdauten und gereinigten RNA mit fünf Mikrolitern Probendenaturierungspuffer und 0,5 Mikroliter Sechs-X-Ladefarbstoff kombinieren. Inkubieren Sie die Proben bei 70 Grad Celsius für fünf Minuten und dann auf Eis für fünf Minuten.
Das vorbereitete Gel in den Elektrophoresetank geben und den Tank mit einem 1-X MOPS Puffer füllen. Die gesamten 15 Mikroliter der Probe auf das Gel legen und das Gel bei 80 Volt laufen lassen, bis Bromothymol blau 2/3 der Gellänge erreicht. Analysieren Sie das Gel mit dem entsprechenden Imager.
Der Wert dieser Technik kann auf einem induzierbaren SnoRNA-Transkriptionssystem nachgewiesen werden. Das Einfügen eines induzierbaren GAL1-Promotors vor snR13- oder snR47-Genen ermöglicht die Analyse der snoRNA-abhängigen Methylierung von 25S ribosomaler RNA. Wenn die Zellen auf Galaktose angebaut werden, wird die 25S ribosomale RNA an snoRNA-geführten Stellen methyliert und bleibt nach der Behandlung mit DNAzyme intakt.
Im Gegensatz dazu tritt bei abschaltender SnoRNA-Expression aufgrund des Mangels an Galaktose dNAzyme-abhängige Spaltung auf. Darüber hinaus wird keine RNA-Verdauung in den Wildtyp-Kontrollen beobachtet, da die SnoRNA-Expression galaktoseunabhängig ist. Die Aktivität der DNAzyme-abhängigen Spaltung bei der Analyse unserer rRNA-Modifikationen wurde kürzlich im Kontext der SnoRNA-Reifung gezeigt.
Der DNAzyme-abhängige Test wurde verwendet, um zu zeigen, dass der Mangel an Five-Prime- und Pre-SnoRNA-Verarbeitung die Methylierungsniveaus von 25S und 18S rRNA in Saccharomyces cerevisiae beeinflusst. Dieses Protokoll erfordert die Verwendung von Phenol und Chloroform, die giftig sind und unter einer Dunstabzugshaube behandelt werden sollten.
