Das übergeordnete Ziel dieses subretinalen Injektionsverfahrens ist es, einen Vektor auf minimal-invasive und reproduzierbare Weise an die Netzhaut zu liefern, der in Echtzeit beobachtbar ist. Hallo, diese Methode kann verwendet werden, um wichtige Fragen in der Gentherapie-Forschung über Vektor-Lieferwirksamkeit und therapeutische Agent Toxizität zu beantworten. Einige Vorteile dieser Technik sind minimale Schäden an der Netzhaut und anderen Augenstrukturen, präzise Injektionsstellenundierung und strenge quantitative In-vivo-Messungen, die solide statistische Rückschlüsse ermöglichen.
Für die intraokulare Transgeninjektion eine anästhesierte Maus zuerst auf die Betrachtungsstufe eines retinalen Bildgebungssystemmikroskops legen und die Spitzen einer sterilen stumpfen Iriszange an den sieben und 10 Uhr Positionen des Augenlids platzieren, während die Zange auf und ab gedrückt wird, um sanft Proptose zu induzieren. Verwenden Sie die Zange, um die Augenlider unter der Augenkugel zu koaxieren und die Spitze der Nadel auf etwa ein bis 1,5 Millimeter unter dem Rand des Hornhautlimbus zu lenken. Als nächstes tragen Sie einen Tropfen sterile PBS-Lösung auf das Auge auf und bedecken Sie das Auge mit einem sterilen Abdeckungsschlupf.
Schieben Sie die Nadel vorsichtig durch die Bindehaut ins Auge, bis eine Skleraldepression entsteht. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um das Auge nach oben zu drehen, bis die Skleraldepression im Fokus ist, und treiben Sie dann die Nadel nach vorne, um mit der Spitze der Nadel einen scharfen Peak in der Netzhaut zu erzeugen. Drehen Sie die Nadel mit dem Nadelhalter nur so lange, bis die Nadelspitze durch die Sklera und das RPE bohrt, so dass das Mehlcein in der Nadelspitze unter dem Netzhautgewebe in unmittelbarer Nähe des subretinalen Raumes und der retinalen Pigmentepithelzellmonoschicht sichtbar ist.
Fahren Sie die Spitze der Nadel nach unten, so dass sie tangential zum Globus ist, und aktivieren Sie dann die Einspritzpumpe mit dem Fußpedalschalter. Nachdem 0,5 bis ein Mikroliter Transgenlösung in den subretinalen Raum geliefert wurde, ziehen Sie die Nadel zurück und bestätigen Sie, dass das Blut stabil ist und dass Flüssigkeit nicht aus dem Injektionstrakt austritt. Um den Erfolg der Injektion zu bestätigen, nehmen Sie ein rechteckiges Volumen OCT auf und vergleichen Sie die Bilder mit Bildern der verschiedenen Arten von potenziellen Injektionsergebnissen.
Nach Bestätigung der richtigen Injektionsplatzierung verwenden Sie dieses rechteckige OCT-Bild, um das Ausmaß der Blage dem Fundusbild zuzuordnen. Um das Ausmaß der subretinalen Bleb abzubilden, öffnen Sie ein rechteckiges Volumen-OCT-Bild der Bb, so dass ein erkennbares Wahrzeichen innerhalb des Auges in das Bild aufgenommen wird. Fügen Sie so viele Bremssättel wie nötig hinzu, um die Position des linken und rechten Rands des B-Scans sowie den Sehnervenkopf ONH, falls vorhanden, und den Wendepunkt, an dem sich die Netzhaut von der RPE und der Aderhaut löst, zu identifizieren und dann die Daten zu speichern.
Dann kompilieren Sie die gespeicherten Dateien und zeichnen Sie die Daten, effektiv eine Karte der Injektion bleb auf die en face OCT Bild erstellen. Überlagern Sie die gezeichneten Daten auf das Fundusbild, das die Injektionsstelle enthält, und speichern Sie das zusammengeführte Bild. Verwenden Sie dieses Bild, um Bereiche von Interesse während der Nachverfolgung der OCT-Bildgebung zu finden.
Um die Netzhautdegeneration nach der Injektion zu bewerten, öffnen Sie zunächst eine aufgezeichnete hochauflösende Spektraldomäne OCT oder HRSD OCT rechteckiges Volumenbild und wählen Sie einen zu messenden B-Scan aus. Vergrößern Sie das ausgewählte Bild, bis es den Bildschirm ausfüllt, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild. Klicken Sie auf Sättel, um die entsprechende Anzahl von Bremssätteln auszuwählen, und verwenden Sie dann die Funktion "Sättel konfigurieren", um die Bremssättel in der Winkelblockspalte als vertikal zuzuweisen und die Position des Anzeigesattels einzuschalten, um eine gleichmäßige Position des Bremssattels über die Netzhaut zu erleichtern.
