Wir danken Dr. Cindy N. Chiu für die Hilfe bei der Gelelektrophorese und Andy Zhou und Michael Grodick für die großzügige Spende von DNA und Restriktionsenzym. Wir danken Professor J. Heath und Professor D. Prober für großzügigen Zugang zu Ausrüstung und Materialien. Wir danken Dr. Karn Sorasaenee für Anregungen. Wir danken Mary H. Tang für die Erstellung der Darstellung in der schematische Übersicht in dem Video verwendet. Die Finanzierung wurde von Johnson &amp; Johnson und USC Y86786 vorgesehen.

HINWEIS: Bei der Arbeit mit RNA pflegen eine saubere Arbeitsumgebung, um eine Verunreinigung durch DNase und RNase Enzyme, die DNA und RNA abbauen zu vermeiden. Stellen Sie sicher, dass die Pipettenspitzen und Schläuche sind DNase und RNase frei. Es ist auch hilfreich, um abwischen Labor Oberflächen und Geräte wie Pipetten, Rohrhalter, etc. mit einer Dekontaminationslösung. 1. RNA-Transkription mit Corrol Behandlung <ol><li> Bereiten Sie die Corrol und Inhibitorverbindungen in einem 0,01: 1 Molverhältnis von [komplexen]: [DNA]. HINWEIS: In unserem Fall ist das Verhältnis bei 4,3 fmol Komplex: 0,43 pmol DNA, wobei die DNA-Matrize verwendet wurde, APET-28c Vektor mit LIGA-Gen aus E. coli unter der Kontrolle des T7-Promotors. Andere DNA mit dem T7-Promotor gelten auch Kandidaten für den Betrieb des Transkriptionsassay. <ol><li> Löse Actinomycin D, Triptolid tpfc und Ga (tpfc) in Dimethylsulfoxid (DMSO) in einer sauberen, getrennten Behältern. Erhalten Endkonzentration einer 0,01: 1 molaren Verhältnis von [complexe]: [DNA] mit Verdünnungsreihen mit Nuklease-freies Wasser. <ol><li> Lösen Sie 1 mg Actinomycin D in 1,8 ml DMSO. Aliquot 10 ul auf einem separaten Behälter und auf 1 ml zu verdünnen mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/100 Verdünnung erstellen. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freiem Wasser auf ein 1 / 1.000-Verdünnung zu schaffen. HINWEIS: Die Konzentration der fertigen Lösung von Actinomycin D ist 4,3 fmol. </li><li> Lösen Sie 1 mg Triptolid in 0,64 ml DMSO. Aliquot 1 ul auf einem separaten Behälter und auf 1 ml zu verdünnen mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/1000-Verdünnung erstellen. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freies Wasser, um eine zweite 1/1000-Verdünnung erstellen. HINWEIS: Die Konzentration der fertigen Lösung von Triptolid 4,3 fmol. </li><li> Lösen Sie 1 mg tpfc in 2,9 ml DMSO. Aliquot 10 ul auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/100 d erstellenilution. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freiem Wasser auf ein 1 / 1.000-Verdünnung zu schaffen. HINWEIS: Die Konzentration der Endlösung tpfc 4,3 fmol. </li><li> Lösen Sie 1 mg Ga (tpfc) in 2,6 ml DMSO. Aliquot 10 ul auf einem separaten Behälter und auf 1 ml zu verdünnen mit Nuklease-freies Wasser, um eine 1/100 Verdünnung erstellen. Aliquot 1 ul der Verdünnung auf einem separaten Behälter und mit Wasser auf 1 ml mit Nuklease-freiem Wasser auf ein 1 / 1.000-Verdünnung zu schaffen. HINWEIS: Die Konzentration der fertigen Lösung von Ga (tpfc) 4,3 fmol. ANMERKUNG: Diese Corrole und Inhibitoren sind in Wasser nicht löslich und müssen in DMSO vorgelöst. Kleine Mengen von DMSO (unter 1%) induzieren keine Zytotoxizität in den Zellen (unveröffentlichte Daten). </li></ol></li></ol></li><li> Vor Beginn des Transkriptionsreaktion, bereiten die notwendigen Reagenzien einzeln oder kaufen sie von einem kommerziellen Anbieter. <ol><li> Thaw auf Eis fror allen Reagenzien (siehe Tabelle 1 finden Sie eine Liste von gefrorenen Reagenzien). </li><li> Lassen Sie die 10x Reaktionspuffer und die 4 Ribonukleotid (ATP, CTP, GTP und UTP) Lösungen Zeit zu mischen, bis sie vollständig in Lösung gelöst. </li><li> Kurz zentrifugieren alle Reagenzien, um den Verlust von Material auf den Rand des Rohres zu verhindern. Nach dem Auftauen Shop Ribonukleotiden