1. Telomere Länge Protokoll 19 <ol><li> DNA-Isolierung </li></ol> Die meisten DNA Isolierungsverfahren verwendet werden. Unsere Lab zieht Qiagen DNeasy Kit (# 69506) für Blut Quellen. Je nach Quelle der DNA, wie zB bukkal oder anderen Quellen kann eine andere Isolierungsverfahren verwendet werden. <ol start="2"><li> Primer: </li></ol> Alle Primer werden an einer Börse Konzentration 100pmoles/μl in PCR-Wasser verdünnt und bei -20 ° C bis zur Verwendung. Arbeiten Bestände Primer werden frisch zubereitet und sind bei 20 ° C gelagert für einen kurzen Zeitraum (ein paar Monate.) Standard-Primer für Telomere und β-Globin, die SCG verwendet wurden, wie in O&#39;Callaghan et al. 20 . Primer-Sequenzen: Telo 1: 5&#39;-CGGTTTGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT-TGGGTTTGGGTT-3 &#39; Telo 2: 5&#39;-GGCTTGCCTTACCCTTACCCTTACCCTTACCCTT-ACCCT-3 &#39; SCG 1: 5&#39;-GCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGC-3 &#39; SCG 2: 5&#39;-CACCAACTTCATCCACGTTC-ACC-3 &#39; Hinweis: Primer werden auf eine Arbeitskonzentration von 10pmoles/μl verdünnt, vor der Zugabe zur Reaktionsmischung. <ol start="3"><li> Verdünnungsreihe von genomischer DNA: </li></ol> Serielle Verdünnungen von genomischer DNA für Telo und Single Copy Gen (SCG) werden erstellt, um eine Standard-CT-Kurve für den Test zu generieren. Die genomische DNA verwendet wurde aus Lymphozyten aus Blutproben extrahiert. Diese Verdünnungen werden durch Verdünnen DNA mit PCR Klasse H 2 0 zu jeder Konzentration um den Faktor 1,68, um die zwei Sätze von Verdünnungsreihen mit der gleichen genomischen DNA-Ausbeute hergestellt. Die Ausgangskonzentrationen wurden basierend auf Versuch und Irrtum optimiert und müssen angepasst werden, wenn mit verschiedenen Reagenzien, Instrumente, DNA von anderen Spezies, Zelltypen und SCG verwendet. Hinweis: Die serielle Verdünnung unter Verwendung genomischer DNA werden durch vorsichtiges Mischen und einer Wartezeit von mindestens 15 Minuten bis zu einer Stunde befo gemachtre Entnahme von DNA für die nächste Verdünnung. Jede Verdünnung erfordert Zeit für die genomische DNA zu distanzieren. Für die langfristige Lagerung Aliquot serielle Verdünnungen in PCR-Streifen für die Lagerung bei -80 ° C. Jede PCR Streifen wird aufgetaut und einmal, um Frost-Tau-Zyklen, die DNA schädigen können, zu vermeiden verwendet. <ol start="4"><li> Reaktionsansatz für RT-PCR </li></ol> Instrument verwendet: Roche480 Light Cycler Reagenz: Roche Light Cycler sybr-grün Verdünnen Test-DNA-Proben auf eine Endkonzentration von 10 ng / ul. Wir testen mit Konzentration Nanodrop oder Qubit. Wir verdünnen die DNA aus 10ng/μl zur endgültigen 5ng/μl. Wir wissen nicht testen Konzentration wieder. Reaction Komponenten: <table border="1"><tbody><tr><td fo:width="1.5in"> TELO </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td><td fo:width=".25in" rowspan="6"></td><td fo:width="1.5in"> SCG </td><td fo:width="1.5in"> 1x </td></tr><tr><td> H 2 0 &lt;/ Td&gt; <td> 6 ul </td><td> H20 </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Telo 1 </td><td> 0,2 ul </td><td> SCG 1 </td><td> 0,6 ul </td></tr><tr><td> Telo 2 </td><td> 1,8 ul </td><td> SCG 2 </td><td> 1,4 ul </td></tr><tr><td> Rxn mix </td><td> 10 ul </td><td> Rxn mix </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> DNA oder serielle Verdünnung </td><td> 2 ul </td><td> DNA oder serielle Verdünnung </td><td> 2 ul </td></tr></tbody></table> Hinweis: Master Mix ohne DNA und mit einem Überschuß von 5% bis 10% hergestellt. Sowohl Telo und SCG sind zusammen auf der gleichen Platte mit dem folgenden Programm auszuführen. Um präzise zu testen, mindestens drei Wiederholungen für jede Probe und Kontrolle ausgeführt werden soll. Variationen in der verwendeten Primer kann die Ergebnisse beeinflussen. Unser Protokoll wurde optimiert, um wie folgt auf der Roche480 Light Cycler und unsere Primer arbeiten. Initial denaturieren 10 min Denaturierung 95 ° C Radfahren 95 ° C 10 sec halten 60 ° C 5 sec halten 72 ° C 11 sec halten und einzelne Akquisition Wiederholen 45 bis 55 mal je nach Bedarf 2. Quantitative Telomerase Detection (QTD) Protokoll (Basierend auf QTD Kit von Allied Biotech, Inc. Cat. Nr. MT3012) Auszug Vorbereitung <ol><li> Pellet-Zellen oder Gewebe. </li><li> Waschen Sie einmal mit 1x PBS. </li><li> Repellet und entfernen 1x PBS. * </li><li> Zellpellet in 200 ul 1 x Lysis Buffer für alle 10 5 -10 6 Zellen oder 40-100 mg Gewebe. </li><li> Inkubieren auf Eis für 30 min. </li><li> Spin down die Probe bei 12.000 g für 30 min bei 4 ° C. </li><li> Übertragen Sie 160 ul der Überstand in ein frisches Röhrchen und Protein-Konzentration bestimmen. </li><li> Aliquotieren und schnell zu gefrieren die verbleibende Extrakt auf Trockeneis / Ethanol, bei -80 ° C. </li></ol> * In tsein Zustand ist Telomerase in gefrorenen Zellen oder Gewebe für mindestens ein Jahr stabil. Wenn für die Verwendung aufgetaut werden die Zellen sofort in 1 x Lysis Buffer. 2.1. Testkontrollen Hitzeinaktivierung Kontrolle: Für jede Probe Wärmebehandlung eine zusätzliche Kontrolle Extrakt durch Inkubation bei 85 ° C für 10 min vor der Telomerase-Aktivitätstest. Standard-Kurve für TSR Kontrolle Vorlage: Führen Quantitative Real-Time PCR mit Verdünnungen von TSR, ein Oligonukleotid mit einer ähnlichen Sequenz Telomer-Primer mit dem Kit enthalten, um eine Standardkurve zu erzeugen. <ol><li> Bereiten 01.05 serielle Verdünnungen der stock TSR Konzentration (0,5 Amoles / ul) mit Lysepuffer </li><li> Führen Sie die Telomerase Erkennung Standard-Assay unter Verwendung von 1 &amp;mgr; l jeder Verdünnung TSR, einschließlich der Lager-Konzentration. Diese Verdünnungen können bei 4 ° C für mindestens 2 Wochen gelagert werden. </li></ol> 2.2. Telomerase-Aktivität AssayVerwendung QTD Real-Time PCR <ol><li> Für jede Probe, fügen Sie Folgendes in einer PCR-Röhrchen oder dünnwandigen PCR-Platte (Gesamtvolumen 25,0 ul): <ul><li> 12,5 ul 2 x QTD Premix </li><li> 1,0 ul Zelle oder eines Gewebes Extract </li><li> 11,5 ul PCR Qualified Wasser </li></ul></li><li> Nach gründlichem Mischen </li><li> Programm Real-Time PCR Detection Systems entsprechend der unten Programm: - 25 ° C für 20 min (Telomerasereaktion) - 95 ° C für 10 min (PCR anfänglichen Aktivierungsschritt) 35-40 Zyklen von: - 95 ° C für 30 Sekunden (Denaturierung) - 60 ° C für 30 sec (Annealing) - 72 ° C für 30 sec (Erweiterung) </li><li> Zeigen PCR-Röhrchen in den Thermocycler und starten Sie das Programm. </li><li> Sammeln Sie die Schwelle Zyklus oder C T-Wert nach Zyklen Abgang. Der Schwellenwert-Zyklus ist der Zyklus, in dem eine statistisch signifikante Erhöhung der ΔRn zuerst erkannt wird. </li></ol> 2.3. Data Analysis <ol><li> Generatea Standardkurve unter Verwendung der C T-Werte und vergleichen Sie die Telomerase-Aktivität. </li></ol>