Klicken Sie auf Anwenden und bewegen Sie jeden Bremssattel an die entsprechende Position 0,1 bis 0,2 Millimeter auseinander über den B-Scan, wobei darauf geachtet wird, dass ein Bremssattel gegebenenfalls in die Mitte des Sehnervenkopfes gestellt wird. Wenn alle Bremssättel platziert wurden, klicken und ziehen Sie jeden Bremssattel auf die Längenspanne des Interessenbereichs, wobei sie willkürlich Sättel festlegen, die messbare Bereiche des B-Scans nicht auf maximale Länge überlagern. Um die Dicke der äußeren Kernschicht zu messen, legen Sie die Oberseite jedes Bremssattels an der äußeren Begrenzungsmembran und den Boden jedes Bremssattels an der Unterseite der äußeren Plexiformschicht bei 0,1 bis 0,2 Millimeter Schritten über die Netzhaut.
Nachdem alle Bremssättel platziert und an die Größe angepasst wurden, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und klicken Sie auf Speichern von Bremssatteldaten"und wiederholen Sie dann die Messungen, wie gerade bei jedem zehnten B-Scan gezeigt, wobei die Bremssättel offen und an der gleichen Stelle auf der x-Achse gehalten werden und die Längen der Bremssättel nach Bedarf angepasst werden, ohne sie in x-Richtung zu bewegen. Wenn alle Scans gemessen wurden, öffnen Sie die gespeicherten Datendateien und klicken Sie auf Datum geändert", um die Dateien nach der gespeicherten Zeit anzuordnen. Öffnen Sie alle Dateien für jeden gemessenen B-Scan, und kompilieren Sie die Rohdaten jedes B-Scans in einer einzigen Datei von der niedrigsten zur höchsten Framenummer, und wählen Sie die Datenspalten aus, einschließlich des Sättelnamens, der Länge und der mittleren X-Spalten.
Stellen Sie sicher, dass das Mittlere X für alle B-Scans, die für jedes verarbeitete OCT-Bild mit rechteckigem Volumen gemessen wurden, gleich ist, und löschen Sie alle Daten aus den Bremssätteln, die nicht zum Aufzeichnen von Messungen verwendet wurden. Stellen Sie den Sättel in der Mitte des Sehnervenkopfes auf Null ein und zeichnen Sie die Daten für X-im Vergleich zu mehreren Y-Datensätzen auf, um eine 3D-Plotfunktion für die Dicke der äußeren Kernschicht oder einer anderen gemessenen Netzhautschicht zu erhalten. Vergleichen Sie dann die Messungen der äußeren Kernschicht zwischen der Kontrolle und Versuchstieren mit dem entsprechenden Alter, um die Rate und Homogenität einer möglichen Netzhautdegeneration zu bestimmen.
Für die 3D-Mapping der Netzhautmessungen, überprüfen Sie die Post-Injektion OCT-Bilder und notieren Sie alle identifizierbaren Landmarken, dann positionieren Sie das Tier, um ein Follow-up-SDO-CT-Bild aus der gleichen Region zu erhalten, wobei darauf zu achten ist, dass dieselben identifizierbaren Landmarken enthalten sind, und die aufgezeichneten Bilder verarbeiten, wie gerade gezeigt. Es ist sehr wichtig, hochwertige OCT-Bilder zu erhalten, die identifizierbare Landmarken enthalten, um die Reimaging der zuvor injizierten Netzhautregionen zu erleichtern. Um die Veränderungen der OS-Länge zu messen, wurden Sättel von der externen Begrenzungsmembran zur Brooks-Membran platziert, was zuverlässige Messungen ermöglichte, da diese Schichten leicht in OCT-Bildern identifiziert werden können.
Unterschiede in den Messungen zwischen diesen Schichten aus verschiedenen Mauslinien wurden kürzeren äußeren Segmentlängen zugeschrieben. Wenn die subretinale Injektion erfolgreich durchgeführt wird, induziert die Öffnung des subretinalen Raumes die Produktion eines Blebs, der sowohl in der En-Face-Ansicht des HRSD OCT-Imagers als auch in den B-Scanbildern klar visualisiert werden kann. Die Überlagerung der Grenzkarte der Injektionsstelle ermöglicht die Segmentierung der Netzhautgewebemessungen und Sättelpositionsdatensätze, um nachfolgende statistische Tests der Auswirkungen spezifischer therapeutischer Wirkstoffe auf die Netzhautdegeneration zu ermöglichen.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in zehn Minuten abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die chirurgische Umgebung sauber und steril zu halten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gentherapie, den gesamten subretinalen chirurgischen Injektionsprozess in Echtzeit zu überwachen und schuf eine Möglichkeit, den chirurgischen Erfolg in vivo sofort zu bestimmen.
Nach diesem Injektionsverfahren können OCT und andere Methoden wie die Elektroretinographie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur transgenen funktionellen Rettung und/oder Toxizität zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie verstehen, wie Sie transsklerale und transchoroidale subretinale Injektionen durchführen, wie Sie das Ausmaß der Injektionsblüftung aus diesem Bild auf das OCT abbilden und strenge Messungen der äußeren Netzhautschichten erhalten. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Gentherapie-Vektoren gefährlich sein kann und dass Vorsichtsmaßnahmen, wie das Tragen der entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung, immer während der Durchführung dieses Verfahrens verwendet werden sollten.
