Dr. P. Lindström ist für die Bereitstellung ob / ob Mäusen bestätigt. J. Lehtonen ist für die Unterstützung bei Video-Produktion und J. Gilbert für die Hilfe bei Bearbeitung anerkannt. (JS und: Diese Studie wurde durch Zuschüsse aus dem Diabetes Research Institute Foundation (AP), der Juvenile Diabetes Research Foundation (AP and UA), der Europäischen Kommission (. CP-IP 228933-2 FP-7, Zuschussvereinbarung no) unterstützt UA), die Kempe Foundations, Umeå University und dem schwedischen Forschungsrat UA

Ein. Probenvorbereitung und Scanning 1,1 Probenvorbereitung Das folgende Verfahren wird im Wesentlichen wie zuvor beschrieben 7 durchgeführt. <ol><li> Ernten die Bauchspeicheldrüse. Verwenden eiskaltem PBS gegen proteolytischen Abbau zu vermeiden. </li><li> Fixierung des Gewebes in 4% PFA in PBS auf Eis für 2-3 Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Lappen sind während der Fixierung &quot;ausgebreitet&quot; werden. Dies erleichtert Identifikation von anatomischen Landmarken nach dem Wiederaufbau. </li><li> Waschen über PBS für 30 min. </li><li> Entwässern der Bauchspeicheldrüse stufenweise in Methanol (33, 66%, 100%), 15 min / Schritt. Dies minimiert die Bildung von Blasen beim Bleichen (siehe Schritt 5) und verhindert Zell-Zerstörung im Gefrier-Auftau (siehe Schritt 7). </li><li> Inkubieren des Gewebes in frisch hergestelltem MeOH: H 2 O 2: DMSO Bleichen Puffer in einem Verhältnis 02.01.03 bei RT für 24 h, um endogene Gewebefluoreszenz quenchen. Für größere Proben, Austausch, neue bleaching-Puffer und Inkubation für weitere 24 Stunden. </li><li> Waschen über MeOH, ON. </li><li> Gefrier-Tau für mindestens 5 Zyklen in -80 ° C - RT, um Antikörper Durchdringung zu erleichtern. </li><li> Rehydrieren schrittweise zurück zu TBST (33, 66%, 100%), 15 min / Schritt. </li><li> Block in TBST mit 10% Serum (vorzugsweise von der gleichen Spezies, in dem der sekundäre Antikörper generiert wurde), 5% DMSO und 0.01% naaz für 12-24 h bei RT </li><li> Inkubieren mit primären Antikörpern in Blocking-Puffer für 48 Stunden bei RT bis 72 hr für größere Proben (hier verwendeten Antikörper sind in der Tabelle aufgeführt von Reagenzien) erstrecken. </li><li> Waschen über TBST, ON. </li><li> Inkubieren mit fluoreszierend konjugierten Sekundärantikörper für 48 h bei RT bis 72 h für größere Proben zu verlängern. </li><li> Waschen über TBST, ON. </li></ol> 1,2 Das folgende Verfahren beschreibt, wie die Probe in Agarose montieren und verbinden Sie es mit der maßgeschneiderten Probenhalter (siehe Abbildung 7) Vor dem Scannen entscheiden. <ol><li> Trennen Sie die Milz, Zwölffingerdarm und Magen-Lappen nach 3A in Hörnblad et al Abbildung 3. Die Beziehung zwischen den Lappen wird in Hörnblad et al 11 verdeutlicht. </li><li> Planen 1,5% (w / v) Agarose mit niedriger Schmelztemperatur in dH 2 O, Filter, lassen auf 37 ° C abkühlen und spült das Gewebe in dH 2 O abzuwaschen das Waschmittel und Blasen zu entfernen, bevor Agarose-Einbettung auf Eis. </li><li> Ausschneiden eines Agarose-Block umschließende Ihre Probe und hinterlassen ein ~ 1 cm Abstandshalter zwischen der Probe und dem Boden der Agarose. Trimmen scharfen Kanten (≤ 90 °) des Agaroseblock um Lichtstreuung zu reduzieren. </li><li> Dehydratisieren stufenweise die Probe in MeOH (33, 66%, 100%), so dass genügend Zeit, um zwischen jedem Schritt äquilibrieren. Wenn die Probe sinkt es gilt als äquilibriert. </li><li> Deaktivieren Sie die Probe in einer 1:2-Lösung von Benzyl Alcohol: Benzyl Benzoat (BABB), bis sie transparent wird. Börse BABB Lösung, Inkubation für eine zusätzliche 12 Stunden. </li><li> Positionieren Sie den geräumt Probe in den Probenhalter und sichern Sie sie, indem Sie 2 Nadeln durch die Agarose Abstandhalter über die Bohrungen in den Flanschen des Halters. </li><li> Legen Sie die Probe in den Scanner und tauchen sie in eine Küvette mit BABB Clearing-Lösung gefüllt. Beim Vergleich einer Reihe von Bauchspeicheldrüsen die gleiche Vergrößerung sollte für alle Scans verwendet werden. Die Vergrößerung sollte für die größte Probe in der Folge optimiert werden. </li></ol> 1,3 Positionierung der Probe unter dem AR Das folgende Protokoll beschreibt das Verfahren exakt zu positionieren eine Stichprobe mithilfe des COM-AR-Algorithmus. Dieses Verfahren ist nur anwendbar, wenn der ROI umfasst die gesamte Probe. Für eine detaillierte Beschreibung der Algorithmen finden Sie Cheddad et al 2. <ol><li> Erwerben Sie Bilder der Probe in zwei Positionen für both die Anatomie und Signalkanäle. Position 1 bei 0 ° (verbunden mit der X-Achse), Anzeigen des größten Projektionsfläche, und die Position 2 bei 90 ° (in Verbindung mit der Z-Achse). Wir sind mit dem GFP-Kanal, um die Anatomie zu visualisieren. </li><li> Übernehmen die Erwartung Maximierung (EM) Algorithmus auf die Anatomie Bilder Schwelle des ROI. </li><li> Berechne die COM Punkte (x-Koordinaten) der binären Bilder in Schritt 2 sowohl für die 0 ° und 90 ° Vorsprünge erhalten. </li><li> Überlagern eine vertikale Linie, die durch den identifizierten COM Punkt in Schritt 3 auf der 0 ° und 90 °-Bilder des Signals Kanal berechnet. </li><li> Verwenden Sie die Bilder in Schritt 4 erworbenen verweist auf die Probe, so dass die Mittellinie des Field of View durch die gefundenen COM Punkte der Probe passiert