J.H. is supported by NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) and NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll wurden von UT MD Anderson Cancer Center zugelassen. 1. Erzeugung von mTERT-ER Allel <ol><li> Einführung Knock-in-Targeting-Vektor, der die ERT2-LBD (Ligandenbindungsdomäne) vor und im Rahmen mit der mTERT genomische Sequenz (Exon 1 durch Intron 2) und eine Lox - PGK - Neo - Lox-Fragment (1A) in Maus-ES-Zellen mit Elektroporation. </li><li> Kultur die ES-Zellen in Neomycin für 6-10 Tage. Wählen Neomycin-resistenten Klone und in 48-Well-Platten erweitern. Entpacken Sie die genomischer DNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits und bestätigen Sie die Knock-In-Allels durch Southern Blot. </li><li> Spritzen Sie zwei ES-Linien mit mehr als 95% normalen Karyotyp in C57BL / 6-Blastozysten mit einer Mikromanipulation Satz unter einem inversen Mikroskop. Implantieren die Blastozysten in die Gebärmutter der Leihmutter 23. Kamerad die hochwertigen männlichen Chimären (70-90%) auf C57BL / 6 feMänner. </li><li> Bestätigen Sie die Genotypisierung von heterozygot mTERT-ERneo Tiere durch Southern Blot. </li><li> Kamerad die heterozygot mTERT-ERneo Tiere und EIIA-Cre Tieren, die NeoR Kassette zu löschen. Kamerad die heterozygote Tiere in C57BL / 6 Tiere für mindestens drei Mal, und weitere inter Rasse heterozygot mTERT-ER Tiere Homozygotie zu generieren. </li></ol> 2. Erzeugung von LSL-mTERT Allel <ol><li> Führen Sie das Knock-in-Targeting-Vektor, der ein LoxP - Dreifach-Stopper - Neo - LoxP Fragment und die mTERT genomische Sequenz (zwischen Exon 1 und Intron 2, 1B) in Maus-ES-Zellen mit 23 Elektroporation. </li><li> Kultur die ES-Zellen in Neomycin für 6-10 Tage. Wählen Neomycin-resistenten Klone und in 48-Well-Platten erweitern. Entpacken Sie die genomischer DNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits und bestätigen Sie die Knock-In-Allels durch Southern-Blot-23. </li><li> Inject zwei ES-Linien mit mehr als 95% normalen Karyotyp in C57BL / 6-Blastozysten mit einer Mikromanipulation Satz unter einem inversen Mikroskop. Implantieren die Blastozysten in die Gebärmutter der Leihmutter 23. Kamerad die hochwertigen männlichen Chimären (70-90%) auf C57BL / 6-Weibchen. </li><li> Bestätigen Sie die Genotypisierung von heterozygot LSL-mTERT Tiere durch Southern Blot. </li><li> Kamerad die heterozygote Tiere in C57BL / 6 Tiere für mindestens drei Mal, und weitere inter Rasse heterozygot LSL-mTERT Tiere Homozygotie zu generieren. </li></ol> 3. Reaktivierung der Telomerase in mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen in vivo Für mTERT-ER <ol><li> Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Injektion. </li><li> Anesthetize der Mäuse mit Isofluran Kammer (4% zur Einleitung, 2% zur Aufrechterhaltung) in 50% (v / v) Sauerstoff / 50% (v / v) Distickstoffmonoxid Gasgemisches. Oder betäuben Mäusen durch eine Ketamin-Xylazin-Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht + 10 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Nach tiefer Narkose erreicht ist, entfernen Sie den narkotisierten Tier aus der Induktionskammer, und halten Sie den Kopf in der Röhre auf die Isofluran Kammer (2%) verbunden sind. </li><li> Klemmen Sie die Dämpfer der Mäuse, um sicherzustellen, das Tier tief anästhesiert. Setzen Salbe auf beiden Augen, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Reinigen Sie die Rückseite der Mäuse, die mit PVP-Jod-Lösung. </li><li> Spritzen Sie die langsam frei 4-OHT Pellet mit Präzision Trokar (10 G) unter die Haut des Rückens und drücken Sie den Pellet bis hin zu der Mittellinie zwischen zwei Schultern. </li><li> Verschließen Sie den Schnitt mit Wundklammerapplikations und Überwachung der Mäuse aus der Narkose. Die Clips 10 Tage später entfernen. Zusätzliche Wärme ist nicht erforderlich, weil das Verfahren kurz beendet. </li><li> Zeitraum der Behandlung mit 4-OHT Pellet sollte entsprechend dem Zweck der Untersuchung optimiert werden. </li></ol> Für LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Tamoxifen (10 mg / ml, in Maisöl gelöst) intraperitoneal zwei aufeinanderfolgenden Tagen injiziert (200 ul / 25 g / Tag). </li></ol> 4. Isolierung von neuralen Stammzellen und Reaktivierung der Telomerase in vitro- <ol><li> Mäuse mit Kohlendioxid getötet und die Gehirne werden entfernt. Folgen Sie dem Protokoll von handelsüblichen Nervengewebe Dissoziation Kit nach Hersteller. </li><li> Resuspendieren gefriergetrocknetes Pulver in der Flasche für Lösung 4. beschriftet Lösung 4 mit 1 ml Zellkulturmedium nicht vortexen. Diese Lösung soll dann aliquotiert und bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden. </li><li> Vorwärmen des Gemischs bei 37 ° C für 15 min vor der Verwendung. </li><li> Stellen Enzyme Mix 1: Lösung 1 (50 ul) und Lösung 2 (1900 ul). Stellen Enzyme Mix 2: Lösung 3 (20 ul) und Lösung 4 (10 ul). </li><li> Bereiten 1950 ul Enzymmischung 1 für bis zu 400 mg Gewebe und Wirbel. Vorheizen des Gemisches bei 37 ° C für15 min vor der Verwendung. </li><li> Nehmen Sie die 1-Tages-Gehirn der Maus, und halten Sie die Vorderhirne durch Entfernen der Riechkolben und das Kleinhirn. Halten Sie die Vorderhirngewebe in 1 ml kaltem Kulturmedium, da die Entfernung und Speicherung in 4 ° C. Achten Sie auf die Nervengewebe innerhalb 1 Stunde zu verarbeiten. </li><li> Bestimmen Sie das Gewicht des Gewebes, um sicherzustellen, dass der Grenzwert von 400 mg pro Verdauung nicht überschritten wird. Stellen Sie das Gehirn auf den Deckel eines 35 mm Durchmesser Petrischale, und quetschen Sie das Gehirn mit einem Skalpell. </li><li> Mit einer 1 ml Pipettenspitze, 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) und Pipetten Stücke wieder in einen 15-ml-Tube. Spülen Sie mit HBSS (w / o Ca / Mg). Zentrifugation bei 300 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand vorsichtig. </li><li> Hinzufügen 1.950 ul vorgewärmter Enzymmix 1 (Lösungen 1 und 2) je bis zu 400 mg Gewebe. Inkubieren in der 15-ml-Röhrchen für 15 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen oder Schütteln der Röhre im Abstand von 5 min. </li><li> Bereiten Sie 30 ul Enzymmischung 2 pro Gewebeprobe durch Zugabe von 20 &amp; #956; l Lösung 3 bis 10 &amp; mgr; l der Lösung 4. Dann auf Probe hinzuzufügen. Kehren Sie zum Mischen leicht. Nicht mit dem Vortex. </li><li> Distanzieren Gewebe mechanisch mit einer breiten bestückt, feuerpolierten Pasteur-Pipette pipettiert und ab 10-mal langsamer. Vermeiden Sie Luftblasen bilden. </li><li> Bei 37 ° C für 10 min, Umdrehen des Röhrchens alle 3 min. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt Schritt 4.11 und 4.12, wenn die Gewebe sind größer als 200 mg. </li><li> Anwenden der Zellsuspension auf eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb, auf einem 50-ml-Röhrchen platziert. Übernehmen 10 ml PBS durch Zellsieb. Verwerfen Zellsieb zentrifugieren Zellsuspension bei 300 g für 20 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen vollständig. </li><li> Die Zellen mit Stammzellmedium auf das erforderliche Volumen für weitere Anwendungen. </li><li> Um Telomerase in LSL-mTERT NSCs aktivieren, behandeln Sie die Zellen mit 100 pM 4-OHT für zwei Tage. Um Telomerase in mTERT-ER NSCs zu aktivieren, halten Sie die Zellen in Kulturmedium mit 100 &amp; mgr; M 4-OHT. </li></ol> 5. Telomere FISH <ol><li> Bereiten Sie die Metaphasechromosomen aus kultivierten Zellen. </li><li> Für FFPE (Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten) Gewebeschnitte entparaffinieren in Xylol und rehydrieren in Ethanolreihe für jeweils 5 Minuten (100%, 90%, 70%, 50% Ethanol) und PBS für 5 min. </li><li> Post-Update in dem Methanol: Essigsäure (3: 1) für 1-2 Std. Entwässern in kaltem Ethanol Serie 5 min jeder (70%, 90%, 100% Ethanol) und an der Luft trocknen. Waschen in 1 × PBS bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Denaturieren Chromosomen in 4% Formaldehyd bei 37 ° C für 2 min. Entwässern in kaltem Ethanol Serie 5 min jeweils (70%, 90%, 100% Ethanol) und an der Luft trocknen. </li><li> Bewerben 12-25 ul der PNA Hybridisierungsmischung zu jeder Folie. (Hybridisierungsmischung: 70% Formamid, 0.06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / &amp; mgr; l tRNA, 0,5 ng / ul Telomer oder Centromersonden) </li><li> Dichten Sie das Deckglas mit Gummi-Zement. Post-denaturierte chromosomale Minipreps und Gewebeschnitte bei 80 ° C für 4 min. Die Hybridisierungs bei Raumtemperatur oder 37 ° C für 2-4 Stunden in der feuchten Kammer. </li><li> Bei Raumtemperatur mit Waschpuffer 2 x 15 min Waschen. (Waschpuffer: 70% Formamid, 0.06x SSC, pH 7,2). Mit PBST waschen bei Raumtemperatur 3 x 5 min. Gegenfärbung Objektträger mit DAPI oder weit rote Fluoreszenz für die mikroskopische Untersuchung. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Wir berichten hier die Erzeugung von zwei induzierbare murine Telomerase Allele und wie Telomerase in vivo und in vitro zu aktivieren. Der entscheidende Schritt zur Reaktivierung mTERT-ER-Aktivität ist es, eine kontinuierliche Konzentration von Tamoxifen zu halten, so dass wir uns entscheiden, 4-OHT Zeit-Release-Pellets von Innovative Research of America hergestellt zu verwenden. Die Pellets halten Freigabe 4OHT in einem stationären Zustand Blutspiegel von 1 ng / ml für bis zu 60 Tage. In einer früheren Untersuchung wurde gezeigt, dass die Reaktivierung Telomeraseaktivität mit dieser Strategie konnte die degenerative Phänotypen wie Stammzellenerschöpfung Beeinträchtigung der Gewebeverletzung antwortet und Organversagen in mehreren Organen, die durch Telomerdysfunktion in G4 mTERT ER / ER induziert wurden, zu verbessern Mäuse 20. Andere als die Untersuchung der Funktion der Telomerase in Alterung können diese beiden induzierbaren Telomerase Allele auch verwendet, um Krebs zu untersuchen. Frühere Studien habenVorteil dieser Allele, die Rolle der Telomere Abrieb und Telomerase Reaktivierung bei der Gestaltung der Genome und Auswirkungen auf die Biologie von T-Zell Thymuslymphom 21 und Prostatakrebs 22 erkunden. Diese beiden Studien zeigten, dass Telomerdysfunktion Ende Generation G4 Atm - / - mTERT ER / ER und G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L Mäusen stellt einen Mechanismus treibt die Übernahme von Anfang mutagene Ereignisse für Tumor-Initiation, noch verhindert Progression voll bösartigen Tumoren. Wenn die Telomerase wurde im Rahmen der Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität, DNA-Schaden-Checkpoints und zügellose chromosomale Instabilität reaktiviert wurden unterdrückt, was die vollständige Progression von malignen Tumoren mit neuen biologischen Eigenschaften wie Knochenmetastasen von Prostatakrebs 21 und Gehirn Infiltration Thymi erlaubtc Lymphom 21. Ähnliche Phänomene wurden auch bei anderen Krebsarten wie Darmkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs (persönliche Kommunikation mit Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin und Ronald DePinho) beobachtet. Weil TERT-ER-Protein kann leicht zwischen Ein und Aus-Zuständen in Abhängigkeit davon, ob die Tiere mit Tamoxifen oder Vehikel behandelt umgeschaltet werden, können die Tumormodellen von mTERT-ER-Allel erzeugt verwendet werden, um anti-Telomerase-Therapie zu testen. In früheren Studie, in G4 Geldautomaten erzeugten Tumoren - / - mTERT ER / ER Tiere wurden von 4-OHT veröffentlicht; auf Telomerase Erschöpfung, Tumoren schließlich schrumpfte aufgrund der Wiedereinstellung von Telomerdysfunktion induzierten Checkpoints 21. Doch einige der erworbenen Resistenz in Reaktion Tumoren bis zur Ausrottung durch die Aktivierung eines alternativen Verlängerung von Telomeren (ALT) Mechanismus Telomerase. Die weitere Charakterisierung dieser ALT + resistenten Tumoren zeigte, dass they haben anomale Transkription von Genen im mitochondrialen Biologie und oxidative Abwehr mit einem Master-Regulator der Synthese und der mitochondrialen oxidativen Abwehr PGC-1β beteiligt. Knockdown von PGC-1β oder SOD2 (ein weiterer Regulator des oxidativen Abwehr) deutlich macht ALT + Tumorzellen, während halten Telomerase + Tumorzellen relativ intakt 21 bleiben. Eine Einschränkung dieser beiden Knock-in-Allele ist, dass sie sich nur leisten Reaktivierung Telomerase endogenen Spiegel, weil sie im nativen Locus des Telomerase-Gens sind. In den meisten Krebsarten geht Telomerase tatsächlich auf einem viel höheren Niveau überexprimiert. Um das Niveau der Telomerase zu verbessern, ist eine Modifikation können wir betrachten die mTERT-ER-Konstrukt mit einem stärkeren Promotor wie PGK (Phosphoglyceratkinase) -Promotor in Rosa26 Locus einzufügen. Abschließend die beiden neuartigen induzierbaren Maus Telomerase Allele bieten beispiellose genetic Werkzeuge, um die Funktionen der Telomerase in Alterung und Gewebshomöostase sowie die Tumorprogression insbesondere unter dem Hintergrund der zuvor erfassten Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität studieren. Die mTERT-ER-Allel kann auch verwendet werden, um anti-Telomerase-Therapie durch die Kreuzung in andere tumor anfällig Maus-Modellen untersucht werden.