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Telomere Länge bietet eine einzigartige zelluläre Marker, um die gestressten und alternden Zelle zu studieren und bietet Einblicke in die Mechanismen des Alterns. Seit seiner Rolle in alternden hatte zunächst vorgeschlagen worden, eine Vielzahl von Studien wurden durchgeführt, über die Länge der Telomere zu altern, Langlebigkeit, altersbedingte Krankheiten, Krebs und Stress. Jahrzehntelang war der Goldstandard der Länge der Telomere Messungen Terminal Restriktionsfragmentanalyse mit Southern-Hybridisierung. Doch ...

Telomere sind wiederholenden DNA Hexamer (TTAGGG) Sequenzen an den Enden der Chromosomen gefunden. In jeder Zelle Replikation werden diese Chromosomen-Enden verkürzt. Wenn sie zu kurz werden, können Chromosomen unterziehen Telomerende Fusionen, anomale Rekombination und Abbau. So reicht die Länge der Telomere Wartung spielt eine wichtige Rolle in Chromosom Stabilität und Zellschutz 38. Telomere Länge Wartung ist auch entscheidend für die Gene in der Nähe der Enden der Chromosomen gefunden, da die DNA-Replikation kann nicht bis zum Ende der Chromosomen 1-2 fortzusetzen. Folglich kann Prävention von Telomerverkürzung verbessern Zelle Stabilität. Zahlreiche Studien haben berichtet, dass die Länge der Telomere mit einem Organismus die Langlebigkeit und krankem Zustand, wie bei Krebs 3-4, Diabetes 5, und Herz-Kreislauferkrankungen 6,7 korreliert ist. Darüber hinaus haben verkürzte Telomere mit übermäßiger Stress oder in Verbindung gebrachtungesunde Lebensweise 8, vielleicht durch die Förderung vorzeitige Zellalterung und Tod 9. Auf der anderen Seite haben einige Studien festgestellt, dass es keinen signifikanten Unterschied zwischen Telomere und Langlebigkeit und altersbedingte Krankheiten 39, 40, 41. Einer der Zelle angeborenen Mechanismen zum Schutz von Telomerverkürzung ist durch die Aktivierung seiner eigenen Enzym Telomerase Reverse Transkriptase (tert). Dieses Enzym und seine Untereinheit Telomerase RNA (TERC), eine nicht-kodierende RNA, verwenden Sie die Telomere als Vorlage für Telomerwiederholungen auf Chromosom 10 endet hinzufügen. Obwohl Telomerase-Aktivität fehlt aus verschiedenen Arten von Zellen und andere Mechanismen in Telomerelänge Instandhaltungsarbeiten, erhöht Telomeraseaktivität mit erhöhter Telomerelänge korreliert. Telomerase-Aktivierung wurde als einer der Mechanismen, mit denen Zellen auf Schäden reagieren und betonen und vermeiden vorzeitige Alterung und Tod festgestellt. Beispielsweise länger telomeres in einer Population von aschkenasischen Juden mit außergewöhnlicher Lebensdauer 11 wurden nachgewiesen wurden Mutationen in TERC oder tert wurde gezeigt, dass zur tödlichen Krankheit 12 und epigenetische Regulation der Telomerase beitragen hat sich gezeigt, um eine Wirkung auf altersbedingte Krankheiten 13 haben. Seit seiner Entdeckung hat die Länge der Telomere als Biomarker für den Gesundheitszustand in verschiedenen Tiermodellen sowie in Menschen vorgeschlagen worden, aber diese frühen Studien waren schwer zu weit replizieren, da die verwendete Methode war mühsam, langwierig und teuer. Im Jahr 2002 und im Jahr 2009 weiter abgestimmt, vorgeschlagen Cawthon und zeigte eine neue, präzise, ​​schnelle und einfache PCR-basiertes Protokoll, um die Länge der Telomere zu bewerten und weiter zu untersuchen, ihre Rolle in der verschiedene Aspekte der Zellbiologie, Altern und Krankheit 19. Die Wahl der richtigen Telomer Messverfahren für eine Studie ist unerlässlich. Derzeit gibt es verschiedene Verfahren verwendet werden, um die Länge der Telomere zu messen, jedes mit seinem eigenenVor-und Nachteile. Traditionell wird die Länge der Telomere gemessen unter Verwendung der Southern-Blot-Analyse von Terminal Restriktionsfragmente (TRFs), die beinhaltet: a. Verdauen der DNA mit Restriktionsenzymen, die in Telomerwiederholungen nicht geschnitten, um TRFs zu erhalten, b. Southern Blot dieser TRFs wird durch Bestimmung der mittleren TRF Länge mit einem Telomer-Sonden 14, 37 erfolgen. Dieses Verfahren ist zwar sehr genau mit kleinem Variationskoeffizient ist ein direktes Maß und kann vorteilhaft sein, zur Längenmessung Verteilung ist TRF Analyse teuer, arbeitsintensiv und erfordert mindestens 3 ug DNA. Auch dieses Verfahren ist unempfindlich gegenüber kurzen Telomeren und Längenbestimmung durch subtelomeren DNA, die von der Sonde durch das (TTAGGG) n-Sequenzen, wie sie in den 15, 42 detektiert werden kann verwechselt werden. Eine weitere sehr genaue Methode zur Messung Telomerelänge ist Single Telomere Dehnung Länge Analysis (STELA), ein single Molekül PCR basierende Methode, die benötigt nur eine geringe DNA-Menge. Bei diesem Verfahren werden Primer hergestellt, um den G-reichen Überhang am Ende der Chromosomen zu erkennen und zu einer einzigartigen subtelomeren Sequenz auf einem Chromosom, die das Telomer eines Chromosoms spezifisch verstärkt binden. Die resultierende Verstärkung ist dann visualisiert Southern Blot. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie sehr genau und ist in der Lage zu erkennen, kurze Telomere 16 Ausreißer. Leider, denn nicht alle Chromosomen G-reichen Enden haben und eine brauchbare subtelomerischen Sequenz können die Länge der Telomere nur auf bestimmten Chromosomen gemessen werden und diese Messungen können nicht die Länge aller Telomere in der Zelle 15. Eine weitere Methode, die durchgeführt worden ist, ist die Verwendung von Peptid-Nukleinsäure (PNA) Sonden Telomerelänge erkennen. Quantitative Florescence in situ Hybridisierung (Q-FISH) ermöglicht es uns, Telomere während der Metaphase, wo die st visualisierenaining der Telomere mit einer PNA-Sonde im Verhältnis zu ihrer Größe ermöglicht den Vergleich von Telomeren zwischen spezifischen Chromosomen. Obwohl dieses Verfahren auch für die Zellen in der Interphase verwendet werden, dabei die Telomere für verschiedene Chromosomen können nicht erkannt werden, was stellt eine Beschränkung bei der Messung Telomere in seneszenten oder selten teilenden Zellen 17. Flow-FISH verwendet stattdessen Durchflusszytometrie und ist derzeit die empfindlichste Methode zur Messung der Länge der Telomere von Blutzellen im klinischen Umfeld, aber erfordert hoch qualifizierte Techniker 18. Derzeit nimmt die Standard-Methode zur Messung durchschnittliche Länge der Telomere in unserem Labor Vorteil der Präzision, Empfindlichkeit und einfache quantitative real-time PCR. Dieses Verfahren ermöglicht wurde zur Messung Telomere durch die Entwicklung neuer Primer, die die Synthese von Primer-Dimer-abgeleiteten Produkten, die ansonsten wie es hergestellt worden sind, zu vermeiden,tandard Assay aufgrund der sich wiederholenden Natur der Telomere. Für diesen Test wird die Messung der Telomer-Länge durch die T / S-Verhältnis, die Telomer-repeat Kopienzahl zu single-copy-Gen Zahl dargestellt. Da eine direkte proportionale Beziehung zwischen der Länge der Telomere und die Anzahl der markierten Telomere Primer an die DNA während der Anfangsphase der PCR ist die T / S-Verhältnis direkt proportional zur Länge der Telomere. Die T / S-Verhältnis, indem die Differenz in Ct gemessen wird, kreuzt die fraktionierte Taktzahl bei der die Probe florescence angesammelt ist eine Schwelle, die mehrere Standardabweichungen über der Grundlinie Blüte ist, zwischen den Proben mit Telomer-Primer und Primer SCG 19. Diese Methode hat für seine indirekte Messung der Länge der Telomere, die zu ungenauen Messungen führen können, zum Beispiel kritisiert worden, im Falle von Chromosom Vervielfältigungen oder Kopienzahl Variationen 15. Auch ist der Vergleich zwischen den Studien oft difficult, aber Standard-Oligomere wurden entwickelt, um absolute Länge der Telomere 20 messen. Diese Methode wurde gefördert durch auf Cawthon verbessert, mit einem Monochrom-Multiplex-qPCR-Assay. In diesem Test wurde die PCR bei niedrigeren Temperaturen in den ersten Zyklen ausführen, um Primer-Dimer-Bindung zu vermeiden und die Telomer-und Kontroll-Gen wurden in der gleichen PCR-Röhrchen analysiert werden, um weitere Fehler zu vermeiden. Die resultierenden Telomere Messungen stark mit Telomere durch Southern-Blot-Analyse gemessen TRFs korreliert und höhere Genauigkeit 15, 19, 36. Im Moment ist qRT-PCR die einzige praktische Methode für die Prüfung großer Stichprobenumfang und benötigt nur eine geringe Menge an DNA durchzuführen. Ein wesentlicher Teil dieser Methode ist eine umfassende Maßnahmen zur Qualitätskontrolle, so dass, wenn es richtig gemacht wird, kann diese Methode wertvolle vergleichende Informationen über die Länge der Telomere zu stellen. Darüber hinaus hatte diese Methode für den Einsatz jenseits Leukozyten zur Messung angepasstTelomere in einer Vielzahl von verschiedenen Geweben 42. Zusätzlich zur weiteren Verständnis der Biologie hinter Telomerelänge Wartung und Interaktionen zwischen den zwei gegenläufige Effekte (dh Telomerverkürzung während der Replikation und Dehnung der Telomerase), begleitet wir die Telomere Verfahren mit einem zusätzlichen Test, der Telomerase-Aktivität misst. Zu diesem Zweck verwendeten wir eine Telomer-Repeat Amplification Protocol, ein in vitro-Assay. Kurz gesagt, lysiert erhalten, enzymatisch aktive Zellen Telomere auf ein Substrat unter Verwendung von Oligonukleotid-Telomerase synthetisiert, und die Produkte wurden unter Verwendung von PCR in Gegenwart von SYBR Green. Die Ergebnisse wurden dann durch den Vergleich der Proben, Kontrollen Ct Schwellenwerte analysiert. Da Telomerase ist ein wärmeempfindliches Enzym wird eine zusätzliche Wärme behandelten Kontrollgruppe nebeneinander Probe 21 ausgeführt. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Während der Messung die Länge der Telomere können wertvolle Einblicke in die mögliche Rolle der Telomer-Länge in der Pathophysiologie der Alterung und Krankheit zu schaffen, ist die Länge der Telomere nicht eine statische Eigenschaft und weitere Informationen benötigt wird, um Telomer-Funktion zu verstehen. Telomerase-Aktivität Studien hinzufügen können Informationen über die Länge der Telomere Regulationsmechanismen. Zum Beispiel kann die gesteuerte Aktivierung der Telomerase halten Telomere und Zellproliferation, aber die unkontrollierte Aktivierung von Telomerase in Krebs führen. Diese beiden kostengünstige und unkomplizierte Methoden kombiniert hat uns nicht nur mit stärkeren Beweise zu einer Beziehung zwischen Länge der Telomere und Zelle Stabilität, sondern auch einen tieferen Einblick in die möglichen Mechanismen der Verkürzung der Telomere und Erholung. Mit diesen Methoden, die wir hoffen, weiter aufzuklären die Antwort der Zelle auf Alterung und verschiedene Zustände der Zellproliferation mit dem Ziel eines besseren Verständnisses der zentralen mechanistischms der Zellbiologie.