auf Eis, während das 10x Reaktionspuffer bei Raumtemperatur. </li><li> Kombinieren Reagenzien für die Transkriptionsreaktion bei Raumtemperatur (siehe Tabelle 2 für eine Liste von Reagenzien). HINWEIS: Die Spermidin im 10x Reaktionspuffer kann die Matrizen-DNA auszufällen, wenn die Reaktion auf Eis statt bei RT montiert. </li><li> Gründlich mischen Dazu den Schlauch oder Pipettieren der Mischung nach oben und unten vorsichtig ab. Nach dem Mischen, um kurz zentrifugieren Reaktionsgemisch am Boden des Röhrchens zu sammeln. </li><li> Inkubieren der Reaktionsmischung bei 37 ° C für insgesamt 2-4 Std. HINWEIS: Die erforderlichen Reaktionszeiten variierenmit DNA-Template Größe und Reihenfolge. Dieser Schritt kann die Optimierung für bestimmte Sequenzen erforderlich. Kürzere Schablonen können längere Reaktionszeiten für eine hohe Ausbeute an Gesamt-RNA, erfordern. </li><li> Entfernen Sie 4 ul Aliquots von jeder Reaktion nach jeder Stunde und bei -20 ° C. Ändern Sie wie gewünscht Zeitpunkten benötigt. </li></ol></li></ol> 2. RNA Spin Column <ol><li> Im Anschluss an die Transkriptionsreaktion, reinigen die RNA mit Mikro-kompatiblen Chromatographiesäulen. HINWEIS:. Die Verwendung von RNA-Spin-Säulen, um RNA mit mehr als 20 Basen kommt es mehr als 80% Rückgewinnung zu reinigen 44 HINWEIS: Die Säulenchromatographie ist eine bekannte und geeignete Verfahren, um RNA zu reinigen. Weitere mögliche Reinigungsverfahren existieren auch, wie Lithiumchlorid Ausfällung, Phenol: Chloroform-Extraktion, Präzipitation mit Isopropanol sowie anderen handelsüblichen Kits. <ol><li> Gleichmäßig resuspendieren Sephadex Matrix im Säulenpuffer durch heftiges Umdrehen derSpalte drei oder mehrere Male. Tun Sie dies durch Schwenken der Säule scharf. </li><li> Entfernen Sie die obere Abdeckung von der Spalte. Es wird eine gewisse Rest Sephadex Matrix in der Kappe ist; wenn die Kappe mit der Matrix gefüllt ist, die Kappe wieder auf die Säule und wiederholen Sie den vorherigen Schritt, bis der Großteil der Matrix in der Säule. </li><li> Snap off der unteren Spitze der Kolonne. Hinweis: einige Flüssigkeit aus der Säule zu entkommen. </li><li> Verpacken Sie die Spalte. <ol><li> Zeigen Spalte in einer sterilen (von RNase und DNase) 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei 1.000 × g für 1 min. </li></ol></li><li> Entsorgen Sie die 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Puffer eluiert aus der Säule. </li><li> Sofort legen Sie die Spalte in einem neuen sterilen 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren und die Probe in die Mitte der Säule Bett. Verwenden Sie 20 bis 50 ul Probe, um eine Überlastung der Spalte. </li><li> Zentrifugieren Sie das Röhrchen in einer Tischzentrifuge bei 1.000 · gfür 1 min. HINWEIS: Das Laufmittel ist die gereinigte RNA-Probe. </li></ol></li></ol> 3. Agarose-Gel-Elektrophorese (1% Agarose-Gel) 42 HINWEIS: Ethidiumbromid fluoresziert bei der Bindung an DNA und RNA, daher sind diese Biomoleküle können mit UV-Licht durch Inkubation mit 0,5 ug / ml Ethidiumbromid-Lösung visualisiert werden. <ol><li> Vorbereiten einer 1,000x Stammlösung von Ethidiumbromid (0,5 mg / ml) hergestellt, indem 5 mg Ethidiumbromid in 10 ml Wasser. </li><li> Bereiten Tris Acetat EDTA (TAE) Laufpuffer für die Gelelektrophorese. Um eine 50-fach TAE-Puffer kombiniert 2,0 M Tris-Acetat mit 0,05 M Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und den pH-Wert auf 8,5. </li><li> Eine 1% (Gewicht / Volumen) Agarosegel durch Auflösen von 10 g Ultra Agarose in 1 l 1x TAE-Puffer und Schmelzen der Agarose mit einem herkömmlichen Mikrowellenofen. Sobald es auf 50 ° C abgekühlt, mit 1 ml 1,000x Ethidiumbromid zu der 1% igen Agarosegel solution, mischen durch vorsichtiges Schütteln oder durch Umdrehen in einem geschlossenen Behälter, dann gießen Sie die Agarose-Lösung in ein Gel-Casting-Plattform und lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur fest werden. HINWEIS: Ethidiumbromid ist ein Mutagen und potenziellen Karzinogen. Handschuhe und Lösungen vorsichtig handhaben. Für diese entsprechend gehandhabt Ethidiumbromid finden Sie unter: <a href="http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667">http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</a> . </li><li> Nachdem das Gel erstarrt ist, legen Sie die Set-Gel in die Elektrophorese-Tank. Fügen Sie genug TAE-Puffer, um das Gel zu decken, bis die Vertiefungen eingetaucht sind. Prüfen, ob der Pegel des TAE-Puffer ist ungefähr 1 mm über dem Niveau des Gels. Entfernen Sie das Gel Kamm. HINWEIS: Entfernen Sie den Kamm nach Brunnen getaucht werden verhindert, dass Luftblasen aus, die in den Vertiefungen eingeklemmt. </li><li> Bereiten Sie die RNA-Proben. Kombinieren Sie 1 ul jeder gereinigten Probenaliquot mit 1 ul Gelladepuffer (oder mit 1 ul 10x Ladepuffer und verded auf 10 ul mit Nuklease-freies Wasser) und gründlich mischen durch Auf-und Abpipettieren mit einer Mikropipette. HINWEIS: 10x Ladepuffer enthält 20% Ficoll 400, 0,1 M Na 2 EDTA, pH 8,0, 1,0% SDS, 0,25% Bromphenolblau. 0,25% Xylencyanol kann auch der Ladepuffer 42 hinzugefügt werden, wie es läuft ~ 50% so schnell wie Bromphenolblau und kann für die Überwachung sehr lange Läufe nützlich sein. </li><li> Laden des Gels mit jeder Probe durch vorsichtiges Pipettieren der Lösung in den Boden jeder Vertiefung. Achten Sie darauf, alle Luftblasen zu verlassen oder mischen Proben zwischen den Wells. Hinweis: eine RNA-Leiter können ebenfalls verwendet werden, um die Größe des Transkripts zu bestimmen. </li><li> Bringen Sie die Kabel so, dass die DNA wird in das Gel zur positiven Leitung migrieren. Die Spannung auf den gewünschten Wert, typischerweise 1 bis 10 V / cm Gel. Die Elektrophorese für wie lange reicht für signifikante Trennung zwischen den RNA-Fragmente, mit der Migration von Farbstoffen, um das Fortschreiten der Trennung zu überwachen. NHINWEIS: Ein 23 cm x 25 cm Gel bei 250 V dauert ca. 1 Stunde, während ein 8 cm x 8 cm Gel bei 150 V wird ca. 20 Minuten dauern. Kleinere RNA-Fragmente haben eine bessere Auflösung als bei höheren Spannungen führen. </li><li> Schalten Sie die Stromversorgung, wenn der Farbstoff aus der Ladepuffer eine Strecke als ausreichend für die Trennung zwischen den RNA-Fragmente migriert. </li><li> Bild der RNA unter UV-Licht als Ethidiumbromid fluoreszieren. </li><li> Machen Sie ein Foto des Bildes und vergleichen Fluoreszenzintensitäten der gereinigte RNA von jeder Bedingung. </li></ol> 4. RNA-Quantifizierung mittels UV-Vis-Spektroskopie <ol><li> Platz 2 ul H 2 O auf einem Nanodrop 2000 oder ähnliche Maschine, und messen Sie den Blank. </li><li> Als nächstes legen 2 ul von jeder RNA-Probe, nach der Reinigung, im Spektralphotometer gemessen werden UV-Vis aus einem Wellenlängenbereich von 200 nm bis 800 nm. HINWEIS: Ein A ​​260 Lesung von 1,0 entspricht etwa 40 ug / ml RNA,und reine RNA hat eine A 260 / A 280-Verhältnis von 2,1. 45 </li><li> In dem Fall, daß die Absorption über 1 OD, verdünnt den Proben in Nuklease-freies Wasser bis zu einer OD von weniger als 1 zu erhalten. </li><li> Verwenden Sie grafische Software, um die verschiedenen Proben des Grundstückes und vergleichen OD bei 260 nm. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Dieser Test zeigt, dass die Zugabe von Ga (tpfc) inhibiert RNA Transkriptions vergleichsweise zu bekannten DNA-bindenden Antikrebs Komplexe Actinomycin D und Triptolid. Die zytotoxische Verhalten von Ga (tpfc) (GI 50 = 58,1 bis 154,7 uM) kann seine hemmenden Eigenschaften zurückzuführen. Da kein Transkriptionshemmung in tpfc beobachtet wird, ist die Zytotoxizität tpfc aufgrund RNA Transkriptionshemmung aber durch andere Mittel noch nicht untersucht verursacht. In den vier Trans...