Telomerase ist ein für die Aufrechterhaltung der Telomere verantwortliche Enzym. Dies sind repetitive Sequenzen an den Enden der Chromosomen, die ihre Integrität zu schützen. Die Kernkomponenten von Telomerase-Holoenzym eine katalytische Untereinheit der Reversen Transkriptase (TERT) und eine RNA-Untereinheit (TERC), das als Vorlage dient zum Addieren des Telomerabschnitten 1,2. Während in der Regel in differenzierten Körperzellen unterdrückt, zeigt Telomerase robuste Aktivität und spielt eine wichtige Rolle bei der Keimzellen, Krebszellen und Stammzellen. mTERC und mTERT Knockout-Mäuse bieten große in vivo Modellsystemen, um die Funktionen der Telomerase in beiden Stammzellen und Krebs zu untersuchen. Die mTERC und mTERT Knockout-Mäusen (G1) brachte keine offensichtlichen Phänotypen aufgrund der langen Rücklage der Telomere bei Mäusen 3 zeigen. Allerdings seriell Kreuzung mTERC und mTERT Knockout-Mäusen zu spät Generation (G5-G6) führteprogressive Erosion der Telomere und schließlich provoziert schwere Degeneration der hoch proliferativen Gewebe 4. Späten Generation (G5-G6) mTERC - / - Mäuse sind unfruchtbar aufgrund der hohen Raten von Apoptose in Hoden und Keimzellverarmung. G5-G6 mTERC - / - Mäusen degenerative Phänotypen in hoch proliferativen Geweben wie Knochenmark, Darm und Haut weisen auch aufgrund der hohen Raten von Apoptose und defekte Selbsterneuerungsfähigkeit in Gewebe Stammzellen / Vorläuferzell Fächer 4. Hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark in der letzten Generation mTERC - / - Mäuse weisen Verlust der Teilungsfähigkeit, beeinträchtigt Selbsterneuerungsfähigkeit, verstärkte Apoptose und schließlich funktionale Erschöpfung 5,6. - / - Mäusen 7,8 Ebenso wurden schrittweise erhöht apoptotische Körper in Darmkrypten in jeder neuen Generation von G1-G6 mTERC beobachtet. Ter schädliche Wirkung von dysfunktionalen Telomeren scheint nicht zu einer hohen Fluktuation Gewebe, da sowohl die Proliferation von adulten neuralen Stammzellen in vitro und der Neurogenese in vivo wurden Ende Generation (G4-G5) stark beeinträchtigt begrenzt mTERC - / - Mäuse 9 . Die Rolle der Telomerase in Stammzellen wird durch die Ergebnisse in einem seltenen menschlichen Erbkrankheit Dyskeratosis congenita (DKC), die in gewisser Weise ähnelt vorzeitiger Alterung 10,11 unterstützt. DKC wird durch Mutationen im TERC, TERT, und Gene, die Dyskerin, einen Kern Telomerase-Untereinheit und andere Dyskerin assoziierte Proteine ​​codieren 12 verursacht. Im Durchschnitt Telomere in DKC Patienten sind kürzer als 99% der bei gleichaltrigen Kontrollen. Der Hauptmorbiditäts liegt an aplastischer Anämie, die durch mangelhafte Wartung von hämatopoetischen Stammzellen verursacht wird. Andere Aspekte der Krankheit, wie oralen Leukoplakie, Nageldystrophie, geistige retardatiauf, Hoden-Atrophie und Lungenkomplikationen alle schlagen Ende Generation von Telomerase-Knockout-Mäusen Funktionsstörungen von Gewebestammzellen und Vorläuferzellen 10, Erkenntnisse in enger Abstimmung mit diesen. DKC Patienten neigen zu myelodysplastischem Syndrom und haben eine erhöhte Prävalenz von malignen Neoplasmen Schleimhaut. So Mangel der Telomerase in menschlichen Patienten rekapituliert die Mängel der Stammzellfunktionen und Tumor Veranlagung, die Ende Generation Telomerase-Knockout-Mäusen beobachtet. Kurze Telomere und eine hohe Telomerase-Aktivität sind die Markenzeichen von Krebs. Als normal oder prämalignen Zellen teilen, die langsam oder gar nicht Telomerase-Aktivität führt zu eventuellen Erosion der Telomere und Aktivierung von zellulären Kontrollpunkten ähnlich denen von DNA-Doppelstrang-Brüche (DSBs) 13 ausgelöst. Wie klassische DSBen hat Telomerdysfunktion wurde gezeigt, dass p53 zu induzieren und zugehörige zelluläre Antworten, wie zum Beispiel Alterung und / oder apoptosis 14,15. Bei Mutations Inaktivierung von p53, sind Zellzyklus und das Überleben der Zellen in Zellen mit Telomer-Dysfunktion, die eine pro-karzinogene Mutator Mechanismus gekennzeichnet durch Translokationen und regionalen Amplifikationen und Deletionen 16,17 bietet verbesserte. Gleichzeitig weiterhin Telomerdysfunktion und zugehörige grassiert chromosomale Instabilität (auch in p53 Nullzellen) scheinen Voll malignen Progression derartiger Krebs beschränken. So spät Generation G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - Mäuse zeigten im Vergleich zu Ink4a / Arf-null-Mäusen durch Telomer-Abrieb erheblich reduziert Lymphoma-Inzidenz. In einer anderen Studie erweiterte adenomatöse Läsionen in G4 mTERT - / - APC min Mäusen wurden stark im Vergleich zu APC min Mäuse aufgrund erheblicher Wachstumsarrest und Apoptose 18,19 drückt. DieBeobachtung, dass Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität hemmt Tumorprogression fordert den Spekulationen, dass die Aktivierung der Telomerase kann maligne Progression teilweise durch Niederschlagung genomische Instabilität auf ein Niveau mit Krebszelllebensfähigkeit und / oder Neutralisations p53-abhängige oder -unabhängige Checkpoint Mechanismen, zu ermöglichen. Um zu untersuchen, ob Telomerase Reaktivierung kann stoppen oder sogar umkehren Alterung von Stammzellen, und ob Telomerase Reaktivierung können die Tumorentstehung vor dem Hintergrund der genomische Instabilität fördern erzielten wir zwei induzierbaren Maus Telomerase-Allele. Die erste ist 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -induzierbaren TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) Fusion Knock-in-Allel. In Abwesenheit von 4-OHT, Mäuse, die homozygot für mTERT-ER (bezeichnet mTERT ER / ER) Telomerase-Aktivität defizient und aufrechtzuerhalten gleichen zytogenetischen und zellulären Phänotypen als herkömmliche mTERT oder mTERC Knockout-Modell. Nach 4-OHT Behandlung kann TERT-ER-Protein-Aktivität auf ein Niveau vergleichbar mit dem nativen Protein TERT 20, 21 wieder hergestellt werden. Die zweite Allel ist eine neuartige induzierbaren TERT Knock-in-Allel, das eine intro LoxP-Stopper-LoxP Kassette (LSL- mTERT); nach Cre-vermittelte Exzision LSL, mTERT unter endogene Expression Kontrollmechanismen 22 erneut zum Ausdruck gebracht.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Leica AM6000 Micromanipulation Kit</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica DMI6000 B inverted microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Per quote</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>21810031</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane vaporizer</td>
			<td>Veterinary Anesthesia Systems</td>
			<td>911103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>1005796</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine-xylazine mixture</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K113-10ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT powder</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7904-5MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tamoxfien</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5648-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-OHT pellet</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>Custermized</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Trochar (10 Gauge)</td>
			<td>Innovative Research of America</td>
			<td>MP-182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wound clip applier</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>clip</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>01-804-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-092-628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylene</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>X3P-1GAL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A-433S4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetic acid</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A38-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>22-032-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formamide</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>F84-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA telomere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F1001-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PNA centromere probe</td>
			<td>Panagene</td>
			<td>F3003-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X SSC</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1325-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2153-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tRNA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R5636-1ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP337-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rubber cement</td>
			<td>Walmart</td>
			<td>Elmer&#39;s</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