bewegen. </li></ol> 1,4 Scanning <ol><li> Passen Belichtungszeiten das höchste Signal-Rausch-Verhältnis zu erzielen, ohne saturating alle Bereiche der Projektionsbilder. Wiederholen Sie dies für alle Kanäle gescannt werden. </li><li> Wählen Sie den Filter-Set für die erste Fluoreszenz-Kanal abgetastet werden. Emission von kürzeren λ Fluorophore können Fluorophore mit mehr λ erregen und dadurch zu bewirken, photo Bleichen. Um diese Gefahr zu minimieren, scannen Sie das Fluorophor mit der längsten Anregung λ erste. </li><li> Öffnen des Verschlusses, um die Probe zu beleuchten und sammelt das Fluoreszenzsignal über 360 ° Drehung der Probe entlang der vertikalen Achse für jeden Kanal. Der Schritt Winkel für die NIR-OPT-Setup verwendet wird, ist 0,9 ° und für die Bioptonics 3001 scanner 0,45 °. </li><li> Wählen Sie den entsprechenden Filter für die nächsten Kanal und weiter wie oben. </li></ol> 2. Computational Verarbeitung und Wiederaufbau 2,1 Post-Akquisition Versatz Erkennung und Korrektur (A-Wert tuning) In Projektionstomografie, ist es im Allgemeinen notwendig,eine post-Abgleichwert den Projektionen für die Feinabstimmung der Bilder entlang der Drehachse vor der Rekonstruktion zuweisen. Allerdings kann eine kleine Aberration in dem Winkel der Kamera in Richtung der optischen Achse ungleichmäßige A-Werte entlang der Länge der Probe verursachen und somit zu induzieren geometrische Verzerrungen. Um solche Verzerrungen zu vermeiden, kann eine rechnerische Methode, um die genaue und einheitliche post-Ausrichtung (A-Wert) in der gesamten Probe zu finden 2 angewendet werden. <ol><li> Verwenden einer diskreten Fourier-Transformation, um einen Vorsprung des spezifischen Signals bei 0 ° und 180 ° in acht Pixel Höhe Blöcke unterteilen und berechnen die Verschiebung entlang der x-Achse (A-Wert) zwischen jedem Block. </li><li> Anwenden einer linearen Regression der kleinsten Quadrate zu berechnen, um den Winkel θ &#39;, der die Neigung der X-Achse-Schicht entlang der Länge der Probe beschreibt, und einen Drehmittelpunkt zu finden. </li><li> Zu korrigieren Fehlstellungen während des Scannens durch Drehen alle projections θ &#39;/ 2 um den Drehmittelpunkt. </li></ol> 2,2 Kontrast begrenzte adaptive Histogrammentzerrung (CLAHE) Um die Erkennung und Segmentierung von Objekten (Inselchen) Aussteller sehr schwache Signale, die in Gefahr sind, um &quot;einem Schwellenwert out&quot; werden beim Wiederaufbau und / oder Segmentierung für quantitative Einschätzungen zu erleichtern, kann ein CLAHE Algorithmus auf die Projektionsfläche Bilder angewendet werden. Die CLAHE Betrieb mit zwei großen Intensität Transformationen durchgeführt: <ol><li> Der lokale Kontrast wird geschätzt und entzerrten innerhalb nichtüberlappende Blöcke in dem Projektionsbild. </li><li> Die Intensitäten werden dann an den Grenzregionen zwischen den Blöcken durch bilineare Interpolation normalisiert. </li></ol> Der Name kontraststeigernde begrenzten bezieht sich auf den Clip Grenze, die auf Sättigen Pixel in dem Bild zu vermeiden. In diesem Protokoll, das MATLAB eingebaute Funktion &quot;adapthisteq&quot; verwendet wurde und mit dem Standard-c angewendet<html> Lippe Grenze von 0,01 und eine Fliese von 256. Anmerkung, muss die optimale Kachelgröße empirisch getestet werden und kann je nach der Probe analysiert. Mehr Details über den Algorithmus und Beispiele finden Sie in Hörnblad et al 3 gefunden werden. Hinweis! Die oben aufgeführten Computational Verarbeitungsschritte (einschließlich COM-AR, A-Value-Tuning und CLAHE, siehe 1,3-2,2) werden auf Standard-Algorithmen gebaut und sind in MATLAB (Mathworks) ausgeführt. 2,3 tomographische Rekonstruktion und Iso-Oberflächen-Rendering <ol><li> Verwendung einer gefilterten Rückprojektion Algorithmus können die korrigierten und normierten Bilder nun mit einheitlichen Verlagerungsfähigkeit und minimale Erfordernis zur Optimierung des dynamischen Bereichs rekonstruiert werden. In diesem Protokoll werden alle Rekonstruktionen unter Verwendung der gefilterten Rückprojektion Verfahren verfügbar, bei dem NRecon Software (Skyscan), Version 1.6.8 durchgeführt (= &quot;_blank&quot;&gt; Http://www.skyscan.be/products/downloads.htm). Anmerkung hängt die Vergrößerung von einem abgebildeten Objekt auf seinen Abstand von dem Brennpunkt der Linse sofern Parallelstrahlgeometrie im Abbildungsstrahlengang Setup implementiert ist. Daher beim Importieren einer Projektionsdatensatz der NRecon Software ist es wichtig, das richtige Objekt zur Quelle (mm) und Drehrichtung des Scanners (für Gegenuhrzeigersinn Eingang &quot;cc&quot; und für Rechts-Eingang &quot;cw&quot;) in der begleitenden gehören Log-Datei, die Cone-Beam-induzierte Artefakte beim Wiederaufbau zu vermeiden. </li><li> Zur Visualisierung und Quantifizierung der Stapel virtuelle Schnitte erhalten, erzeugen 3D-Iso-Oberflächen mit geeigneten Bildverarbeitungssoftware wie Imaris oder Volocity. </li></ol> Murine Inselisolierung und Transplantationen wurden bei Präklinische Zelle das Diabetes Research Institute Verarbeitung und Translational Modell Kern unter Protokolle bewertet durchgeführt und von der University of Miami Institutional Animal Care und Use Committee. Die Ethikkommission für Tierversuche, Nordschweden, genehmigt alle anderen Experimente mit Tieren.