<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue number</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Quantitative Telomerase Detection </td>
 <td>Allied Biotech </td>
 <td>MT3012 </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Qiagen DNeasy Kit</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>69506</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LightCycler 480 SYBR Green I Master, Ready-to-use hot start reaction mix for SYBR Green I-based real-time PCR using the LightCycler 480 Instrument</td>
 <td>Roche Diagnostics</td>
 <td>4707516</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

telomere length and telomerase activity; a yin and yang of cell senescence

Telomere sind wiederholenden DNA-Sequenzen an den vorderen Enden der Chromosomen, die unterschiedlich sind in der Länge und im Menschen eine Länge von 15.000 Basenpaaren zu erreichen. Die Telomere dient als bio-Mechanismus des Chromosoms Abrieb bei jeder Zellteilung. Bei einer bestimmten Länge, werden die Telomere zu kurz, um die Replikation, ein Prozess, der auf Chromosom Instabilität oder Zelltod führen können zulassen. Abrieb und Dehnung: Telomere Länge wird durch zwei gegenläufige Mechanismen reguliert. Attrition tritt als jeder Zelle teilt. Im Gegensatz dazu ist Dehnung teilweise moduliert durch die Telomerase, die sich wiederholenden Sequenzen fügt an den Enden der Chromosomen. Auf diese Weise könnte möglicherweise Telomerase Reverse Mechanismus eine alternde und verjüngt die Lebensfähigkeit der Zellen. Dies sind entscheidende Elemente bei der Aufrechterhaltung der Lebensdauer der Zelle und werden verwendet, um die Zellalterung zu beurteilen. In diesem Manuskript beschreiben wir eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode, um die Länge der Telomere in mehrere Gewebe beurteilens und Arten. Dieses Verfahren nutzt zwei zentrale Elemente, die Tandem-Repeat des Telomer-Sequenz und die Empfindlichkeit der qRT-PCR an Differential Kopienzahl der getesteten Proben zu erkennen. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Ein Beispiel eines Telomerelänge qRT-PCR-Assay wird in Abbildung 1 gezeigt. Auf der oberen linken Seite, stellen Proben in rot und grün markiert den Standort der getesteten Probanden auf der 96-Well-Platte. Auf der oberen rechten Fensterbereich wird die Verstärkung Kurve demonstriert. Jedes Thema wird durch zwei Tests (Telomere und Single Copy Gen), die dreifach gemacht wird getestet. Aufgrund unterschiedlicher DNA-Kopien in den beiden Assays ausgewählter Individuen erzeugt, erreicht die Anzahl der ...