utilizing murine inducible telomerase alleles in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer

Telomerdysfunktion bedingte Verlust der Genomintegrität und die damit verbundenen DNA-Schäden Signalisierung und Checkpoint Reaktionen sind gut etablierte Treiber, die Gewebedegeneration während der Alterung verursachen. Krebs, mit Inzidenzraten stark mit dem Alter zunimmt, wird durch kurze Telomerlängen und hohe Telomerase-Aktivität aus. Um die Rolle von Telomerdysfunktion und Telomerase-Reaktivierung in Alterung und Krebs zu untersuchen, zeigt das Protokoll, wie man zwei Mäuse induzierbaren Telomerase erzeugen Knock-in-Allele 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -induzierbaren TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) und Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Das Protokoll beschreibt die Verfahren zur Telomerdysfunktion induzieren und zu reaktivieren Telomerase-Aktivität in mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen in vivo. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Reaktivierung der Telomerase-Aktivität kann die Gewebe degenerative Phänotypen von Telomerdysfunktion induzierte verbessern. In order, um die Auswirkungen der Telomerase Reaktivierung auf die Tumorentstehung zu bestimmen haben wir einen Prostatatumor-Modell G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L und Thymus-T-Zell-Lymphom-Modell G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Telomerase-Reaktivierung in der Kulisse der genomische Instabilität durch Telomerdysfunktion induzierte eine wesentlich bessere Tumorgenese. Das Protokoll beschreibt auch verwendet werden, um neurale Stammzellen (NSCs) aus mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen zu isolieren und zu reaktivieren Telomerase-Aktivität in NSCs in vitro Verfahren. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Reaktivierung der Telomerase kann die Selbsterneuerungsfähigkeit und Neurogenese in vitro zu verbessern. Schließlich beschreibt das Protokoll der Modalitäten für die Durchführung der Telomere FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) auf beiden Maus FFPE (Formalin fixiert und Paraffin Embedded) Hirngewebe und Metaphasechromosomen von kultivierten Zellen.