<ol>
	<li>Sharpe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography+as+a+tool+for+3D+microscopy+and+gene+expression+studies.">Optical projection tomography as a tool for 3D microscopy and gene expression studies.</a> Science. 296, 541-545 (2002).</li><li>Cheddad, A., Svensson, C., Sharpe, J., Georgsson, F., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+Assisted+Algorithms+for+Optical+Projection+Tomography.">Image Processing Assisted Algorithms for Optical Projection Tomography.</a> IEEE Trans. Med. Imaging. , (2012).</li><li>Hornblad, A., Cheddad, A., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+protocol+for+optical+projection+tomography+imaging+reveals+lobular+heterogeneities+in+pancreatic+islet+and+beta-cell+mass+distribution.">An improved protocol for optical projection tomography imaging reveals lobular heterogeneities in pancreatic islet and beta-cell mass distribution.</a> Islets. 3, 204-208 (2011).</li><li>Holmberg, D., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+pancreas:+from+ex+vivo+to+non-invasive+technology.">Imaging the pancreas: from ex vivo to non-invasive technology.</a> Diabetologia. 51, 2148-2154 (2008).</li><li>Ahlgren, U., Gotthardt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+for+imaging+islets:+recent+advances+and+future+prospects.">Approaches for imaging islets: recent advances and future prospects.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 654, 39-57 (2010).</li><li>Sharpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+projection+tomography.">Optical projection tomography.</a> Annu. Rev. Biomed. Eng. 6, 209-228 (2004).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tomographic+molecular+imaging+and+3D+quantification+within+adult+mouse+organs.">Tomographic molecular imaging and 3D quantification within adult mouse organs.</a> Nat. Methods. 4, 31-33 (2007).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+imaging+of+islet-infiltrate+interactions+based+on+optical+projection+tomography+assessments+of+the+intact+adult+mouse+pancreas.">High-resolution three-dimensional imaging of islet-infiltrate interactions based on optical projection tomography assessments of the intact adult mouse pancreas.</a> J. Biomed. Opt. 13, 054070 (2008).</li><li>Alanentalo, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+Three-Dimensional+Imaging+of+the+Insulitis-Induced+Destruction+of+beta-Cells+in+Murine+Type+1+Diabetes.">Quantification and Three-Dimensional Imaging of the Insulitis-Induced Destruction of beta-Cells in Murine Type 1 Diabetes.</a> Diabetes. 59, 1756-1764 (2010).</li><li>Sun, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+AMP-activated+protein+kinase+alpha1+and+alpha2+from+mouse+pancreatic+beta+cells+and+RIP2.Cre+neurons+suppresses+insulin+release+in+vivo.">Ablation of AMP-activated protein kinase alpha1 and alpha2 from mouse pancreatic beta cells and RIP2.Cre neurons suppresses insulin release in vivo.</a> Diabetologia. 53, 924-936 (2010).</li><li>Hornblad, A., Eriksson, A. U., Sock, E., Hill, R. E., Ahlgren, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+spleen+formation+perturbs+morphogenesis+of+the+gastric+lobe+of+the+pancreas.">Impaired spleen formation perturbs morphogenesis of the gastric lobe of the pancreas.</a> PLoS One. 6, e21753 (2011).</li><li>Lindstr&#246;m, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology+of+the+Obese-Hyperglycemic+Mice+(ob/ob+Mice).">The physiology of the Obese-Hyperglycemic Mice (ob/ob Mice).</a> The Scientific World JOURNAL. 7, 665-685 (2007).</li><li>Bock, T., Pakkenberg, B., Buschard, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+background+determines+the+size+and+structure+of+the+endocrine+pancreas.">Genetic background determines the size and structure of the endocrine pancreas.</a> Diabetes. 54, 133-137 (2005).</li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Die beschriebenen Techniken für OPT Bildgebung ermöglicht die Extraktion von räumlicher und quantitativen Parameter über das gesamte Volumen des murinen Bauchspeicheldrüse. Aufgrund von Einschränkungen in erreichbare Auflösung für diese Art der bildgebenden mesoskopischen ist anzumerken, dass wie bei den meisten bildgebenden Verfahren, je größer die Probe je niedriger die Auflösung (Obwohl die Verwendung einer höheren Auflösung CCD sollte die Auflösung des OPT Scan erhöhen) . Daher ist für die Beurteilung der intakten Pankreas Maus Lappen, wird die Technik zur Zeit keine einzelne Zelle Auflösung obwohl schließen (ca. 15-20 um) 7. Doch für die Extraktion von BCM Verteilung in der Maus Bauchspeicheldrüse die Protokolle Daten, die mehr als gut übereinstimmen, die vom Zählen zB Punkt Morphometrie 3,13 erhaltenen Es sollte angemerkt werden, dass, obwohl vorgesehen Durchführung des CLAHE Protokoll ermöglicht zum Nachweis von signifikant mehr Inselchen Diese Inseln sind meist kleiner und nicht Beitragte im Wesentlichen den gesamten β-Zellen Bände. Die immunhistochemischen Protokollen beteiligt sind relativ lange (bis zu zwei Wochen), aber die eigentlichen Hände auf Zeit für die Probenvorbereitung ist kurz und somit die Technik ist gut für die Untersuchung von großen Kohorten von Tieren 9 geeignet. Wenn das Potential der heterogenen Verteilungsmuster ist ein Schwerpunkt für die Untersuchung, darauf hinzuweisen, dass Pflege in den Maßnahmen sollten ergriffen werden über Fixierung und Montage zu vermeiden, dass das Pankreasgewebe wird in ungünstiger Weise fixiert und eine flache (&quot;ausgebreitet&quot; werden ) mount des Gewebes sollte für solche Prüfungen erleichtern angestrebt werden. Ein wichtiger Punkt bei der Durchführung von OPT ist, dass die Probe COM an der Drehachse befestigt ist, und dass es nicht zu bewegen, entweder vertikal oder horizontal, während des Scanvorgangs. Daher ist es wichtig, eine stabile mechanische Aufbau und ein gut funktionierendes System zur attachi habenng der Probe. Wir lösten dieses Problem, indem er eine neue Halterung (Abbildung 7). Parallelgeometrie stimmte nicht für unsere NIR-OPT oder Bioptonics 3001-Scanner, der als vertikale Verschiebung zwischen der hinteren und vorderen Stellungen der peripheren Objekten in den Projektionsbildern aufgezeichnet erkannt wurde. Durch Einstellen des Objekts Source Abstand in der Log-Datei des jeweiligen Scanners (siehe 2.3.1) konnten wir deutlich verbessern die Qualität unserer Daten und korrigieren für geometrische Verzerrungen an den weit Kanten der Projektionsfläche Bilder, die von besonderer Bedeutung ist, wenn Beurteilung größeren Exemplaren. In dem aktuellen Protokoll, bieten wir einen Vorschlag von Filter-Sets, die Visualisierung von drei verschiedenen spezifischen Kanälen und einer &quot;Anatomie&quot;-Kanal bei der Beurteilung der intakten Pankreas Präparate ermöglichen. Offensichtlich sind diese Einstellungen können angepasst werden, um besser auf die Fluorochrome für eine gegebene Studie zwar genutzt, wie bei allen Formen der Fluoreszenzcent Mikroskopie, sollte die potenzielle Gefahr des Signals Durchbluten sorgfältig evaluiert werden. Die Studie von Insulin markierten Inselchen mit Fluorochromen, die oberhalb von 750 nm angeregt werden noch nicht von uns mit dem Metallhalogenidlampe dass unsere Einrichtung nutzt möglich. Es ist möglich, dass eine Kamera mit noch höheren Quantenausbeute in den entsprechenden Wellenlängen in Kombination mit alternativen Lichtquellen (zB Diodenlasern) könnte das Potential der NIR-OPT weiter steigern und damit zur Bildgebung bei noch höheren Wellenlängen. OPT-Bildgebung ist eine sehr vielseitige Technik zur räumlichen und quantitative Einschätzungen der biomedizinischen Probe auf dem mm-cm-Skala. Obwohl die hier präsentierten Protokolle für den Hauptzweck Bauchspeicheldrüse / Diabetesforschung entwickelt wurden sie sollte möglich sein, die Forschung an anderen Spezies, Probentypen und Marker zu übersetzen. Durch die Möglichkeit, mehrere verschiedene Kanäle in intakten Pankreas Vorbereitungen visualisieren, NIR-OPT Bildgebung feitere birgt das Potenzial als ein Werkzeug, um die Aufnahme Spezifität von Kontrastmitteln für die nicht-invasive Einschätzungen anderen bildgebenden Verfahren, solange diese Kontrastmittel gestalten könnte zu tragen auch eine Fluorophor nachweisbar OPT werden soll auszuwerten.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.
Protocol section 1.1 was changed from:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:H2O2:DMSO bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.
to:
Incubate the tissue in freshly prepared MeOH:DMSO:H2O2 bleaching buffer in a 2:1:3 ratio at RT for 24 hr to quench endogenous tissue fluorescence. For larger samples, exchange to new bleaching buffer and incubate for another 24 hr.