Chemotherapie beinhaltet oft Breitspektrum cytotoxischen Mitteln mit unerwünschten Nebenwirkungen und begrenzten Ausrichtung, aber mit einem besseren Verständnis der Krebsbiologie, gibt es eine ständig steigende Nachfrage nach Antikrebsmitteln mit höheren krebs Targeting Wirksamkeit und weniger Nebenwirkungen. 1 Humankrebszellen werden häufig 2 somit von einem einzigen aktiviert oder überexprimiert Onkogen für das Überleben., viele Krebsmedikamenten durch ihre Fähigkeit, die RNA-Transkription zu inhibieren. Behandlungen, die die Expression dieser Gene zu blockieren Transformation sind wirksam bei der Beseitigung von Krebszellen und führen zu Zelltod. 3 Transformierte Zellen sind empfindlicher gegenüber Störungen in der RNA-Transkription als auch entsprechende normale Zellen. 4 Medikamente gegen Krebs, welche die Transkription hemmen sollen selektiv gehemmt Expression der Onkogene, die notwendig für die Krebszelle, um zu überleben. 5 Folglich RNA Transkription inhibition ist eine nützliche Methode, um mögliche Krebsmedikamentenkandidaten zu identifizieren und mehr über ihre Wirkungsweise. Dieses Protokoll zeigt, dass Ga (tpfc) hemmt die RNA-Transkription auf der gleichen Reihenfolge wie die Chemotherapeutika Actinomycin D und Triptolid; ähnliche Vergleiche können mit diesem Protokoll mit anderen Krebsmedikamentenkandidaten durchgeführt werden. Actinomycin D ist ein RNA-Transkriptionsinhibitor häufig verwendet, um Schwangerschafts trophoblastic Krebs, Hodenkrebs, Wilms-Tumor, rhabdomyosacoma behandeln und Ewing-Sarkom 6. Actinomycin D wurde in der Krebstherapie fast fünfzig Jahre lang verwendet worden, da sie erstmals von der FDA zugelassenen 1964.Triptolide ist ein selektiver Inhibitor der Transkription, die in vitro und in verschiedene tumortragenden Tiermodelle für 30 Jahre untersucht worden ist. 7 Die amphiphile Natur der makrozyklischen Corrolen vermittelt wesentliche Vorteile gegenüber anderen Substanzklassen, wie kleine Moleküle oder biologischens. 8-14 makrocyclischen Charakter ermöglicht Zellpermeabilität, die größer ist als für solche großen Moleküle erwarten ist, und dass sie groß genug ist, um mit makromolekularen Oberflächen, wie jene von Proteinen in Wechselwirkung treten können. 8 Corrole bekannt, um enge kovalente Komplexe mit Biomolekülen zu bilden und Arzneimitteln. 10 zusätzlich zu der inhärenten Cytotoxizität des Corrol Rahmen haben wir gezeigt, daß ein sulfoniertes Corrol wirkt als Trägermolekül für chemotherapeutische Mittel, insbesondere die DNA-interkalierende Anthracyclin Doxorubicin. Wenn das sulfonierte Corrol wurde mit Doxorubicin verabreicht wurde eine 3-fache Steigerung in der IC 50 von Doxorubicin für DU-145-Zellen beobachtet. 9 Corrol Rahmen ist stabil und hat inhärente Absorption und Fluoreszenz-Eigenschaften, die, wenn funktionalisierte laufen einzigartige Absorptionsschichten das kann für die Charakterisierung verwendet werden. 10 Funktionalisierung des Gerüsts nicht von Natur aus affect die photophysikalischen Eigenschaften des Corrol, 9-15, aber, wie mit einem sulfonierten Corrol gesehen, selektiven Modifizieren der Rahmen des Corrol seine biologischen Eigenschaften wesentlich zu verändern. 16. Wir haben bereits ausgewertet sechs metallocorroles gegen sieben menschlichen Krebszelllinien. Die Ergebnisse zeigen, dass eine Toxizität gegenüber menschlichen Krebszellen ist abhängig von der spezifischen Metallionen sowie funktionelle Gruppe Substitution. Zum Beispiel sulfonierte Gallium Corrole erfahren hohe zelluläre Aufnahme und drang selektiv in den Kern der Gehirn metastatischen Prostatakrebszellen (DU-145); die gleiche Corrol, obwohl es nicht in den Kern der anderen Zelllinien durchdringen, weist höhere Zytotoxizität für Brustkrebs (MDA-MB-231), Melanom (SK-MEL-28) und Eierstock- (OVCAR-3) Krebszellen als für Prostatakrebs. 9 Erste Tests auf Zellbasis zeigen, dass diese Verbindungen zeigen Versprechen als Anti-Krebs-Therapeutika, welche furth Verdiensteer Untersuchung des Wirkmechanismus. Transkriptionshemmung mit bestimmten organometallischen Komplexen 17-27 beobachtet, und man versucht, diesen Prozess als ein möglicher Mechanismus für die zytotoxische Verhalten des Corrol Familie untersuchen. Diese Transkriptions-Assay bietet eine einfache, kostengünstige und einfache Methode zur Beurteilung der Inhibierung der Transkription, was mehr detaillierte Informationen über die Wirkung dieser Moleküle in lebende Zellen führt. Hier wird die Transkription Hemmung von Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) und seine freie Base analogen 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc) (Figur 1) getestet. Anders als bei einigen Übergangsmetallkomplexe, (III) Gallium ist Redox inaktiv und wird daher nicht direkt in der Redox-Prozess des Redox-basierte Stoffwechselwegen beteiligt sind. 28. Unabhängig, Gallium (III) nicht aufweisen cytotoxischen Eigenschaften und ist für therapeutische Zwecke untersucht. Gallium ist die zweite vielversprechendsten Metall für Krebstherapeutika nach Platin und hat zahlreiche Studien und Untersuchungen unterzogen wurden; Nitrat und Chlorid Galliumsalzen wurden in klinischen Studien gegen Hepatom, Lymphom, Blasenkrebs und anderen Krankheiten untersucht worden. 29-34 Gallium (III) ist daher ideal für Anti-Krebs-Corrol Studien. Erste Daten zeigen, Ga (tpfc) und tpfc haben einen niedrigen GI-50, die Drogenkonzentration notwendig, 50% der maximalen Zellproliferation zu hemmen, mit verschiedenen Krebszelllinien (siehe Abbildung 2); Dies bekräftigt die Gültigkeit der weiteren Experimenten auf diesen beiden Verbindungen, ihre hemmende Eigenschaften zu bestimmen. Vergleicht man diese Verbindungen mit den gemeinsamen Krebsmedikamente Actinomycin D und Triptolid. Actinomycin D Interkalate DNA inhibiert RNA Dehnung und induziert Apoptose in bestimmten Zelllinie bei picomolaren Konzentrationen 6,35-37 Triptolid wurde gezeigt, dass das Tumorwachstum zu hemmen. es um Menschen XPB / ERCC3, eine Untereinheit o bindetf Transkriptionsfaktor TFIIH, was zur Hemmung der RNA-Polymerase II-Aktivität. 6-7,38-40 Während es allgemein bekannt ist, dass Corrole aufweisen cytotoxischen Eigenschaften besteht wenig Informationen über die verschiedenen Mechanismen, die aus Funktionalisierung. Corrol Hemmung der RNA-Transkription würde einen besseren Einblick auf ihre Wechselwirkungen mit Biomakromolekülen bieten. Andere Komplexe bekannt, an DNA zu binden, wie dirhodium (II, II) -Komplexe, Chrom (III) Komplexe, Ruthenium (II) Polypyridylkomplexe, Rhodium (III) -Komplexe und verschiedene andere, wurden die RNA-Transkriptionstests unterworfen, 18- 27 was zu mehr Verständnis für ihre Interaktionen mit Biomakromolekülen. Diese einfache und weithin verfügbar Experiment ist auch ein guter erster Test, um die Zytotoxizität Eigenschaften eines Moleküls zu bewerten und festzustellen, ob es verdient eine weitere biologische Tests. Das RNA-Transkriptionsassay ermöglicht auch viele Modifikationen, wie varying die Menge einer Verbindung oder Enzymen verwendet wird; Variieren der Inkubationszeit, der Reaktionszeit und der Probenzeitpunkten; und Verändern der DNA-Matrize Länge und Sequenz, unter anderen Variablen von Interesse, wodurch potenziell eine große Menge von Daten. Diese Transkriptions Assay ist auch leicht erschwinglich Kits mit allen vorgesehenen notwendigen Reaktionskomponenten zur Verfügung, obwohl Komponenten können gekauft und individuell vorbereitet werden. In diesen Experimenten verwenden wir eines kommerziell erhältlichen Kits bekannt, hohe Ausbeute zu haben. 41 Transkription Hemmung beurteilen, nutzen wir zwei Methoden: Agarose-Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie. Agarose-Gel-Elektrophorese ist ein einfaches und effektives Verfahren zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von 0,5-bis 25-kb-DNA und RNA-Fragmente. 42 UV-Vis-Spektroskopie kann verwendet werden, um die Konzentration und Reinheit der RNA zu bestimmen. 43