Die Strategien murine mTERT-ER zu erzeugen und LSL-mTERT-Knock-in-Allele wurden in 1A und 1B beschrieben. Insbesondere wird ein LoxP - Dreifach Stopper - Neo - LoxP Fragment wurde zwischen Exon 1 und 2 von mTERT Locus eingefügt, um LSL-mTERT Allel zu generieren. Um mTERT-ER-Allel zu erzeugen, wurde ERT2-LBD-Domäne im Leseraster mit dem mTERT-Gen in den N-Terminus des Exons 1 eingeführt Wir haben gezeigt, dass, wenn die Telomerase wurde transient in Telomerdysfunktion Mäusen durch Behandlung mit 4-OHT-Pellets für 4 reaktiviert Wochen konnten die degenerative Phänotyp in mehreren Organen, wie Gehirn (2A) und Hoden (2B) gelindert werden. Um die Auswirkungen der Telomerase Reaktivierung auf Zellen in vitro kultiviert bestimmen isolierten wir neurale Stammzellen (NSC) von Ende Generation G4 LSL-mTERT und G4 mTERT-ER Mäusen. Wir haben gezeigt, dass, wenn die Telomerase wurde in Telomer dysfunktionalen NSC reaktiviert wurde das Selbsterneuerungsfähigkeit des NSC stark erhöht (Figur 3A) und in vitro-Neurogenese wurde ebenfalls signifikant verbessert (Abbildung 3B). Um die Wirkung der Telomerase Reaktivierung auf die Tumorgenese im Rahmen Telomerdysfunktion bestimmen erwirtschafteten wir PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (Prostata-Tumor-Modell) und Geldautomaten - / - mTERT ER / ER (Thymus-T-Zell-Lymphom-Modell) späten Generation Kohorten. Wenn die Telomerase wurde durch Tamoxifen-Behandlung dieser Mäuse mit Injektion (Figur 4A) oder 4-OHT-Pellets für 8 Wochen (4B) reaktiviert wurde die Tumorgenese stark sowohl in Prostata-Tumormodell (4A) und Thymus-T-Zellen-Lymphom-Modell verbessert ( <strong&gt; 4B). Schließlich berichteten wir, die Protokolle zur Durchführung der Telomere FISH auf FFPE Maus Hirngewebe (Abbildung 5) und Metaphasechromosomen (Abbildung 5, Einschub). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Abbildung 1: (A) mTERT-ER Knock-in-Strategie. TV, Targeting-Vektor; WT, Wildtyp-Allel; KI, Knock-in-Allel; LA, linken Arm; RA, den rechten Arm; E1, Exon 1; E2, Exon 2; neo, pgk Promotor getriebene Neomycin-Resistenzgen; ER, modifizierten Östrogenrezeptor (ERT2) Ligandenbindungsdomäne; DT, dyphteria Toxin-Gen. (B) LSL-mTERT Knock-in-Strategie. TV, Targeting-Vektor; WT, Wildtyp-Allel; KI, Knock-in-Allel; LA, linken Arm; RA, den rechten Arm; E1, Exon 1; E2, Exon 2; neo, pgk Promotor getriebene Neomycin-Resistenzgen; STOPPER, drei sich wiederholenden Transkriptionsstoppsequenzen; DT, dyphteria Toxin-Gen. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen bessert degenerative Phänotypen von Organen Vertreter Bilder von Gehirnen (links). und Hoden (rechts) von G0 und G4 mTERT-ER-Mäusen mit Placebo oder 4-OHT für 4 Wochen behandelt. Maßstabsbalken zeigen 50 um. Re-Print mit Genehmigung von 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Abb. 3: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen, steigert Selbsterneuerung und Neurogenese von neuralen Stammzellen in vitro (A) Repräsentative Bilder von neuronalen Stammzellens von G4 LSL-mTERT isoliert (oberes Bild) und G4 mTERT-ER (unteres Bild) wächst in der Stammzellmedium mit Fahrzeug oder 4-OHT behandelt. (B) Repräsentative Bilder der in vitro-Neurogenese (TuJ1 +) von neuronalen Stammzellen aus G4 mTERT-ER in Differenzierungsmedium kultiviert isoliert (mit 1% FBS) mit Fahrzeug-oder 4-OHT behandelt. Maßstabsbalken zeigen 100 um. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Abb. 4: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen verbessert Tumorentstehung vor dem Hintergrund der genomische Instabilität (A) Repräsentative Bilder von Prostatatumoren von G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT seziert +/-, G4 PB Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / - Und G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L mit Tamoxifen behandelt. Re-Print mit Genehmigung von 22. (B) Repräsentative Bilder der Thymus-T-Zell-Lymphome aus G0 Atm seziert - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER mit Vehikel und G4 Atm - / - mTERT ER / ER mit 4- behandelt 8 Wochen OHT. Maßstabsbalken zeigen 1 cm. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Abbildung 5: Repräsentative Bilder der Telomer und Zentromer-FISH auf FFPE Maus Hirngewebe und Metaphase (kleines Bild). Rot bedeutet, DNA, grün zeigt Telomer-Färbung und Cyan zeigt centromere Färbung. Maßstabsbalken zeigen 1 mm.