A correction was made to <a href="/video/50238">Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research</a>. In Protocol section 1.1, the order of the listed chemicals MeOH:H2O2:DMSO has accidentally been switched and should instead be MeOH:DMSO:H2O2.

Erratum: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Die Insulin produzierenden β-Zellen sind der Schlüssel für die Fähigkeit des Körpers, um den Blutzucker-Homöostase zu kontrollieren. Daher sind Einschätzungen von Pankreas BCM Vertriebs unbedingt viele Bereiche der prä-klinischen Diabetesforschung. In Auswertungen von therapeutischen Regimes zum Beispiel die Auswirkungen der gezielten Genablation auf endokrine Zelldifferenzierung oder Studien von Diabetes Ätiologie in Tiermodellen für die Krankheit oft auf solche Analysen ab. Traditionell sind diese Arten von Bewertungen, die auf zeitaufwendig stereologische Ansätze schwer aufgrund der Größe und komplexen anatomischen Konstitution des Pankreas führen sind verlassen. Die meisten hochauflösende Bildgebung Ansätze zur Zeit (in der Regel optisch), bieten keinen ausreichenden Eindringtiefe gesamte Bauchspeicheldrüse Bildgebung bei Nagetieren zu ermöglichen. Umgekehrt bieten bildgebenden Verfahren, die nicht durch ihre Eindringtiefe (typischerweise nuklearen) beschränken sich auf schlechte Auflösung, um die volle BCM Verteilung zu lösen und werden behindertdurch den Mangel an geeigneten Kontrastmittel 4,5. Optische Projektion Tomographie ist ein 3D-Bildgebungsverfahren, die hochauflösende Einschätzungen der biomedizinischen Proben können auf dem mm-bis cm-Skala 6. Hiermit können auch Informationen über die räumliche Lage und das Volumen des einzelnen Insulin exprimieren Langerhans-Inseln über das gesamte Volumen der Bauchspeicheldrüse in normalen und diabetischen Mäusen 3,7-10 extrahiert werden. Das Ziel der vorliegenden Studie ist zur weiteren Verbesserung der Fähigkeit dieser Technik für die Beurteilung von pankreatischen β-Zellen; ihrer endogenen Verteilung, wenn sie in anderen Geweben, ihrer Beziehung zu anderen Pankreas Bestandteile (wie infiltrierenden Zelltypen) und in größeren gepfropften Pankreas-Präparate als bisher möglich. Die Nah-Infrarot-optischen Projektion Tomographie (NIR-OPT) setup In der unten Protokolle, eine OPT-Scanner auf dem ursprünglichen Satz durch Sharpe beschriebenen Basis <em&gt; et al 1, angepasst, um Bildgebung im nahen Infrarotbereich wird beschrieben und eingesetzt. Für einkanalige Beurteilungen der Bauchspeicheldrüse der Maus (zB von BCM), kann der SkyScan 3001 (Bioptonics)-Scanner verwendet werden. Metallhalogenidlampe, die höher ist als Anregungsenergie einer Quecksilberbogenlampe bietet bei Wellenlängen über 650 nm, liefert das Anregungslicht. Das Licht wird durch eine Flüssigkeit Lichtleiter übertragen. Eine sinnvolle Kombination von Farbstoffen und Bandpass-Filter für NIR Fluoreszenz-Bildgebung und Kanaltrennung sind in Abbildung 3 dargestellt. Das emittierte Licht wird mit einer Rückseite beleuchtet CCD-Kamera detektiert, mit hohem Quantenwirkungsgrad im NIR-Spektrum. Das OPT Scannen automatisiert über eine LabView-Plattform, die die Kamera steuert und Schrittmotor. Proben, die in der Größe von intakten Ratten Pankreas, einem geschützten versilberten Spiegel und einem großen Küvette unterstützt wird. Schließlich wird ein Probenhalter, die beseitigt unerwünschte vertikale movements der Probe während der Untersuchung wurde entworfen.

<table border="1"><tbody><tr><td> Name des Reagenz / Material </td><td> Firma </td><td> Catalog Number </td><td> Kommentare </td></tr><tr><td> Methanol </td><td> Scharlau </td><td> ME03162500 </td><td></td></tr><tr><td> 30% H 2 O 2 </td><td> Scharlau </td><td> HI01362500 </td><td></td></tr><tr><td> Benzylalkohol </td><td> Scharlau </td><td> AL01611000 </td><td></td></tr><tr><td> Benzyl Benzoate </td><td> Scharlau </td><td> BE01851000 </td><td></td></tr><tr><td> Low-Schmelzpunkt Agarose </td><td> LONZA </td><td> 50100 </td><td></td></tr><tr><td> Paraformaldehyd (PFA) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 158127 </td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D5879 </td><td></td></tr><tr><td> Triton-X100 </td><td&gt; Sigma-Aldrich </td><td> T8787 </td><td></td></tr><tr><td> Mouse anti-Asma-Cy3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C6198 </td><td> Primärantikörpers </td></tr><tr><td> Rabbit anti-CD3 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7930 </td><td> Primärantikörpers </td></tr><tr><td> Guinea Pig anti-Ins </td><td> DAKO </td><td> A0564 </td><td> Primärantikörpers </td></tr><tr><td> Esel anti GP-IRDye680 </td><td> LI-COR Biosciences </td><td> 926-32421 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> Ziege anti Rb-DyeLight750 </td><td> Thermo Scientific </td><td> 35570 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> Ziege anti GP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11.076 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> Ziege anti GP-Alexa488 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11008 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> Ziege antiGP-Alexa594 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-11012 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> Ziege anti GP-Alexa680 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21.076 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> Ziege anti GP-Alexa750 </td><td> Molecular Probes </td><td> A-21.039 </td><td> Sekundärantikörpers </td></tr><tr><td> OPT Skyscan 3001 </td><td> Bioptonics </td><td></td><td> OPT-Scanner </td></tr><tr><td> Leica MZ FLIII </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td> Stereomikroskop </td></tr><tr><td> Leica Objektiv 0.5x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10446157 </td><td></td></tr><tr><td> Leica Camera Adapter 1.0x </td><td> Leica Microsystems </td><td> 10445930 </td><td></td></tr><tr><td> EL6000 Metal Halide </td><td></td><td> 11504115 </td><td> Lichtquelle </td></tr><tr><td> Liquid Light-Führer </td&gt; <td></td><td> 11504116 </td><td></td></tr><tr><td> Cuvette </td><td> Hellma Analytics </td><td> 6030-OG </td><td> 55 x 55 x 52,5 mm </td></tr><tr><td> Spiegel </td><td> Edmund Optics </td><td> F68-334 </td><td> 50 x 50 mm </td></tr><tr><td> Andor Ikon-M </td><td> Andor Technology </td><td> DU934N-BV </td><td> Back-illuminated CCD </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Technology </td><td> 41.021-MZFLIII </td><td> TXR, Alexa-594, Cy3 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Technology </td><td> 41.022-MZFLIII </td><td> IRDye680, Alexa-680 </td></tr><tr><td> Filterset </td><td> Chroma Technology </td><td> 49.037-MZFLIII </td><td> Dylight750, Alexa-750 </td></tr><tr><td> ProteinG-Sepharose-Kügelchen </td><td> GE Healthcare </td><td> 17-0618-01 </td><td> Protein G Sepharose 4 Fast Flow </td></tr><tr><td> Natriumazid </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 08591 </td><td> Natriumazid 0,1 M Lösung </td></tr></tbody></table>

near infrared optical projection tomography for assessments of &beta;-cell mass distribution in diabetes research

Durch Anpassung OPT, um die Fähigkeit der Bildgebung im nahen Infrarot (NIR)-Spektrum umfassen, wir hier zeigen die Möglichkeit, größere Körper Bild von Pankreasgewebe, wie Ratten Pankreas, und um die Anzahl von Kanälen (Zelltypen), die möglicherweise erhöhen in einer einzelnen Probe untersucht werden. Wir beschreiben die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen, die vorsehen: 1 / genaue Positionierung eines Prüflings (in unserem Fall die Bauchspeicheldrüse) Zentrum der Masse (COM) an der Rotationsachse (AR) 2, 2 / verbesserte Algorithmen zur Post Tuning-Ausrichtung, die geometrische Verzerrungen verhindert während der tomographischen Rekonstruktion 2 und 3 / ein Protokoll für Intensitätsangleichung um Signal-Rausch-Verhältnisse in OPT-basierte BCM Bestimmungen 3 zu erhöhen. Darüber hinaus beschreiben wir einen Probenhalter, die das Risiko für ungewollte Bewegungen der Probe minimiert während der Bildaufnahme. Zusammen ermöglichen diese Protokolle Einschätzungen der BCM Vertriebs-und other bietet, um im gesamten Volumen des intakten Pankreas oder in anderen Organen (zB in Studien von Inseltransplantation) durchgeführt werden, mit einer Auflösung bis auf die Ebene einzelner Langerhans-Inseln.