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="809">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:219px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Actinomycin D</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A1410</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triptolide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3652</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , protect from light</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">nuclease-free H2O&#160;</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEGAscript T7 Transcription Kit</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">AM1334</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Ethidium Bromide</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E7637</td>
			<td>CAUTION: For proper handling procedures of ethidium bromide, please see: http://www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9927667</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">Tris Acetate</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T6025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td>
			<td style="width:219px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">EDS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">UltraPure Agarose</td>
			<td style="width:219px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">16500-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">mini Quick Spin RNA Columns</td>
			<td style="width:219px;">Roche Life Science</td>
			<td align="right" style="width:119px;">11814427001</td>
			<td>Store at 2-8 &#176;C , do not freeze</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:305px;">1 kb DNA Ladder</td>
			<td style="width:219px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">N3232S</td>
			<td>Store at &#8211;20 &#176;C&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro enzymatic assay to measure transcription inhibition by gallium(iii) and h3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

Chemotherapie oft mit Breitspektrum-zytotoxischen Substanzen mit vielen Nebenwirkungen und begrenzte Targeting. Corrolen sind eine Klasse von Tetrapyrrol-Makrozyklen, die Differenz zytostatische und zytotoxische Eigenschaften in bestimmten Zelllinien, abhängig von der Identität des chelatisierten Metall und funktionelle Gruppen aufweisen. Die einzigartige Verhalten von funktionalisierten Corrole auf bestimmte Zelllinien wird die Möglichkeit der gezielten Chemotherapie. Viele Krebsmedikamente sind durch ihre Fähigkeit, die RNA-Transkription zu inhibieren. Hier stellen wir einen Schritt-für-Schritt-Protokoll für die RNA-Transkription in Gegenwart von bekannten und potentiellen Inhibitoren. Die Bewertung der RNA-Produkte der Transkriptionsreaktion durch Gelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie liefert Informationen über hemmende Eigenschaften potentieller Antikrebsarzneimittelkandidaten und mit Modifikationen an der Assay mehr über deren Wirkmechanismus. Wenigwird über den molekularen Wirkmechanismus von Corrol Zytotoxizität bekannt. In diesem Experiment betrachten wir zwei Corrol Verbindungen: Gallium (III) 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (Ga (tpfc)) und freien Base analogen 5,10,15- (tris) pentafluorophenylcorrole (tpfc). Ein RNA-Transkriptionsassay wurde verwendet, um die hemmenden Eigenschaften der Corrole untersuchen. Fünf Transkriptionsreaktionen wurden hergestellt: [template DNA-Basen] Verhältnis von 0,01 sind, und einer unbehandelten Kontrolle: mit Actinomycin D, Triptolid, Ga (tpfc) tpfc an einem [komplexen] behandelte DNA. Die Transkriptionsreaktionen wurden nach 4 h unter Verwendung von Agarosegelelektrophorese und UV-Vis-Spektroskopie analysiert. Es ist klar, Hemmung durch Ga (tpfc), Actinomycin D und Triptolid. Das RNA-Transkriptionsassay kann modifiziert werden, um mehr mechanistischen Detail durch Variieren der Konzentrationen des Antikrebs-Komplex, DNA oder Polymeraseenzym bereitstellen, oder durch Inkubieren der DNA-Polymerase oder mit dem complexes vor der RNA-Transkription; Diese Modifikationen würden zwischen einer Hemmung Mechanismus mit der DNA oder das Enzym unterscheiden. Zugabe des Komplexes nach der RNA-Transkription verwendet werden, um zu testen, ob die Komplexe zersetzen oder hydrolysiert das RNA ist. Dieser Assay kann auch verwendet werden, um zusätzliche Antikrebskandidaten zu untersuchen.