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Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

utilizing-murine-inducible-telomerase-alleles-studies-tissue

Research

JoVE Journal

Medicine

9.9K Aufrufe.  UT MD Anderson Cancer Center. Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer. 

Serie: Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize their blood glucose levels, islet transplantation has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes 1,2. More recently, advances in human islet transplantation have further strengthened this view 1,3. However, two major limitations prevent islet transplantation from being a widespread clinical reality: (a) the requirement for large numbers of islets per patient, which severely reduces the number of potential recipients, and (b) the need for heavy immunosuppression, which significantly affects the pediatric population of patients due to their vulnerability to long-term immunosuppression. Strategies that can overcome these limitations have the potential to enhance the therapeutic utility of islet transplantation.
Islet transplantation under the mouse kidney capsule is a widely accepted model to investigate various strategies to improve islet transplantation. This experiment requires the isolation of high quality islets and implantation of islets to the diabetic recipients. Both procedures require surgical steps that can be better demonstrated by video than by text. Here, we document the detailed steps for these procedures by both video and written protocol. We also briefly discuss different transplantation models: syngeneic, allogeneic, syngeneic autoimmune, and allogeneic autoimmune.

Transplantation of isolated islets has been proposed to be a potential treatment for type 1 diabetes. Here we describe a method to isolate islets from mouse pancreata and transplant them to the subcapsular space of the kidney.