In dem aktuellen Bericht beschreiben wir ein Protokoll für die Extraktion und rechnerische Verarbeitung der BCM-Daten in Nagetier-Pankreas (und anderen Geweben) mit NIR-OPT (Abbildung 1). Wie in 2 dargestellt ist, wird Gewebe aus pankreatischen autofluorescense Probe erwartungsgemäß deutlich im NIR-Spektrum ab. Dies führt zu einem signifikanten Anstieg des mittleren Signal-Rausch-(S: N-Verhältnis) für die Beurteilung von Insulin markierten Langerhans-Inseln. Der von den Änderungen von OPT zur Bildgebung im NIR Bereich des Spektrums, wie hierin beschrieben, können mindestens drei spezifischen Kanälen visualisiert werden mit ausreichender S: N-Verhältnis, eine Prüfung der Antikörper markiert Zelltypen im gesamten Volumen des murinen Pankreas mit ausgeprägten ermöglichen Kanaltrennung (siehe Abbildung 3 und 4). Angewandt auf Bildgebung von diabetogenen Prozesse und / oder BCM-Einschätzungen im Allgemeinen die Technik ermöglicht somit zur Visualisierung und QuantifizierungInsulin-positive Bereiche in Bezug auf die Umgebung und / oder Interaktion Zelltypen (siehe Abbildung 4). Solche Erwägungen sind dank der erhöhten Gewebe Eindringtiefe in den NIR-Bereich möglich erhalten, um in viel größeren Proben als bisher, einschließlich der Ratte Bauchspeicheldrüse, die 3-5 mal größer als die Maus-Gegenstück (siehe Abbildung 5) ist durchzuführen. Unabhängig davon, ob sichtbar oder NIR-Wellenlängen eingesetzt werden, kann die Umsetzung der CLAHE wesentlich erleichtern OPT Assessments von BCM in verschiedenen genetischen und physiologischen Bedingungen durch die Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit der Technik (siehe Abbildung 6). Eine Blaupause für die entwickelten Probenhalter ist in Abbildung 7 dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig1.jpg" alt="Abbildung 1" /> Abbildung 1. Flussdiagramm, das die entscheidenden Schritte für OPT Analysen der BCM in der murine Bauchspeicheldrüse. Die erforderliche Zeit, um eine typische Maus Bauchspeicheldrüse beurteilen 13-14 Tage. Der Großteil der Zeit während Gewebeverarbeitung und immunhistochemische Färbung (10 Tage) verbraucht wird, benötigt Gewebe Lichtung etwa 2 Tage, während die Länge der Abtastung ist abhängig von der Einwirkzeit erforderlich (in der Regel ca. 1 h). Die anschließende Rechenverarbeitung wird typischerweise innerhalb eines Tages durchgeführt. Bemerkungen wird relativ langwierig Färbeprotokoll idealerweise für die Stapelverarbeitung von größeren Mengen an Proben. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2.jpg" alt="Abbildung 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Signal-Rausch-Verhältnisse für BCM Einschätzungen bei verschiedenen Wellenlängen. Eine Maus Zwölffingerdarm Pankreas lobe, für Insulin und mit einem Cocktail von Fluorochrom-konjugierten Sekundärantikörper (Alexa 488, 594, 680 und gefärbt750), wurde verwendet, um zu bestimmen S: N-Verhältnis bei unterschiedlichen Wellenlängen. A, Bilder zeigen den ersten Vorsprung Rahmen für jeden Signalkanal. B, graphische Darstellung der mittleren S: N für jeden Signalkanal. Die Verhältnisse wurden als der Mittelwert islet Intensität (bezogen auf 215 Inselchen) durch die Hintergrund-Intensität (die endogenes Gewebe Fluoreszenz aus dem exokrinen Gewebe) dividiert wird. C, Graph zeigt S: N-Verhältnisse für die einzelnen Inseln in jedem Kanal, normiert auf die S: N für die Alexa 594-Kanal erhalten. Ein Weg ANOVA wurde für statistische Auswertungen verwendet. Signifikanzniveaus angegeben entsprechen ** p &lt;0,01. Maßstab in (A) entspricht 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50238/50238fig2large.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen</a> . <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3.jpg" alt="Abbildung 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig3highres.jpg"/> Abbildung3. Kanaltrennung. Ein wurden Sekundärantikörper konjugiert mit AlexaFluor Farbstoffe in der Tabelle aufgeführten separat auf ProteinG-Sepharose-Kügelchen immobilisiert. B, wurden die fluoreszierende Kügelchen dann auf verschiedenen Ebenen in einem Agarose-Phantom eingebettet und bebildert mit angegebenen Filter. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4.jpg" alt="Abbildung 4" fo:content-width="5.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig4highres.jpg"/> Abbildung 4. OPT Multichannel Bildgebung in der Diabetes-Forschung. A, OPT iso-Oberfläche Rekonstruktion eines Pankreas (12 Wochen, Zwölffingerdarm lobe) aus dem Non Obese Diabetic (NOD)-Modell für Typ-1-Diabetes basiert. Glatte Muskulatur α-Actin (Blutgefäße, rot) und CD3 (infiltrierenden T-Lymphozyten, grün); Die Probe wird für Insulin (Inselzellen β-Zellen, Pseudo blau gefärbt) gefärbt. Die entsprechenden Sekundärantikörper verwendet wurden; Cy3, IRDye-680 und DyeLight-750 jeweils. DieEinsätze (A&#39;-A&#39;&#39; &#39;) zeigen die einzelnen Signalkanäle. B, OPT Bild (blow up view) einer Maus Leberlappen (Lobus sinister lateralis) mit syngenen Inselchen gepfropft und bebildert mit NIR-OPT zwei Wochen nach Transplantation. Die Insulin Ausdruck Inseln sind in blau pseuodocolored und die glatte Muskulatur α-Aktin positive Gefäße sind in rot. Der Ansatz ermöglicht Einschätzungen der Insel Transplantat innerhalb des vaskulären Netzwerk. Maßstabsbalken bis 1 mm entsprechen. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5.jpg" alt="Abbildung 5" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50238/50238fig5highres.jpg" /> Abbildung 5. NIR-OPT erleichtert die Darstellung von größeren Exemplaren. A, Iso-Oberflächen-Rendering des BCM-Verteilung in einem Rattenpankreas aus dem Zucker Fatty Modell für Typ-2-Diabetes (Lobus Splenicus um 9 Monate), die beispielgebend für die Möglichkeit, Bild Probe auf der Ratte Bauchspeicheldrüse Skala durch NIR-OPT. Wie ermitteltdurch diese Technik die angezeigte Lappen ist ~ 6 mal größer (v / v) als sein Gegenstück und Maus birgt 10.139 Insulin exprimieren Langerhans-Inseln, deren β-Zellvolumen macht 1,32% des gesamten Volumens lobuläre. B, tomographische Schnitt entsprechend der gestrichelten Linie in (A) darstellt, daß Inseln aus allen Tiefen des Gewebes detektiert werden. C, Iso-Oberflächen-Rendering des BCM Verteilung in einer Maus Bauchspeicheldrüse (Milz lobe nach 8 Wochen) als Größenangabe angezeigt. Die angezeigte Lappens birgt 2490 Insulin exprimieren Inselchen deren β-Zellvolumen macht 0,89% des gesamten Volumens lobuläre. Die Bauchspeicheldrüsen mit GP Anti-Insulin durch Alexa594 konjugiertem Ziegen-Anti-GP (Maus) und IRDye 680 Konjugierte Esel anti-GP (Ratte) bzw. Antikörper verfolgt angefärbt. Die Exemplare (AC) mit Skala und dem Balken in (C) entspricht 2 mm dargestellt. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig6.jpg" alt="Abbildung 6" fo:cnhalt-width = &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/50238/50238fig6highres.jpg&quot; /&gt; Abbildung 6. CLAHE erleichtert den Nachweis von Inseln in der murinen Bauchspeicheldrüse durch OPT Bildgebung. AC, Vertreter iso-gerendert OPT Bilder einer C57BL / 6 Mäuse Bauchspeicheldrüse (Milz lobe nach 8 Wochen) für Insulin gekennzeichnet. Isofläche Rekonstruktionen OPT Bilder wurden zuvor durchgeführt (A, Pseudo grün) und nach dem CLAHE Protokoll wurde aufgebracht (B, Pseudo rot eingefärbt). C, Overlay der nicht normalisierten Daten in (A) und die verarbeiteten Daten in CLAHE (B). C&#39;-C rot-only &quot;Inseln&quot;, Repräsentative hoher Vergrößerung Überlagerung der nicht normalisierten (A) und CLAHE verarbeiteten (B) Bildern. Als durch die Anwesenheit von gezeigte &quot;erleichtert der CLAHE Skript den Nachweis von kleinen und niedrige Signal Intensität Inselchen. In dem aktuellen Beispiel der abgebildete Exemplar (nach CLAHE Verarbeitung) hegte 2419 Inseln mit einem Volumen von 1,74 mm 3 (Zahlen auf den entsprechenden unverarbeitete Projektionsdaten, betrug 1057 Inseln with einem Volumen von 1,77 mm 3). D und E, Beispiel Daten von der Steuerung (D) und der ob / ob-Maus-Modell für Diabetes Typ 2 12 (E) nach 6 Monaten Durchführung des CLAHE Protokoll. Beachten Sie die massiven allgemeinen Anstieg der Insel Größe in der ob / ob Bauchspeicheldrüse (E). In (D) und (E) die Bauchspeicheldrüse Umriss (grau) wird auf dem Signal von Gewebeautofluoreszenz basiert. Maßstab in C ist 500 um in AC. Maßstabsbalken in C &quot;entspricht 200 um in C &#39;und C&#39;&#39;. Maßstabsbalken in E entspricht 1 mm in (D) und (E). Bilder in (AC) aus Hörnblad et al 3 angepasst und wurden unter Verwendung der Bioptonics 3001 Scanner. <img src="/files/ftp_upload/50238/50238fig7.jpg" alt="Abbildung 7" /> Abbildung 7. Probenhalter zur Befestigung OPT Proben. Die Probe wird durch Einführen der Nadeln durch Agarose Abstandshalter über die vorgebohrten Löcher der Flansche befestigt ist. Der Halter ist an dem Schrittmotor über einestarken Magneten in ihrer Basis entfernt. Dieser Aufbau lässt die Verwendung von instabiler Leimen und verhindert unerwünschte Bewegungen der Probe während des Scannens.