RNA Transcription qualitativ durch Agarosegelelektrophorese Beurteilt Agarosegelelektrophorese wird zur Abbildung der transkribierten RNA. Ethidiumbromid fluoresziert bei der Bindung (λ em = 605 nm, λ ex = 210 nm, 285 nm) 46 ermöglicht Abbildung von RNA. Dunkler Banden im Gel entsprechen höheren Konzentrationen von RNA. Wenn Actinomycin D inhibiert Triptolid oder entweder Corrol komplexen RNA-Transkription ist die Produktion von RNA reduz...

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An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole und seine Freebase analogen aufweisen niedrigen mikromolaren Zell-Zytotoxizität. Diese Handschrift beschreibt ein RNA-Transkriptionsreaktion, Imaging-RNA mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel und Quantifizierung RNA mit UV-Vis-Spektroskopie, um die Transkription Hemmung durch Corrolen bewerten und zeigt eine einfache Methode zur Bewertung Krebskandidat Eigenschaften.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Enzymatic Assay zur Transcription Hemmung durch Gallium (III) und H messen<sub&gt; 3</sub&gt; 5,10,15-tris (pentafluorphenyl) Corrole

Chemotherapy often involves broad-spectrum cytotoxic agents with many side effects and limited targeting. Corroles are a class of tetrapyrrolic ...

an-vitro-enzymatic-assay-to-measure-transcription-inhibition

Research

JoVE Journal

Bioengineering

An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by Gallium(III) and H3 5,10,15-tris(pentafluorophenyl)corroles

11.5K Aufrufe.  California Institute of Technology.  Gallium (III) 5,10,15- (Tris) pentafluorophenylcorrole und seine Freebase analogen aufweisen niedrigen mikromolaren Zell-Zytotoxizität. Diese Handschrift beschreibt ein RNA-Transkriptionsreaktion, Imaging-RNA mit einem Ethidiumbromid-gefärbten Gel und Quantifizierung RNA mit UV-Vis-Spektroskopie, um die Transkription Hemmung durch Corrolen bewerten und zeigt eine einfache Methode zur Bewertung Krebskandidat Eigenschaften. 