Eine Methode zur Murine Islet Isolation und subkapsulären Nierentransplantation

Since the early pioneering work of Ballinger and Reckard demonstrating that transplantation of islets of Langerhans into diabetic rodents could normalize ...

Forschung

Medizin

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Einem orthotopen Modell des Murine Blasenkrebs

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

Immunohistochemical Staining of B7-H1 (PD-L1) on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1/PD-L1, a member of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important role in the negative regulation of cell-mediated immune responses through its interaction with its receptor, programmed death-1 (PD-1) 1,2. Overexpression of B7-H1 by tumor cells has been noted in a number of human cancers, including melanoma, glioblastoma, and carcinomas of the lung, breast, colon, ovary, and renal cells, and has been shown to impair anti-tumor T-cell immunity3-8.
Recently, B7-H1 expression by pancreatic adenocarcinoma tissues has been identified as a potential prognostic marker9,10. Additionally, blockade of B7-H1 in a mouse model of pancreatic cancer has been shown to produce an anti-tumor response11. These data suggest the importance of B7-H1 as a potential therapeutic target. Anti-B7-H1 blockade antibodies are therefore being tested in clinical trials for multiple human solid tumors including melanoma and cancers of lung, colon, kidney, stomach and pancreas12.
In order to eventually be able to identify the patients who will benefit from B7-H1 targeting therapies, it is critical to investigate the correlation between expression and localization of B7-H1 and patient response to treatment with B7-H1 blockade antibodies. Examining the expression of B7-H1 in human pancreatic adenocarcinoma tissues through immunohistochemistry will give a better understanding of how this co-inhibitory signaling molecule contributes to the suppression of antitumor immunity in the tumor's microenvironment. The anti-B7-H1 monoclonal antibody (clone 5H1) developed by Chen and coworkers has been shown to produce reliable staining results in cryosections of multiple types of human neoplastic tissues4,8, but staining on paraffin-embedded slides had been a challenge until recently13-18. We have developed the B7-H1 staining protocol for paraffin-embedded slides of pancreatic adenocarcinoma tissues. The B7-H1 staining protocol described here produces consistent membranous and cytoplasmic staining of B7-H1 with little background.

Immunohistochemical Staining of B7-H1 PD-L1 on Paraffin-embedded Slides of Pancreatic Adenocarcinoma Tissue

B7-H1 (PD-L1) and its binding to PD-1 provide a major tumor-induced immunosuppressive signal in the tumor&#x2019;s microenvironment. An immunohistochemical staining technique to characterize the expression and localization of B7-H1 in pancreatic adenocarcinoma is described here.

Immunhistochemische Färbung von B7-H1 (PD-L1) auf Paraffin-embedded Slides der Pankreaskarzinom Tissue

B7-H1/PD-L1, a member  of the B7 family of immune-regulatory cell-surface proteins, plays an important  role in the negative regulation of cell-mediated ...

A Preclinical Murine Model of Hepatic Metastases

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, murine pancreatic tumor model of hepatic metastases via a hemispleen injection of syngeneic murine pancreatic tumor cells is described. This model mimics many of the clinical conditions in patients with metastatic disease to the liver. Mice consistently develop metastases in the liver allowing for investigation of the metastatic process, experimental therapy testing, and tumor immunology research.

A preclinical, murine model of hepatic metastases performed via a hemispleen injection technique.

Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Numerous murine models have been developed to study human cancers and advance the understanding of cancer treatment and development. Here, a preclinical, ...

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

An In Vitro Dormancy Model of Estrogen-sensitive Breast Cancer in the Bone Marrow: A Tool for Molecular Mechanism Studies and Hypothesis Generation

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant ...

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible animal models mirror common components of human disease, including the bm12 transfer model. Upon transfer of bm12 splenocytes or purified CD4 T cells, C57BL/6 mice rapidly develop large frequencies of T follicular helper cells (Tfh), germinal center (GC) B cells, and plasma cells followed by high levels of circulating anti-nuclear antibodies. Since this model utilizes mice on a pure C57BL/6 background, researchers can quickly and easily study disease progression in transgenic or knockout mouse strains in a relatively short period of time. Here we describe protocols for the induction of the model and the quantitation Tfh, GC B cells, and plasma cells by multi-color flow cytometry. Importantly, these protocols can also be used to characterize disease in most mouse models of SLE and identify Tfh, GC B cells, and plasma cells in other disease models.

The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus SLE in C57BL/6 Mice

The transfer of bm12 lymphocytes into a C57BL/6 recipient is an established model of systemic lupus erythematosus. Here we describe how to initiate disease using this model and how to characterize T follicular helper cells, germinal center B cells and plasma cells by flow cytometry.