Watch this Scientific Journal Video about Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of Î²-cell Mass Distribution in Diabetes Research at JoVE.com

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &amp;#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

Wir beschreiben die Anpassung der optischen Projektions-Tomografie (OPT)<sup&gt; 1</sup&gt; Zur Bildgebung in der nahen infraroten Spektrum, und die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen. Diese Protokolle ermöglichen Einschätzungen von Pankreas-β-Zellmasse (BCM) in größeren Exemplaren, erhöhen Sie die Mehrkanal-Fähigkeit der Technik und erhöhen die Qualität der OPT-Daten.

Near Infrared Optical Projection Tomography für Assessments von β-Zellen Massenverteilung im Diabetes Research

By adapting OPT to include the capability of imaging in the near infrared (NIR) spectrum, we here illustrate the possibility to image larger bodies of ...

near-infrared-optical-projection-tomography-for-assessments-cell-mass

Research

JoVE Journal

Medicine

Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &beta;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

16.2K Aufrufe.  Umeå University. Wir beschreiben die Anpassung der optischen Projektions-Tomografie (OPT) 1 Zur Bildgebung in der nahen infraroten Spektrum, und die Umsetzung einer Reihe von rechnerischen Werkzeugen. Diese Protokolle ermöglichen Einschätzungen von Pankreas-β-Zellmasse (BCM) in größeren Exemplaren, erhöhen Sie die Mehrkanal-Fähigkeit der Technik und erhöhen die Qualität der OPT-Daten.

Serie: Near Infrared Optical Projection Tomography for Assessments of &#946;-cell Mass Distribution in Diabetes Research

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading to an accumulation of lipid-laden intra-luminal plaque, smooth muscle cell proliferation and progressive narrowing of the vessel lumen. The formation of such vulnerable plaques prone to rupture underlies the majority of cases of acute myocardial infarction. The complex molecular and cellular inflammatory cascade is orchestrated by the recruitment of T lymphocytes and macrophages and their paracrine effects on endothelial and smooth muscle cells.1
Molecular imaging in atherosclerosis has evolved into an important clinical and research tool that allows in vivo visualization of inflammation and other biological processes. Several recent examples demonstrate the ability to detect high-risk plaques in patients, and assess the effects of pharmacotherapeutics in atherosclerosis.4 While a number of molecular imaging approaches (in particular MRI and PET) can image biological aspects of large vessels such as the carotid arteries, scant options exist for imaging of coronary arteries.2 The advent of high-resolution optical imaging strategies, in particular near-infrared fluorescence (NIRF), coupled with activatable fluorescent probes, have enhanced sensitivity and led to the development of new intravascular strategies to improve biological imaging of human coronary atherosclerosis.
Near infrared fluorescence (NIRF) molecular imaging utilizes excitation light with a defined band width (650-900 nm) as a source of photons that, when delivered to an optical contrast agent or fluorescent probe, emits fluorescence in the NIR window that can be detected using an appropriate emission filter and a high sensitivity charge-coupled camera. As opposed to visible light, NIR light penetrates deeply into tissue, is markedly less attenuated by endogenous photon absorbers such as hemoglobin, lipid and water, and enables high target-to-background ratios due to reduced autofluorescence in the NIR window. Imaging within the NIR 'window' can substantially improve the potential for in vivo imaging.2,5
Inflammatory cysteine proteases have been well studied using activatable NIRF probes10, and play important roles in atherogenesis. Via degradation of the extracellular matrix, cysteine proteases contribute importantly to the progression and complications of atherosclerosis8. In particular, the cysteine protease, cathepsin B, is highly expressed and colocalizes with macrophages in experimental murine, rabbit, and human atheromata.3,6,7 In addition, cathepsin B activity in plaques can be sensed in vivo utilizing a previously described 1-D intravascular near-infrared fluorescence technology6, in conjunction with an injectable nanosensor agent that consists of a poly-lysine polymer backbone derivatized with multiple NIR fluorochromes (VM110/Prosense750, ex/em 750/780nm, VisEn Medical, Woburn, MA) that results in strong intramolecular quenching at baseline.10 Following targeted enzymatic cleavage by cysteine proteases such as cathepsin B (known to colocalize with plaque macrophages), the fluorochromes separate, resulting in substantial amplification of the NIRF signal. Intravascular detection of NIR fluorescence signal by the utilized novel 2D intravascular NIRF catheter now enables high-resolution, geometrically accurate in vivo detection of cathepsin B activity in inflamed plaque.
In vivo molecular imaging of atherosclerosis using catheter-based 2D NIRF imaging, as opposed to a prior 1-D spectroscopic approach,6 is a novel and promising tool that utilizes augmented protease activity in macrophage-rich plaque to detect vascular inflammation.11,12 The following research protocol describes the use of an intravascular 2-dimensional NIRF catheter to image and characterize plaque structure utilizing key aspects of plaque biology. It is a translatable platform that when integrated with existing clinical imaging technologies including angiography and intravascular ultrasound (IVUS), offers a unique and novel integrated multimodal molecular imaging technique that distinguishes inflammatory atheromata, and allows detection of intravascular NIRF signals in human-sized coronary arteries.