Watch this Scientific Journal Video about Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence at JoVE.com

Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Telomere und Telomerase-Aktivität Länge; Ein Yin und Yang der Zellalterung

Telomeres  are repeating DNA sequences at the tip ends of the chromosomes that are diverse  in length and in humans can reach a length of 15,000 base ...

telomere-length-telomerase-activity-yin-yang-cell

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Molecular Biology

Biology

Unit 1

DNA Replication

SCIENTISTS IN ACTION

46.3K Aufrufe.  Albert Einstein College of Medicine. Eine genaue, kurze, anspruchsvolle und billige Methode wird beschrieben, dass die Länge der Telomere beurteilt in verschiedenen Geweben und Spezies mit qRT-PCR. Darüber hinaus beschreiben wir einen einfachen Test zur Telomerase-Aktivität als ergänzende Rückgrat Test für die Länge der Telomere zu beurteilen.

Serie: Telomere Length and Telomerase Activity; A Yin and Yang of Cell Senescence

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Forschung

Biologie

Efficient Derivation of Human Cardiac Precursors and Cardiomyocytes from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based transplantation or by cardiac tissue engineering1-3. Cardiomyocytes become terminally-differentiated soon after birth and lose their ability to proliferate. There is no evidence that stem/progenitor cells derived from other sources, such as the bone marrow or the cord blood, are able to give rise to the contractile heart muscle cells following transplantation into the heart1-3. The need to regenerate or repair the damaged heart muscle has not been met by adult stem cell therapy, either endogenous or via cell delivery1-3. The genetically stable human embryonic stem cells (hESCs) have unlimited expansion ability and unrestricted plasticity, proffering a pluripotent reservoir for in vitro derivation of large supplies of human somatic cells that are restricted to the lineage in need of repair and regeneration4,5. Due to the prevalence of cardiovascular disease worldwide and acute shortage of donor organs, there is intense interest in developing hESC-based therapies as an alternative approach. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity6-8 (see a schematic in Fig. 1A). In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic9-11. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules12 (see a schematic in Fig. 1B). After screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered nicotinamide (NAM) sufficient to induce the specification of cardiomesoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to cardioblasts that generated human beating cardiomyocytes with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of cardioblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human cardiac cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of cardioblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human cardiac progenitors and functional cardiomyocytes for cardiovascular repair.

Effiziente Ableitung von Human Cardiac Vorstufen und Kardiomyozyten aus pluripotenten humanen embryonalen Stammzellen mit Small Molecule Induction

To date, the lack of a suitable human cardiac cell source has been the major setback in regenerating the human myocardium, either by cell-based ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

Überwachung des Ubiquitin-Proteasom-Aktivität in lebenden Zellen unter Verwendung eines Degron (DGN)-destabilisiert Green Fluorescent Protein (GFP)-basierte Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to infection. A common method to measure chemotaxis is the Boyden chamber assay, in which cells and chemoattractant are separated by a porous membrane. As cells migrate through the membrane toward the chemoattractant, they adhere to the underside of the membrane, or fall into the underlying media, and are subsequently stained and visually counted 1. In this method, cells are exposed to a steep and transient chemoattractant gradient, which is thought to be a poor representation of gradients found in tissues 2.
Another assay system, the under-agarose chemotaxis assay, 3, 4 measures cell movement across a solid substrate in a thin aqueous film that forms under the agarose layer. The gradient that develops in the agarose is shallow and is thought to be an appropriate representation of naturally occurring gradients. Chemotaxis can be evaluated by microscopic imaging of the distance traveled. Both the Boyden chamber assay and the under-agarose assay are usually configured as endpoint assays.
The automated ECIS/Taxis system combines the under-agarose approach with Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS) 5, 6. In this assay, target electrodes are located in each of 8 chambers. A large counter-electrode runs through each of the 8 chambers (Figure 2). Each chamber is filled with agarose and two small wells are the cut in the agarose on either side of the target electrode. One well is filled with the test cell population, while the other holds the sources of diffusing chemoattractant (Figure 3). Current passed through the system can be used to determine the change in resistance that occurs as cells pass over the target electrode. Cells on the target electrode increase the resistance of the system 6. In addition, rapid fluctuations in the resistance represent changes in the interactions of cells with the electrode surface and are indicative of ongoing cellular shape changes. The ECIS/Taxis system can measure movement of the cell population in real-time over extended periods of time, but is also sensitive enough to detect the arrival of a single cell at the target electrode. 
Dictyostelium discoidium is known to migrate in the presence of a folate gradient 7, 8 and its chemotactic response can be accurately measured by ECIS/Taxis 9. Leukocyte chemotaxis, in response to SDF1&alpha; and to chemotaxis antagonists has also been measured with ECIS/Taxis 10, 11. An example of the leukocyte response to SDF1&alpha; is shown in Figure 1.