Das BM12 Inducible Modell des systemischen Lupus erythematodes (SLE) in C57BL / 6-Mäuse

Systemic lupus erythematosus (SLE) is an autoimmune disease with diverse clinical and immunological manifestations. Several spontaneous and inducible ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Präklinische Orthotopische Mausmodell der menschlichen Prostata-Krebs

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Analyzing Beneficial Effects of Nutritional Supplements on Intestinal Epithelial Barrier Functions During Experimental Colitis

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause severe problems, such as abdominal cramping, bloody diarrhea, and weight loss, in affected individuals. Unfortunately, there is no cure yet, and treatments only aim to alleviate symptoms. Current treatments include anti-inflammatory and immunosuppressive drugs that may cause severe side effects. This warrants the search for alternative treatment options, such as nutritional supplements, that do not cause side effects. Before their application in clinical studies, such compounds must be rigorously tested for effectiveness and security in animal models. A reliable experimental model is the dextran sulfate sodium (DSS) colitis model in mice, which reproduces many of the clinical signs of ulcerative colitis in humans. We recently applied this model to test the beneficial effects of a nutritional supplement containing vitamins C and E, L-arginine, and &#969;3-polyunsaturated fatty acids (PUFA). We analyzed various disease parameters and found that this supplement was able to ameliorate edema formation, tissue damage, leukocyte infiltration, oxidative stress, and the production of pro-inflammatory cytokines, leading to an overall improvement in the disease activity index. In this article, we explain in detail the correct application of nutritional supplements using the DSS colitis model in C57Bl/6 mice, as well as how disease parameters such as histology, oxidative stress, and inflammation are assessed. Analyzing the beneficial effects of different diet supplements may then eventually open new avenues for the development of alternative treatment strategies that alleviate IBD symptoms and/or that prolong the phases of remission without causing severe side effects.

Current treatments of inflammatory bowel diseases (IBD) aim at alleviating disease symptoms but may cause severe side effects. Thus, alternative strategies are being investigated in animal colitis models. Here, we explain how the beneficial effects of diet supplements on clinical IBD signs are analyzed in such a colitis model.

Analyse wohltuende Wirkung von Nahrungsergänzungsmitteln auf Darmepithel Barrierefunktionen Während Experimental ulcerosa

Inflammatory bowel diseases (IBD), including Crohn&#39;s disease and ulcerative colitis, are chronic relapsing disorders of the intestines. They cause ...

Generating a Murine Orthotopic Metastatic Breast Cancer Model and Performing Murine Radical Mastectomy

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority of the practical and technical details are commonly omitted in published manuscripts which, therefore, makes it challenging to reproduce the models, particularly when it involves surgical techniques. Bioluminescence technology allows for the evaluation of small amounts of cancer cells even when a tumor is not palpable. Utilizing luciferase-expressing cancer cells, we establish a breast cancer orthotopic inoculation technique with a high tumorigenesis rate. Lung metastasis is assessed utilizing an ex vivo technique. We, then, establish a mastectomy model with a low local recurrence rate to assess the metastatic tumor burden. Herein, we describe, in detail, the surgical techniques of orthotopic implantation and mastectomy for breast cancer with a high tumorigenesis rate and low local recurrence rates, respectively, to improve breast cancer model efficiency.

We introduce a murine orthotopic breast cancer model and radical mastectomy model with bioluminescence technology to quantify the tumor burden to mimic human breast cancer progression.

Generieren eines murinen orthotopen metastasierendem Brustkrebs Krebs Modells und Durchführung von murinen radikale Mastektomie

In vivo mouse models to assess breast cancer progression are essential for cancer research, including preclinical drug developments. However, the majority ...

Immunofluorescence Labelling of Human and Murine Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They mature in the bone marrow and are released into the peripheral blood, where they circulate for about 6&#8722;8 h; however, in tissue, they can survive for days. By diapedesis through the endothelium, they leave the blood stream, enter tissues, and migrate towards the site of an infection following chemotactic gradients.&#160;Neutrophils can combat invading microorganisms by phagocytosis,&#160;degranulation, and generation of neutrophil extracellular traps (NETs). This protocol will help to detect NETs in paraffin-embedded tissue. NETs are the result of a process called NETosis, which leads to the release of nuclear, granular, and cytoplasmic components either from living (vital NETosis) or dying (suicidal NETosis) neutrophils. In vitro, NETs form cloud-like structures, which occupy a space several times larger than that of the cells from which they descended. The backbone of NETs is chromatin, to which a selection of proteins and peptides originating from granules and cytoplasm are bound. Thereby, a high local concentration of toxic compounds is maintained so that NETs can capture and inactivate a variety of pathogens including bacteria, fungi, viruses, and parasites, while diffusion of the highly active NET components leading to damage in neighboring tissue is limited. Nevertheless, in recent years it has become apparent that NETs, if generated in abundance or cleared insufficiently, do have pathological potential ranging from autoimmune diseases to cancer. Thus, detection of NETs in tissue samples may have diagnostic significance, and the detection of NETs in diseased tissue can influence the treatment of patients. Since paraffin-embedded tissue samples are the standard specimen used for pathological analysis, it was sought to establish a protocol for fluorescent staining of NET components in paraffin-embedded tissue using commercially available antibodies.

Neutrophil extracellular traps (NETs) are three-dimensional structures generated by stimulated neutrophil granulocytes. It has become clear in recent years that NETs are involved in a wide variety of diseases. Detection of NETs in tissue may have diagnostic relevance, so standardized protocols for labelling NET components are required.

Immunfluoreszenz-Kennzeichnung von humanen und murinen neutrophilen extrazellulären Fallen in Paraffin-Embedded Tissue

Neutrophil granulocytes, also called polymorphonuclear leukocytes (PMN) due to their lobulated nucleus, are the most abundant type of leukocytes. They ...