In vivo Near Infrared Fluorescence NIRF Intravascular Molecular Imaging of Inflammatory Plaque, a Multimodal Approach to Imaging of Atherosclerosis

We detail a new near-infrared fluorescence (NIRF) catheter for 2-dimensional intravascular molecular imaging of plaque biology in vivo. The NIRF catheter can visualize key biological processes such as inflammation by reporting on the presence of plaque-avid activatable and targeted NIR fluorochromes. The catheter utilizes clinical engineering and power requirements and is targeted for application in human coronary arteries. The following research study describes a multimodal imaging strategy that utilizes a novel in vivo intravascular NIRF catheter to image and quantify inflammatory plaque in proteolytically active inflamed rabbit atheromata.

In vivo Near Infrared Fluorescence (NIRF) intravaskuläre Molecular Imaging von entzündlichen Plaque, einen multimodalen Ansatz, um Imaging der Atherosklerose

The vascular response to injury is a well-orchestrated inflammatory response triggered by the accumulation of macrophages within the vessel wall leading ...

Forschung

Medizin

Doppler Optical Coherence Tomography of Retinal Circulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double circular scan (CDCS) that scans around the optic nerve head at 3.40 mm and 3.75 mm diameters. The double concentric circles are performed 6 times consecutively over 2 sec. The CDCS scan is saved with Doppler shift information from which flow can be calculated. The standard clinical protocol calls for 3 CDCS scans made with the OCT beam passing through the superonasal edge of the pupil and 3 CDCS scan through the inferonal pupil. This double-angle protocol ensures that acceptable Doppler angle is obtained on each retinal branch vessel in at least 1 scan. The CDCS scan data, a 3-dimensional volumetric OCT scan of the optic disc scan, and a color photograph of the optic disc are used together to obtain retinal blood flow measurement on an eye. We have developed a blood flow measurement software called "Doppler optical coherence tomography of retinal circulation" (DOCTORC). This semi-automated software is used to measure total retinal blood flow, vessel cross section area, and average blood velocity. The flow of each vessel is calculated from the Doppler shift in the vessel cross-sectional area and the Doppler angle between the vessel and the OCT beam. Total retinal blood flow measurement is summed from the veins around the optic disc. The results obtained at our Doppler OCT reading center showed good reproducibility between graders and methods (&lt;10%). Total retinal blood flow could be useful in the management of glaucoma, other retinal diseases, and retinal diseases. In glaucoma patients, OCT retinal blood flow measurement was highly correlated with visual field loss (R2&gt;0.57 with visual field pattern deviation). Doppler OCT is a new method to perform rapid, noncontact, and repeatable measurement of total retinal blood flow using widely available Fourier-domain OCT instrumentation. This new technology may improve the practicality of making these measurements in clinical studies and routine clinical practice.

Total retinal blood flow is measured by Doppler optical coherence tomography and semi-automated grading software.

Doppler Optical Coherence Tomography der retinalen Zirkulation

Noncontact retinal blood flow measurements are performed with a Fourier domain optical coherence tomography (OCT) system using a circumpapillary double ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Generation und 3-Dimensional Quantifizierung der arterielle Läsionen in Mäuse mit optischen Projektionstomographie

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Tissue-simulating Phantoms for Assessing Potential Near-infrared Fluorescence Imaging Applications in Breast Cancer Surgery

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery (BCS). Optical imaging, in particular near-infrared fluorescence (NIRF) imaging, might reduce the frequency of positive surgical margins following BCS by providing the surgeon with a tool for pre- and intraoperative tumor localization in real-time. In the current study, the potential of NIRF-guided BCS is evaluated using tissue-simulating breast phantoms for reasons of standardization and training purposes.
Breast phantoms with optical characteristics comparable to those of normal breast tissue were used to simulate breast conserving surgery. Tumor-simulating inclusions containing the fluorescent dye indocyanine green (ICG) were incorporated in the phantoms at predefined locations and imaged for pre- and intraoperative tumor localization, real-time NIRF-guided tumor resection, NIRF-guided evaluation on the extent of surgery, and postoperative assessment of surgical margins. A customized NIRF camera was used as a clinical prototype for imaging purposes.
Breast phantoms containing tumor-simulating inclusions offer a simple, inexpensive, and versatile tool to simulate and evaluate intraoperative tumor imaging. The gelatinous phantoms have elastic properties similar to human tissue and can be cut using conventional surgical instruments. Moreover, the phantoms contain hemoglobin and intralipid for mimicking absorption and scattering of photons, respectively, creating uniform optical properties similar to human breast tissue. The main drawback of NIRF imaging is the limited penetration depth of photons when propagating through tissue, which hinders (noninvasive) imaging of deep-seated tumors with epi-illumination strategies.

Near-infrared fluorescence (NIRF) imaging may improve therapeutic outcome of breast cancer surgery by enabling intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status. Using tissue-simulating breast phantoms containing fluorescent tumor-simulating inclusions, potential clinical applications of NIRF imaging in breast cancer patients can be assessed for standardization and training purposes.

Gewebe-Simulation Phantoms zur Bestimmung der potentiellen Near-Infrarot-Fluoreszenz-Imaging-Anwendungen in Brustkrebschirurgie

Inaccuracies in intraoperative tumor localization and evaluation of surgical margin status result in suboptimal outcome of breast-conserving surgery ...

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real time images with a 15 &#181;m axial resolution at an effective tissue penetration of 2-3 mm. Within the OCT images the loss of signal intensity per millimeter of tissue penetration, the attenuation coefficient, is calculated. The attenuation coefficient is a tissue specific property, providing a quantitative parameter for tissue differentiation. 
Until now, renal mass treatment decisions have been made primarily on the basis of MRI and CT imaging characteristics, age and comorbidity. However these parameters and diagnostic methods lack the finesse to truly detect the malignant potential of a renal mass. A successful core biopsy or fine needle aspiration provides objective tumor differentiation with both sensitivity and specificity in the range of 95-100%. However, a non-diagnostic rate of 10-20% overall, and even up to 30% in SRMs, is to be expected, delaying the diagnostic process due to the frequent necessity for additional biopsy procedures. 
We aim to develop OCT into an optical biopsy, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication provides a detailed step-by-step approach for percutaneous, needle based, OCT of renal masses.

In Vivo, Percutaneous, Needle Based, Optical Coherence Tomography of Renal Masses

Optical coherence tomography (OCT) is a high resolution imaging technique that allows analysis of tissue specific optical properties providing the means for tissue differentiation. We developed needle based OCT, providing real-time imaging combined with on-the-spot tumor differentiation. This publication describes a method for percutaneous, needle based OCT of renal masses.

In Vivo, perkutane, Nadel Based, Optical Coherence Tomography von Nierentumoren

Optical coherence tomography (OCT) is the optical equivalent of ultrasound imaging, based on the backscattering of near infrared light. OCT provides real ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of stroke than relying on indirect measurements, and will be a potent and robust vascular research tool. We use an optical imaging approach that labels thrombi with a molecular imaging thrombus marker&#160;&#8212; a Cy5.5 near-infrared fluorescent (NIRF) probe that is covalently linked to the fibrin strands of the thrombus by the fibrin-crosslinking enzymatic action of activated coagulation factor XIIIa during the process of clot maturation. A micro-computed tomography (microCT)-based approach uses thrombus-seeking gold nanoparticles (AuNPs) functionalized to target the major component of the clot: fibrin. This paper describes a detailed protocol for the combined in vivo microCT and ex vivo NIRF imaging of thromboemboli in a mouse model of embolic stroke. We show that in vivo microCT and fibrin-targeted glycol-chitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) can be used for visualizing both in situ thrombi and cerebral embolic thrombi. We also describe the use of in vivo microCT-based direct thrombus imaging to serially monitor the therapeutic effects of tissue plasminogen activator-mediated thrombolysis. After the last imaging session, we demonstrate by ex vivo NIRF imaging the extent and the distribution of residual thromboemboli in the brain. Finally, we describe quantitative image analyses of microCT and NIRF imaging data. The combined technique of direct thrombus imaging allows two independent methods of thrombus visualization to be compared: the area of thrombus-related fluorescent signal on ex vivo NIRF imaging vs. the volume of hyperdense microCT thrombi in vivo.