The ECIS/Taxis system is an automated, real-time assay that measures cellular chemotaxis. In this assay, cells move beneath a layer of agarose to arrive at a target electrode. Cellular movement is measured by the onset of resistance to AC current 0.

Messung zellulärer Chemotaxis mit ECIS / Taxis

Cellular movement in response to external stimuli is fundamental to many cellular processes including wound healing, inflammation and the response to ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

In-vitro-Zellmigration und Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Reduced-gravity Environment Hardware Demonstrations of a Prototype Miniaturized Flow Cytometer and Companion Microfluidic Mixing Technology

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If humans are to travel beyond low Earth orbit, a transition towards space-ready, point-of-care (POC) testing is required. Such testing needs to be comprehensive, easy to perform in a reduced-gravity environment, and unaffected by the stresses of launch and spaceflight. Countless POC devices have been developed to mimic laboratory scale counterparts, but most have narrow applications and few have demonstrable use in an in-flight, reduced-gravity environment. In fact, demonstrations of biomedical diagnostics in reduced gravity are limited altogether, making component choice and certain logistical challenges difficult to approach when seeking to test new technology. To help fill the void, we are presenting a modular method for the construction and operation of a prototype blood diagnostic device and its associated parabolic flight test rig that meet the standards for flight-testing onboard a parabolic flight, reduced-gravity aircraft. The method first focuses on rig assembly for in-flight, reduced-gravity testing of a flow cytometer and a companion microfluidic mixing chip. Components are adaptable to other designs and some custom components, such as a microvolume sample loader and the micromixer may be of particular interest. The method then shifts focus to flight preparation, by offering guidelines and suggestions to prepare for a successful flight test with regard to user training, development of a standard operating procedure (SOP), and other issues. Finally, in-flight experimental procedures specific to our demonstrations are described.

Spaceflight blood diagnostics need innovation. Few demonstrations have been published illustrating in-flight, reduced-gravity health diagnostic technology. Here we present a method for construction and operation of a parabolic flight test rig for a prototype point-of-care flow-cytometry design, with components and preparation strategies adaptable to other setups.

Reduzierte Gravitationsbereich Hardware Demonstrationen eines Prototyps Miniaturisierte Durchflusszytometer und Companion Microfluidic Mischtechnik

Until recently, astronaut blood samples were collected in-flight, transported to earth on the Space Shuttle, and analyzed in terrestrial laboratories. If ...

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a cytosine-guanine dinucleotide. While DNA methylation provides long-lasting and stable changes in gene expression, patterns and levels of DNA methylation are also subject to change based on a variety of signals and stimuli. As such, DNA methylation functions as a powerful and dynamic regulator of gene expression. The study of neuroepigenetics has revealed a variety of physiological and pathological states that are associated with both global and gene-specific changes in DNA methylation. Specifically, striking correlations between changes in gene expression and DNA methylation exist in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders, during synaptic plasticity, and following CNS injury. However, as the field of neuroepigenetics continues to expand its understanding of the role of DNA methylation in CNS physiology, delineating causal relationships in regards to changes in gene expression and DNA methylation are essential. Moreover, in regards to the larger field of neuroscience, the presence of vast region and cell-specific differences requires techniques that address these variances when studying the transcriptome, proteome, and epigenome. Here we describe FACS sorting of cortical astrocytes that allows for subsequent examination of a both RNA transcription and DNA methylation. Furthermore, we detail a technique to examine DNA methylation, methylation sensitive high resolution melt analysis (MS-HRMA) as well as a luciferase promoter assay. Through the use of these combined techniques one is able to not only explore correlative changes between DNA methylation and gene expression, but also directly assess if changes in the DNA methylation status of a given gene region are sufficient to affect transcriptional activity.

Correlating Gene-specific DNA Methylation Changes with Expression and Transcriptional Activity of Astrocytic KCNJ10 Kir4.1

DNA methylation is capable of maintaining stable levels of gene expression as well as allowing for dynamic changes in gene expression in response to a variety of stimuli. We detail techniques that allow the study of gene-specific changes in DNA methylation and the effect of these changes on gene expression.

Korrelieren von Gen-spezifischen DNA-Methylierungsänderungen mit Expression und Transkriptionsaktivität Astrozytäre<em&gt; KCNJ10</em&gt; (Kir4.1)

DNA methylation serves to regulate gene expression through the covalent attachment of a methyl group onto the C5 position of a cytosine in a ...

Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great potential for the detailed mass spectrometry (MS) analysis of biomolecules from biological samples. The single-probe, a miniaturized device with integrated sampling and ionization capabilities, is capable of performing both ambient MSI and in-situ SCMS analysis. For ambient MSI, the single-probe uses surface micro-extraction to continually conduct MS analysis of the sample, and this technique allows the creation of MS images with high spatial resolution (8.5 &#181;m) from biological samples such as mouse brain and kidney sections. Ambient MSI has the advantage that little to no sample preparation is needed before the analysis, which reduces the amount of potential artifacts present in data acquisition and allows a more representative analysis of the sample to be acquired. For in-situ SCMS, the single-probe tip can be directly inserted into live eukaryotic cells such as HeLa cells, due to the small sampling tip size (&lt; 10 &#181;m), and this technique is capable of detecting a wide range of metabolites inside individual cells at near real-time. SCMS enables a greater sensitivity and accuracy of chemical information to be acquired at the single cell level, which could improve our understanding of biological processes at a more fundamental level than previously possible. The single-probe device can be potentially coupled with a variety of mass spectrometers for broad ranges of MSI and SCMS studies.

Here, we present protocols to perform both ambient mass spectrometry imaging (MSI) of tissues and in-situ live single cell MS (SCMS) analysis using the single-probe, which is a miniaturized multifunctional device for MS analysis.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Mass spectrometry imaging (MSI) and in-situ single cell mass spectrometry (SCMS) analysis under ambient conditions are two emerging fields with great ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed cellular senescence. Accumulation of senescent cells occurs with organismal aging and through continual culturing in vitro. Senescent cells influence many biological processes, including embryonic development, tissue repair and regeneration, tumor suppression, and aging. Hallmarks of senescent cells include, but are not limited to, increased senescence-associated &#946;-galactosidase activity (SA-&#946;-gal); p16INK4A, p53, and p21 levels; higher levels of DNA damage, including &#947;-H2AX; the formation of Senescence-associated Heterochromatin Foci (SAHF); and the acquisition of a Senescence-associated Secretory Phenotype (SASP), a phenomenon characterized by the secretion of a number of pro-inflammatory cytokines and signaling molecules. Here, we describe protocols for both replicative and DNA damage-induced senescence in cultured cells. In addition, we highlight techniques to monitor the senescent phenotype using several senescence-associated markers, including SA-&#946;-gal, &#947;-H2AX and SAHF staining, and to quantify protein and mRNA levels of cell cycle regulators and SASP factors. These methods can be applied to the assessment of senescence in various models and tissues.

Cellular senescence, the irreversible state of cell-cycle arrest, can be induced by various cellular stresses. Here, we describe protocols to induce cellular senescence and methods to assess markers of senescence.

Techniken zur Induktion und Quantify Zelluläre Seneszenz

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily through modulating protein-protein interactions. Similar to ubiquitin modification, SUMOylation is directed by a sequential enzyme cascade including E1-activating enzyme (SAE1/SAE2), E2-conjugation enzyme (Ubc9), and E3-ligase (i.e., PIAS family, RanBP2, and Pc2). However, different from ubiquitination, an E3 ligase is non-essential for the reaction but does provide precision and efficacy for SUMO conjugation. Proteins modified by SUMOylation can be identified by in vivo assay via immunoprecipitation with substrate-specific antibodies and immunoblotting with SUMO-specific antibodies. However, the demonstration of protein SUMO E3 ligase activity requires in vitro reconstitution of SUMOylation assays using purified enzymes, substrate, and SUMO proteins. Since in the in vitro reactions, usually SAE1/SAE2 and Ubc9, alone are sufficient for SUMO conjugation, enhancement of SUMOylation by a putative E3 ligase is not always easy to detect. Here, we describe a modified in vitro SUMOylation protocol that consistently identifies SUMO modification using an in vitro reconstituted system. A step-by-step protocol to purify catalytically active K-bZIP, a viral SUMO-2/3 E3 ligase, is also presented. The SUMOylation activities of the purified K-bZIP are shown on p53, a well-known target of SUMO. This protocol can not only be employed for elucidating novel SUMO E3 ligases, but also for revealing their SUMO paralog specificity.

In Vitro SUMOylation Assay to Study SUMO E3 Ligase Activity

Unlike ubiquitin ligases, few E3 SUMO ligases have been identified. This modified in vitro SUMOylation protocol is able to identify novel SUMO E3 ligases by an in vitro reconstitution assay.

In-vitro- Sumoylierung Assay SUMO E3 Ligase Tätigkeit zu studieren

Small ubiquitin-like modifier (SUMO) modification is an important post-translational modification (PTM) that mediates signal transduction primarily ...