Serie: An In Vitro Enzymatic Assay to Measure Transcription Inhibition by GalliumIII and H3 5,10,15-trispentafluorophenylcorroles

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Forschung

Biotechnik

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Test auf Augenreizung (EIT) zur Kennzeichnung der Gefahr von Augen Reizt Chemicals mit rekonstruierter menschlicher Hornhaut-ähnlichen Epithelial (RhCE) Gewebemodell

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic physiological tear volumes.7 The traditional model also lacks the natural tear flow component and the blinking reflex, both of which are defining factors of the ocular environment. The development of a novel model is described in this study, which consists of a unique 2-piece design, eyeball and eyelid piece, capable of mimicking physiological tear volume. The models are created from 3-D printed molds (Polytetrafluoroethylene or Teflon molds), which can be used to generate eye models from various polymers, such as polydimethylsiloxane (PDMS) and agar. Further modifications to the eye pieces, such as the integration of an explanted human or animal cornea or human corneal construct, will permit for more complex in vitro ocular studies. A commercial microfluidic syringe pump is integrated with the platform to emulate physiological tear secretion. Air exposure and mechanical wear are achieved using two mechanical actuators, of which one moves the eyelid piece laterally, and the other moves the eyeballeyepiece circularly. The model has been used to evaluate CLs for drug delivery and deposition of tear components on CLs.

Development of an In Vitro Ocular Platform to Test Contact Lenses

Current in vitro models for evaluating contact lenses (CLs) and other eye-related applications are severely limited. The presented ocular platform simulates physiological tear flow, tear volume, air exposure and mechanical wear. This system is highly versatile and can be applied to various in vitro analyses with CLs.

Entwicklung eines<em&gt; In Vitro</em&gt; Ocular Platform Kontaktlinsen zu Test

Currently, in vitro evaluations of contact lenses (CLs) for drug delivery are typically performed in large volume vials,1-6 which fail to mimic ...

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and dampen loads in the spine. The IVD consists of a proteoglycan-rich nucleus pulposus (NP) and a collagen-rich annulus fibrosis (AF) sandwiched by cartilaginous end-plates. Together with the adjacent vertebrae, the vertebrae-IVD structure forms a functional spine unit (FSU). These microstructures contain unique cell types as well as unique extracellular matrices. Whole organ culture of the FSU preserves the native extracellular matrix, cell differentiation phenotypes, and cellular-matrix interactions. Thus, organ culture techniques are particularly useful for investigating the complex biological mechanisms of the IVD. Here, we describe a high-throughput approach for culturing whole lumbar mouse FSUs that provides an ideal platform for studying disease mechanisms and therapies for the IVD. Furthermore, we describe several applications that utilize this organ culture method to conduct further studies including contrast-enhanced microCT imaging and three-dimensional high-resolution finite element modeling of the IVD.

An In Vitro Organ Culture Model of the Murine Intervertebral Disc

Whole organ culture of the intervertebral disc (IVD) preserves the native extracellular matrix, cell phenotypes, and cellular-matrix interactions. Here we describe an IVD culture system using mouse lumbar and caudal IVDs in their functional spinal units and several applications utilizing this system.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Organ Culture Modell der Murine Bandscheiben

Intervertebral disc (IVD) degeneration is a significant contributor to low back pain. The IVD is a fibrocartilaginous joint that serves to transmit and ...

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver engineering, including in vivo organ decellularization followed by repopulation, has emerged as a promising approach over ex vivo liver engineering. However, postoperative survival was not achieved. The aim of this study is to develop a novel surgical technique of in vivo selective liver lobe perfusion in rats as a prerequisite for in vivo liver engineering. We generate a circuit bypass only through the left lateral lobe. Then, the left lateral lobe is perfused with heparinized saline. The experiment is performed with 4 groups (n = 3 rats per group) based on different perfusion times of 20 min, 2 h, 3 h, and 4 h. Survival, as well as the macroscopically visible change of color and the histologically determined absence of blood cells in the portal triad and the sinusoids, is taken as an indicator for a successful model establishment. After selective perfusion of the left lateral lobe, we observe that the left lateral lobe, indeed, turned from red to faint yellow. In a histological assessment, no blood cells are visible in the branch of the portal vein, the central vein, and the sinusoids. The left lateral lobe turns red after reopening the blocked vessels. 12/12 rats survived the procedure for more than one week. We are the first to report a surgical model for in vivo single liver lobe perfusion with a long survival period of more than one week. In contrast to the previously published report, the most important advantage of the technique presented here is that perfusion of 70% of the liver is maintained throughout the whole procedure. The establishment of this technique provides a foundation for in vivo partial liver engineering in rats, including decellularization and recellularization.