This protocol describes the application of combined near-infrared fluorescent (NIRF) imaging and micro-computed tomography (microCT) for visualizing cerebral thromboemboli. This technique allows the quantification of thrombus burden and evolution. The NIRF imaging technique visualizes fluorescently labeled thrombus in excised brain, while the microCT technique visualizes thrombus inside living animals using gold-nanoparticles.

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Ultrahigh Resolution Mouse Optical Coherence Tomography to Aid Intraocular Injection in Retinal Gene Therapy Research

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the subretinal space, and to evaluate toxicity and efficacy in vivo. HR-SD-OCT uses near infrared light (800-880 nm) and has optics specifically designed for the unique optics of the mouse eye with sub-2-micron axial resolution. Transgenic mouse models of outer retinal (photoreceptor) degeneration and controls were imaged to assess the disease progression. Pulled glass microneedles were used to deliver sub retinal injections of adeno-associated virus (AAV) or nanoparticles (NP) via a trans-scleral and trans-choroidal approach. Careful positioning of the needle into the subretinal space was required prior to a calibrated pressure injection, which delivers fluid into the sub retinal space. Real time subretinal surgery was conducted on our retinal imaging system (RIS). HR-SD-OCT demonstrated progressive uniform retinal degeneration due to expression of a toxic mutant human mutant rhodopsin (P347S) (RHOP347S) transgene in mice. HR-SD-OCT allows rigorous quantification of all the retinal layers. Outer nuclear layer (ONL) thickness and photoreceptor outer segment length (OSL) measurements correlate with photoreceptor vitality, degeneration, or rescue. The RIS delivery system allows real-time visualization of subretinal injections in neonatal (~P10-14) or adult mice, and HR-SD-OCT immediately determines success of delivery and maps areal extent. HR-SD-OCT is a powerful tool that can evaluate the success of subretinal surgery in mice, in addition to measuring vitality of photoreceptors in vivo. HR-SD-OCT can also be used to identify uniform animal cohorts to evaluate the extent of retinal degeneration, toxicity, and therapeutic rescue in preclinical gene therapy research studies.

Here we demonstrate a novel approach to using high resolution spectral-domain optical coherence tomography (HR-SD-OCT) to assist delivery of gene therapy agents into the subretinal space, assess its areal coverage, and characterize photoreceptor vitality.

Höchste Auflösung Maus optische Kohärenztomographie, intraokulare Injektion in die retinale Gentherapie Forschung unterstützen

HR-SD-OCT is utilized to monitor the progression of photoreceptor degeneration in live mouse models, assess the delivery of therapeutic agents into the ...

A New Best Practice for Validating Tail Vein Injections in Rat with Near-infrared-Labeled Agents

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part of many experimental procedures where reagents need to be introduced directly into the bloodstream. Unwittingly, the injection can be subcutaneous, possibly altering the scientific outcomes. Utilizing a nanoemulsion-based biological probe with an incorporated near-infrared fluorescent (NIRF) dye, this method offers the capability of imaging a successful tail vein injection in vivo. With the use of a NIRF imager, images are taken before and after the injection of the agent. An acceptable IV injection is then qualitatively or quantitatively determined based on the intensity of the NIRF signal at the site of injection.

Here we present a method to validate tail vein injections in rats by utilizing near-infrared fluorescence imaging data from dyes incorporated into agents or biological probes. The tail is imaged before and after the injection, the fluorescent signal is quantified, and an assessment of the injection quality is made.

Neue bewährte Methode zur Validierung von Tail Vene Injektionen in Ratte mit nahe-Infrarot-Label Agenten

Intravenous (IV) administration of agents into the tail vein of rats can be both difficult and inconsistent. Optimizing tail vein injections is a key part ...

Semi-Minimal Invasive Method to Induce Myocardial Infarction in Rats and the Assessment of Cardiac Function by an Isolated Working Heart System

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily and highly reproducible MI induction procedure is required to obtain further insight and better understanding of the underlying pathological changes. This procedure can also be used to evaluate the effects or potency of new and promising treatments (as drugs or interventions) in acute MI, subsequent remodeling and heart failure (HF). After intubation and pre-operative preparation of the animal, an anesthetic protocol with isoflurane was performed, and the surgical procedure was conducted&#160;quickly. Using a minimally invasive approach, the left anterior descending artery (LAD) was located and occluded by a ligature. The occlusion can be performed acutely for subsequent reperfusion (ischemia/reperfusion injury). Alternatively, the vessel can be ligated permanently to investigate the development of chronic MI, remodeling or HF. Despite common pitfalls, the drop-out rates are minimal. Various treatments such as remote ischemic conditioning can be examined for their cardioprotective potential pre-, peri- and post-operatively. The post-operative recovery was quick as the anesthesia was precisely controlled and the duration of the operation was short. Post-operative analgesia was administered for three days. The minimally invasive procedure reduces the risk of infection and inflammation. Furthermore, it facilitates rapid recovery. The &#8220;working heart&#8221; measurements were performed ex vivo and enabled precise control of preload, afterload and flow. This procedure requires specific equipment and training for adequate performance. This manuscript provides a detailed step-by-step introduction for conducting these measurements.

This article presents an efficient method to perform myocardial ischemia and subsequent chronic reperfusion in rats using a minimally invasive approach. In addition, left ventricular hemodynamic function of rats is assessed by echocardiography and isolated working heart methods.&#160;

Semi-Minimal Invasive Methode zur Induzieren von Myokardinfarkt bei Ratten und der Beurteilung der Herzfunktion durch ein isoliertes funktionierendes Herzsystem

Myocardial infarction (MI) remains the main contributor to morbidity and mortality worldwide. Therefore, research on this topic is mandatory. An easily ...

How to Administer Near-Infrared Spectroscopy in Critically ill Neonates, Infants, and Children

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated hemoglobin molecules. A probe placed on the skin emits light that is absorbed, scattered, and reflected by the underlying tissue. Detectors in the probe sense the amount of reflected light: this reflects the organ-specific ratio of oxygen supply and consumption - independent of pulsatile flow. Modern devices enable the simultaneous monitoring at different body sites. A rise or dip in the rSO2 curve visualizes changes in oxygen supply or demand before vital signs indicate them. The evolution of rSO2 values in relation to the starting point is more important for interpretation than are absolute values.
A routine clinical application of NIRS is the surveillance of somatic and cerebral oxygenation during and after cardiac surgery. It is also administered in preterm infants at risk for necrotizing enterocolitis, newborns with hypoxic ischemic encephalopathy and a potential risk of impaired tissue oxygenation. In the future, NIRS could be increasingly used in multimodal neuromonitoring, or applied to monitor patients with other conditions (e.g., after resuscitation or traumatic brain injury).

This protocol is designed to assist clinicians to measure regional tissue oxygenation at different body sites in infants and children. It can be used in situations where tissue oxygenation is potentially compromised, particularly during cardiopulmonary bypass, when using non-pulsatile cardiac-assist devices, and in critically ill neonates, infants and children.

Wie man Nahinfrarot-Spektroskopie bei kritisch kranken Neugeborenen, Säuglingen und Kindern verabreicht

Near infrared spectroscopy (NIRS) calculates regional tissue oxygenation (rSO2) using the different absorption spectra of oxygenated and deoxygenated ...