A Novel Surgical Technique As a Foundation for In Vivo Partial Liver Engineering in Rat

We establish a novel surgical technique for an in vivo single liver lobe perfusion model in rat as a prerequisite for further studying in vivo partial liver engineering in the future.

Eine neuartige Operationstechnik als Grundlage für In Vivo teilweise Leber Engineering in der Ratte

Organ engineering is a novel strategy to generate liver organ substitutes that can potentially be used in transplantation. Recently, in vivo liver ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Gentranskription durch Umleiten zellulären Maschinerie mit chemischen epigenetische Modifikatoren zu unterdrücken

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.

Nachweis von Endotoxin im Nano-Rezepturen mit Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause ...

An Automated Method to Perform The In Vitro Micronucleus Assay using Multispectral Imaging Flow Cytometry

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and introduces uncertainty in results due to variability between scorers. To remedy this, automated slide-scanning microscopy as well as conventional flow cytometry methods have been introduced in an attempt to remove scorer bias and improve throughput. However, these methods have their own inherent limitations such as inability to visualize the cytoplasm of the cell and the lack of visual MN verification or image data storage with flow cytometry. Multispectral Imaging Flow Cytometry (MIFC) has the potential to overcome these limitations. MIFC combines the high resolution fluorescent imagery of microscopy with the statistical robustness and speed of conventional flow cytometry. In addition, all collected imagery can be stored in dose-specific files. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the MN assay on MIFC. Human lymphoblastoid TK6 cells were enlarged using a hypotonic solution (75 mM KCl), fixed with 4% formalin and the nuclear content was stained with Hoechst 33342. All samples were run in suspension on the MIFC, permitting acquisition of high resolution images of all key events required for the assay (e.g. binucleated cells with and without MN as well as mononucleated and polynucleated cells). Images were automatically identified, categorized and enumerated in the MIFC data analysis software, allowing for automated scoring of both cytotoxicity and genotoxicity. Results demonstrate that using MIFC to perform the in vitro MN assay allows statistically significant increases in MN frequency to be detected at several different levels of cytotoxicity when compared to solvent controls following exposure of TK6 cells to Mitomycin C and Colchicine, and that no significant increases in MN frequency are observed following exposure to Mannitol.

The in vitro micronucleus assay is a well-established method for evaluating genotoxicity and cytotoxicity but scoring the assay using manual microscopy is laborious and suffers from subjectivity and inter-scorer variability. This paper describes the protocol developed to perform a fully automated version of the assay using multispectral imaging flow cytometry.

Eine automatisierte Methode zur Durchführung des In-Vitro-Mikrokern-Assays mit multispektraler Bildflusszytometrie

The in vitro micronucleus (MN) assay is often used to evaluate cytotoxicity and genotoxicity but scoring the assay via manual microscopy is laborious and ...

Standardized and Scalable Assay to Study Perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current in vitro screening models that have sufficient throughput only have limited physiological relevance, which hinders the translation of findings from in vitro to in vivo. On the other hand, microfluidic cell culture platforms have shown unparalleled physiological relevancy in vitro, but often lack the required throughput, scalability and standardization. We demonstrate a robust platform to study angiogenesis of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells (iPSC-ECs) in a physiological relevant cellular microenvironment, including perfusion and gradients. The iPSC-ECs are cultured as 40 perfused 3D microvessels against a patterned collagen-1 scaffold. Upon the application of a gradient of angiogenic factors, important hallmarks of angiogenesis can be studied, including the differentiation into tip- and stalk cell and the formation of perfusable lumen. Perfusion with fluorescent tracer dyes enables the study of permeability during and after anastomosis of the angiogenic sprouts. In conclusion, this method shows the feasibility of iPSC-derived ECs in a standardized and scalable 3D angiogenic assay that combines physiological relevant culture conditions in a platform that has the required robustness and scalability to be integrated within the drug screening infrastructure.

This method describes the culture of iPSC-derived endothelial cells as 40 perfused 3D microvessels in a standardized microfluidic platform. This platform enables the study of gradient-driven angiogenic sprouting in 3D, including anastomosis and stabilization of the angiogenic sprouts in a scalable and high-throughput manner.

Standardisierter und skalierbarer Assay zur Untersuchung perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Pre-clinical drug research of vascular diseases requires in vitro models of vasculature that are amendable to high-throughput screening. However, current ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

Erweiterte 3D-Lebermodelle für In-vitro-Genotoxizitätstests nach langfristiger Nanomaterial-Exposition

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...